Methodenartikel

Induzieren und Charakterisieren der vesikulären Steatose in differenzierten HepaRG-Zellen

DOI:

10.3791/59843

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18. Juli 2019

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1Department of Molecular Medicine, Sapienza University, 2Department of Internal Medicine - DMISM, Sapienza University, 3Center for Life Nano Science@Sapienza, Istituto Italiano di Tecnologia, 4Pasteur Institute Italy-Fondazione Cenci Bolognetti, 5INSERM U1052-Cancer Research Center of Lyon, 6Department of Hepatology, Croix Rousse Hospital, Hospices Civils de Lyon

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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In dieser Studie beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Induktion von Lebervesikulärsteatose in differenzierten HepaRG-Zellen mit dem Fettsäuresalz Natriumoleat und verwenden Methoden zum Nachweis und zur Quantifizierung der Lipidakkumulation, einschließlich kohärenter Anti-Stokes Raman-Streuung (CARS) Mikroskopie, zytofluorimetrische Analyse, Ölrot O-Färbung und qPCR.

Zusammenfassung

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Hepatische Steatose stellt eine metabolische Dysfunktion dar, die aus einer Anhäufung von Triglycerid-haltigen Lipidtröpfchen in Hepatozyten resultiert. Übermäßige Fettansammlung führt zu einer nicht-alkoholischen Fettlebererkrankung (NAFLD), die potenziell reversibel ist und sich zu alkoholfreier Steatohepatitis (NASH) und schließlich zu Zirrhose und hepatozellulärem Karzinom (HCC) entwickeln kann. Die molekularen Mechanismen, die die Fettakkumulation in Hepatozyten mit dem Fortschreiten zu NASH, irreversibleleber Leberschäden, Fibrose, Zirrhose und sogar HCC verbinden, sind noch unklar. Zu diesem Zweck wurden mehrere In-vitro- und In-vivo-Modelle entwickelt, um die pathologischen Prozesse aufzuklären, die NAFLD verursachen. In der vorliegenden Studie beschreiben wir ein zelluläres Modell für die Induktion der vesikulären Steatose der Leber, das aus DMSO-differenzierten menschlichen Hepatic-HepaRG-Zellen besteht, die mit dem Fettsäuresalz Natriumoleat behandelt werden. Tatsächlich akkumulieren Natriumoleat-behandelte HepaRG-Zellen Lipidtröpfchen im Zytoplasma und zeigen typische Merkmale der Steatose. Dieses in vitro humane Modell stellt eine wertvolle Alternative zu in vivo-Mäusemodellen sowie zu den primären menschlichen Hepatozyten dar. Wir präsentieren auch einen Vergleich mehrerer Methoden zur Quantifizierung und Bewertung der Fettansammlung in HepaRG-Zellen, einschließlich Oil Red O Färbung, zytofluorimetrische Rbodipy-Messung, metabolische Genexpressionsanalyse durch qPCR und kohärente Anti-Stokes Raman-Streumikroskopie (CARS). CARS Imaging kombiniert die chemische Spezifität der Raman-Spektroskopie, einer in materialwissenschaftlichen Anwendungen bekannten chemischen Analysetechnik, mit den Vorteilen von hochschnellen, hochauflösenden nichtlinearen optischen Mikrokopien, um präzise Quantifizierung der Lipidakkumulation und Lipidtröpfchendynamik. Die Erstellung eines effizienten In-vitro-Modells für die Induktion der vesikulären Steatose, zusammen mit einer genauen Methode zur Quantifizierung und Charakterisierung der Lipidakkumulation, könnte zur Entwicklung einer Frühstadiumdiagnose von NAFLD über die Identifizierung molekularer Marker und die Generierung neuer Behandlungsstrategien.

Einleitung

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Lebersteatose ist definiert als intrahepatische Fettansammlung, innerhalb triglyceridhaltiger Lipidtröpfchen, von mindestens 5% des Lebergewichts. Längere Leberlipidspeicherung ist ein potenziell reversibler Prozess, jedoch kann es zu Leberstoffwechselfunktionsstörungen, Entzündungen und fortgeschritteneformen Formen der nichtalkoholischen Fettleber (NAFLD), die vorherrschende Ursache der chronischen Lebererkrankung in vielen Teilen der die Welt1,2. NAFLD ist eine multifaktorielle Erkrankung, die sich zu der aggressiveren alkoholfreien Steatohepatitis (NASH) entwickeln kann, die wiederum zu Zirrhose und in einem kleinen Prozentsatz der Patienten zu einem hepatozellulären Karzinom (HCC)1,3weiterführen kann. Derzeit gibt es keine zugelassene Therapie als spezifische Behandlung für NAFLD und die Kombination von Ernährungs- und Lebensstiländerungen bleibt die Säule des NAFLD- und NASH-Managements4,5,6.

Die molekularen Mechanismen, die zur Entwicklung der Lebersteatose bei der Pathogenese von NAFLD führen, müssen noch aufgeklärt werden7. In diesem Zusammenhang wurden Mausmodelle entwickelt, um das Fortschreiten der humanen Steatose-Krankheit zu untersuchen. Es gibt eine Vielzahl unterschiedlicher Modelle, und jedes hat seine Vor- und Nachteile, einschließlich genetischer, ernährungsphysiologischer und chemisch induzierter Modelle, die verschiedene Ansätze kombinieren. Genetisch veränderte (transgene oder Knockout) Mäuse entwickeln spontan Lebererkrankungen. Es sollte jedoch beachtet werden, dass diese Mutationen beim Menschen sehr selten sind und die Deletion oder Überexpression eines einzelnen Gens (z. B. ob/ob mouse) die Ätiologie der multifaktoriellen menschlichen Krankheit auf molekularer Ebene8,9nicht imitieren darf. Ebenso kann die Krankheit, die von Mäusen nach diätetische oder pharmakologische Manipulation erworben wird, nicht die Auswirkungen der menschlichen Ernährung imitieren, die mit der Entwicklung von NAFLD beim Menschen8verbunden ist. Tiermodelle haben jedoch Entwicklungen im Verständnis von NAFLD erleichtert, und dieser Ansatz ist derzeit die am häufigsten verwendete Strategie in der Laborforschung. Dennoch ist die Replikation der in Tiermodellen erzielten Ergebnisse beim Menschen wiederholt fehlgeschlagen, was zu einer schlechten Übersetzung in die Klinik10geführt hat.

Daher können In-vitro-Modelle von NAFLD eine grundlegende Rolle bei der Aufklärung der molekularen Mechanismen der NAFLD-Progression spielen, und sie stellen ein wertvolles Werkzeug dar, um eine große Anzahl von Verbindungen zu untersuchen. Primäre Zellkulturen, verewigte Zelllinien und Leberbiopsien wurden ausgiebig für Forschungszwecke verwendet11. Primäre menschliche Hepatozyten ähneln den klinischen Erkrankungen des Menschen, aber es gibt eine begrenzte Anzahl von Spendern, und primäre Zellkulturen zeigen aufgrund der Variabilität der Zellen eine schlechte Reproduzierbarkeit. Diese Beobachtungen, zusammen mit ethischen und logistischen Fragen, haben dazu geführt, dass die Verwendung von menschlichen primären Hepatozyten begrenzt wurde12. So stellen Leberzelllinien eine bequeme Alternative dar, die mehrere wesentliche Vorteile gegenüber der Primärkultur hat, da Leberzelllinien stetig wachsen, eine nahezu unbegrenzte Lebensdauer haben und einen stabilen Phänotyp haben. Darüber hinaus sind Zelllinien leicht zugänglich und die Kulturbedingungen von Leberzelllinien sind einfacher als die von primären Hepatozyten und sind zwischen verschiedenen Laboratorien standardisiert.

Hier beschreiben wir detailliert ein in vitro zellbasiertes Modell der vesikulären Lebersteatose, dargestellt durch hepatische differenzierte HepaRG-Zellen, die mit dem Fettsäure-Natriumoleat behandelt werden. Die HepaRG-Zelllinie wurde von einer weiblichen Patientin, die von einer Hepatitis-C-Infektion betroffen ist, und einem Edmondson-Grad-I-Gut differenzierten Lebertumor14festgestellt. Die HepaRG-Zelllinie ist eine menschliche bipotente Vorläuferzelllinie, die in der Lage ist, bei Exposition gegenüber 2% Dimethylsulfoxid (DMSO) zu zwei verschiedenen Zellphänotypen zu differenzieren: Gallen- und Hepatozyten-ähnliche Zellen. Differenzierte HepaRG-Zellen (dHepaRG) teilen einige Merkmale und Eigenschaften mit erwachsenen Hepatozyten und besitzen die Fähigkeit, leberspezifische Gene wie Albumin, AldolaseB, Cytochrom P450 2E1 (CYP2E1) und Cytochrom P450 3A4 (CYP3A4) stabil auszudrücken13 (Schritt 3). Die Behandlung von dHepaRG-Zellen mit dem Fettsäuresalz Natriumoleat (250 M) für 5 Tage führt zur Erzeugung von zytoplasmatischen Lipidtröpfchen, die die Auswirkungen der Fettleber14,15,17,18 ( Schritt 4). Die Anhäufung von Lipidtröpfchen kann leicht durch Oil Red O Färbung (Schritt 5) erkannt werden, einem Lysochrom-Fett-löslichen Farbstoff, der neutrale Triglyceride und Lipide rot-orange färbt. Zur effizienten Quantifizierung von Lipiden in fetthaltigem dHepaRG illustrieren wir hier die zytofluorimetrische Analyse nach der Färbung mit 4,4-Difluor-1,3,5,7-Tetramethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen (Bodipy 505/515) (Schritt 6), einer lipophilen fluoreszierenden Sonde, die intrazellulären Lipidkörpern und wurde zur Kennzeichnung von Lipidtröpfchen19verwendet. Darüber hinaus zeigen wir hier, wie die Steatose durch quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) (Schritt 7) Genexpression Deregulierung mehrerer metabolischer Gene in dHepaRG-Zellen zu bewerten. Um die Ansammlung von Lipidtröpfchen nach der Natriumoleatbehandlung weiter zu charakterisieren und zu quantifizieren, führten wir eine kohärente Anti-Stokes Raman Streumikroskopie (CARS) (Schritt 8) durch, eine innovative Technik, die die Visualisierung und Quantifizierung von Lipidtröpfchen ohne Kennzeichnung20,21.

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Protokoll

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1. Herstellung von Kulturmedien und Reagenzien

  1. Vermehrungsmedium: Ergänzen Sie Williams E-Medium mit GlutaMAX, 10% fetalem Rinderserum (FBS), 1% Penicillin/Streptomycin, 5 g/ml Insulin und 0,5 m Hydrocortison-Hemisuccinat.
  2. Differenzierungsmedium: Ergänzung des E-Mediums von William mit GlutaMAX, 10% FBS, 1% Penicillin/Streptomycin, 5 g/ml Insulin, 50 M Hydrocortisonhemisuccinat und 2% DMSO.
  3. Gefriermedium: Ergänzung vermehrendes Medium mit 10% DMSO.
  4. Natriumoleat: in 99% Methanol in einer Konzentration von 100 mM auflösen, O/N umrühren und bei -20 °C lagern.
  5. Oil Red O: Bereiten Sie eine Lagerlösung vor. Wiegen Sie 0,35 g Öl Rot O und lösen Sie es in 100 ml Isopropanol auf. O/N, Filter (0,2 m) umrühren und bei RT lagern. Bereiten Sie eine Arbeitslösung vor: Mischen Sie 6 ml Öl Red O Stock Lösung mit 4 ml ddH2O. Lassen Sie bei Raumtemperatur (RT) für 20 min sitzen, und dann mit einem 0,2 m Filter filtern. Richtige Filtration ist sehr empfehlenswert für eine erfolgreiche Färbung, um Hintergrund zu vermeiden.
  6. Bodipy (505/515): Bodipy (505/515) Farbstoff in DMSO bei einer Lagerkonzentration von 100 m auflösen, bei -20 °C im Dunkeln lagern und bei einer endletzten Konzentration von 100 nM verwenden.
  7. Erwerben Sie transparente Glasböden für CARS-Experimente.

2. Auftauen, Amplifikation und Kryokonservierung von HepaRG-Zellen

  1. Stickstoff kryokonservierte HepaRG-Zellen auftauen, indem Sie eine Charge in ein 37 °C-Bad eintauchen, bis sie aufgetaut ist. Wählen Sie eine Charge mit niedriger Durchgang (<20). HepaRG-Zellen sind im Handel erhältlich.
  2. Übertragen Sie die Zellen schnell in ein 15 ml-Rohr mit 10 ml Prolifer-Medium und Zentrifuge für 5 min (200 x g, 4 °C).
  3. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen mit 5 ml proliferierendem Medium wieder auf.
  4. Zählen Sie die Zellen und verdünnen Sie, um 2,5 x 104 Zellen/cm2zu verplatten.
  5. Erneuern Sie das Medium alle 2 oder 3 Tage. Zellen vermehren sich mit einer Verdoppelungszeit von etwa 24 h.
  6. Trennen Sie HepaRG-Zellen bei 80% Konfluenz durch 3-5 min Inkubation mit Trypsin-Lösung 0,05%. Sammeln Sie die Zellen in proliferierenden Medium und Zentrifuge für 5 min (200 x g, 4 °C).
  7. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen mit 5 ml proliferierendem Medium wieder auf.
  8. Zählen Sie die Zellen und verdünnen Sie, um 2,5 x 104 Zellen/cm2zu verplatten.
  9. In diesem Stadium verstärken Sie die Zellen durch Wiederholung der Schritte 2.5-2.8, um eine angemessene Anzahl von Zellen zu erreichen, um Experimente zu starten, oder Kryokonserven wie in Schritt 2.10.
  10. Um HepaRG-Zellen zu kryoservieren, lösen Sie die Zellen 24 h nach der Beschichtung durch 3-5 min Inkubation mit Trypsin-Lösung 0,05%. Sammeln Sie die Zellen in proliferierenden Medium und Zentrifuge für 5 min (200 x g, 4 °C). Entsorgen Sie den Überstand, setzen Sie die Zellen in 1 ml/Charge Gefriermedium, 1,5 x 106 Zellen/Charge wieder auf und kryoservieren Sie die Chargen in flüssigem Stickstoff.

3. Differenzierung von HepaRG-Zellen (Tag 0–21) (Abbildung 1A)

  1. Tag 0. Samen HepaRG-Zellen mit geringer Dichte (2,5 x 104 Zellen/cm2) in kulturbehandelte Gerichte mit entsprechendem Proliferationsvolumen (Abbildung1B). Für jeden Assay müssen zwei Gerichte plattiert werden (Oil Red O Staining, FACS Analysis, qPCR): eines für Kontrollzellen und eines für oleatbehandelte Zellen. Wenn Sie CARS-Messungen durchführen (Schritt 8), säen Sie die Zellen parallel in transparente Glasbodenschalen. Als Kontrolle, Ernten Sie eine unbehandelte Schale (vermehrende Zellen Tag 0), um Genexpressionsanalyse von Differenzierungmarkergenen durchzuführen (siehe Schritt 3.6).
  2. Tag 2 und Tag 4. Ändern Sie das Medium mit dem entsprechenden Volumen des Proliferationsmediums und lassen Sie die Zellen bis zum Zusammenfluss wachsen.
  3. Tag 7. Die Zellen müssen 100 % konfluent sein (Abbildung 1C). Waschen Sie die Zellen einmal mit 1x Phosphat-gepufferter Saline (PBS). Entfernen Sie 1x PBS und fügen Sie ein entsprechendes Volumen des Differenzierungsmediums hinzu.
  4. Tag 8, 9, 12, 15, 18.  Waschen Sie die Zellen einmal mit 1x PBS. Entfernen Sie 1x PBS und fügen Sie ein entsprechendes Volumen des Differenzierungsmediums hinzu.
  5. Tag 21. Beobachten Sie HepaRG-Zellen unter dem Mikroskop und stellen Sie sicher, dass die Zellen konfluente differenzierte Kulturen sind (Abbildung 1D).
  6. Als Kontrolle, Ernten Sie eine Kontrollschale (differenzierte Zellen Tag 21), um Genexpressionsanalyse (Schritt 7) von Differenzierungmarkergenen durchzuführen (Abbildung 1E).
  7. An Tag 21 können differenzierte HepaRG-Zellen in Flüssigstickstoff kryokonserviert werden.

4. Induktion der Vesicularsteatose (Tag 21–26)

  1. Tag 21. Natriumoleat (100 mM) mit einem entsprechenden Volumen vollständiger Differenzierungsmedium auf eine Endkonzentration von 250 m (1:400) verdünnen. Fügen Sie 99% Methanol 1:400 (gleiches Volumen wie Natriumoleat) in ein anderes Aliquot von Differenzierungsmedium, um die Fahrzeug-Kontroll-Behandlung zu machen. (Zum Beispiel: 25 l Natriumoleat zu 10 ml Medium hinzufügen und parallel dazu 25 l 99% Methanol zu 10 ml Medium hinzufügen). Waschen Sie die Zellen einmal mit 1x PBS und fügen Sie Fahrzeug oder Natriumoleat Medium.
  2. Tag 23 und Tag 25. Ändern Sie das Medium mit dem entsprechenden Volumen des frisch zubereiteten Mediums wie in Schritt 4.1.
  3. Tag 26. Beobachten Sie durch ein optisches Mikroskop, dass sich Lipidtröpfchen in den mit Natriumoleat behandelten Zellen ansammeln und als transluzente Tröpfchen im Zytoplasma leicht sichtbar sind, wie in Abbildung 2A.

5. Bewertung der Lipid-Überlastung und Steatose-Induktion: Öl Rot O Färbung

  1. Waschen Sie die Zellen einmal mit 1x PBS und entfernen Sie 1x PBS vollständig.
  2. 4% Paraformaldehyd hinzufügen (in 1x PBS verdünnt) und 15 min bei RT brüten.
    ACHTUNG: Paraformaldehyd ist giftig, daher muss dieser Schritt in einer Dunstabzugshaube mit Schutzausrüstung, einschließlich Handschuhen, laborierter Kleidung und einer Maske durchgeführt werden.
  3. Entfernen Sie Paraformaldehyd und waschen Sie die Zellen zweimal mit 1x PBS. Die Zellen können in 1x PBS bei 4 °C für ein paar Tage vor der Färbung aufbewahrt werden. Mit Parafilm umwickeln und mit Aluminiumfolie abdecken, um das Trocknen der Zellen zu verhindern.
  4. Entfernen Sie 1x PBS. Inkubieren Sie die Zellen mit 60% Isopropanol für 5 min bei RT.
  5. Entfernen Sie Isopropanol und lassen Sie die Zellen bei RT vollständig trocknen.
  6. Öl rot O Arbeitslösung hinzufügen und bei RT 30 min brüten. Das für jede Probe erforderliche Arbeitsvolumen entspricht dem Medienvolumen, das für die Zellkultivierung verwendet wird.
  7. Entfernen Sie Oil Red O Lösung und fügen Sie sofort ddH2O. Waschen Sie die Zellen 4 mal mit ddH2O.
  8. Bilder unter dem Mikroskop für die Analyse erfassen (Abbildung 2B).
  9. Um Öl Rot O Farbstoff zu elute: entfernen Sie das gesamte Wasser und lassen Sie zu trocknen; 1 ml 100% Isopropanol hinzufügen und 10 min mit sanftem Schütteln bei RT brüten.
  10. Pipet das Isopropanol mit eluiertem Öl Red O Farbstoff auf und ab mehrmals, um sicherzustellen, dass das gesamte Öl Rot O in der Lösung ist. Übertragen Sie die Lösung auf eine Küvette. Messen Sie OD500 nm durch Spektrophotometrie und verwenden Sie 100% Isopropanol als leer (Abbildung 2C).

6. Bewertung der Lipidüberlastung und Steatose-Induktion: Bodipy Staining und Cytofluorimetric Analysis

  1. Waschen Sie die Zellen einmal mit 1x PBS. Inkubieren Sie mit 100 nM Bodipy in 1x PBS im Dunkeln für 40 min bei 37 °C. Eine unbefleckte Steuerung sollte in die Durchflusszytometriemessungen einbezogen werden. Schützen Sie die Proben von diesem Punkt aus so weit wie möglich vor Licht.
    HINWEIS: Das für jede Probe benötigte Volumen der Färbelösung entspricht dem Volumen der Medien, die für die Zellkultivierung verwendet werden.
  2. Entfernen Sie die Färbelösung und waschen Sie die Zellen einmal mit 1x PBS. Fahren Sie mit den Schritten 6.3-6.6 fort. für die FACS-Analyse (Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung) oder für Schritt 6.7 für die Mikroskop-Bildgebung.
  3. Kratzen Sie die Zellen vorsichtig mit 1x PBS und übertragen Sie sie in ein 15 ml Rohr. Zentrifuge für 10 min (200 x g, 4 °C).
  4. Entfernen Sie die Überräube vorsichtig, ohne die Pellets zu stören und waschen Sie sie mit 3 ml 1x PBS. Zentrifuge für 5 min (200 x g, 4 °C).
  5. Entfernen Sie die Überräube und suspendieren Sie in 300 l 1x PBS, und übertragen Sie sie dann in ein FACS-Rohr.
  6. Messen Sie sofort die Bodipy-Fluoreszenzintensität durch zytofluorimetrische Analyse mit Anregungs-/Emissionswellenlängen von 505/515 nm (Abbildung 3A,B).
  7. Waschen Sie die Zellen einmal mit 1x PBS und entfernen Sie PBS vollständig.
  8. 4% Paraformaldehyd hinzufügen (in 1x PBS verdünnt) und 15 min bei RT brüten.
    ACHTUNG: Paraformaldehyd ist giftig, daher muss dieser Schritt in einer Dunstabzugshaube mit Schutzausrüstung, einschließlich Handschuhen, laborierter Kleidung und einer Maske durchgeführt werden.
  9. Entfernen Sie Paraformaldehyd und waschen Sie die Proben 3x für 5 min in PBS. Zellen können in 1x PBS bei 4 °C gehalten oder sofort abgebildet werden (Abbildung 3C). Zur Lagerung mit Parafilm umwickeln und mit Aluminiumfolie abdecken, um das Trocknen der Zellen zu verhindern.

7. Bewertung der Lipidüberlastung und Steatose-Induktion: qPCR

  1. Waschen Sie die Zellen einmal mit 1x PBS. Zerkleinern Sie die Zellen mit 1x PBS, Zentrifuge bei 200 x g, und entsorgen Sie den Überstand. In diesem Schritt können Zellen bei -80 °C geerntet oder wie in Schritt 7.2 verarbeitet werden.
  2. Führen Sie die gesamte RNA-Isolierung mit Standardmethoden mit kommerziellen Reagenzien nach den Anweisungen des Herstellers durch.
  3. Bewerten Sie die RNA-Konzentration durch UV-spektrophotometrische Messung, um sicherzustellen, dass die RNA-Reinheit hoch ist (nahe 2,0) basierend auf dem A260/A280-Wert.
  4. Synthetisieren Sie cDNA aus 1 g Gesamt-RNA mit einem Standard-cDNA-Synthese-Kit.
  5. CDNA mit H2 O auf einendgültiges Volumen von 50 l verdünnen.
  6. Analysieren Sie jede cDNA-Probe in dreifacher Ausfertigung durch qPCR: Bereiten Sie einen qPCR-Master-Mix vor (Tabelle 1), der für die erforderlichen Reaktionen für jeden Primer ausreicht, einschließlich der für die drei Haushaltsgene spezifischen Primer als Steuerung: Gliceraldeid-3-fosfato Deidrogenasi (GAPDH), actinB und ribosomal 18S (siehe Materialtabelle für Primersequenzen):
  7. Geben Sie 18 l Master-Mix pro Bohrung in eine PCR-Multiwall-Platte.
  8. Fügen Sie in jedem Brunnen 2 L cDNA-Proben hinzu. Versiegeln Sie die Platte.
  9. Führen Sie die Proben gemäß der Anweisung Thermal Cycler aus.

8. Bewertung der Lipidüberlastung und Steatose-Induktion: CARS

  1. Fixieren Sie die Zellen, die zuvor auf Glasbodenschalen zubereitet wurden, wie in den Schritten 5.1-5.3 beschrieben.
  2. Schalten Sie ein kommerziell abstimmbares pikodiertes Lasersystem ein und optimieren Sie es, um zwei Ausgänge unterschiedlicher Wellenlängen zu erhalten. Die Frequenzdifferenz zwischen den Ausgängen muss 2.840 cm-1 betragen, um das intensive CARS-Lichtsignal zu erzeugen, das der symmetrischen Methylendehnung entspricht; für einen festen Wellenlängenausgang bei 1.064 nm ("Stokes"-Licht) sollte die andere Wellenlänge auf 817 nm ("Pumpenlicht") eingestellt werden.
  3. Stellen Sie sicher, dass der 817 nm-Ausgang räumlich und zeitlich mit dem 1.064 nm-Ausgang überlappt ist: Verwenden Sie einen geeigneten dichroitischen Spiegel (d.h. mit einem Schnitt zwischen 817 und 1.064 nm), um die Strahlen räumlich zu kombinieren und eine optische Verzögerungslinie zu verwenden, um eine zeitliche Überlappung des Lasers zu erhalten. Impulse.
  4. Stellen Sie sicher, dass die beiden kopropagierenden Strahlen sowohl kollimiert als auch ähnliche Werte aufweisen, die für das optische System innerhalb des Mikroskops geeignet sind, das sie auf die Probe fokussiert; bei Bedarf die Strahlen vor dem dichroitischen Spiegel, der sie kombiniert, separat kollidieren.
  5. Schalten Sie ein kommerzielles invertiertes Mikroskopsystem ein, das eine Infrarot-Laserscaneinheit und eine zweikanalige rot-grüne Epi-Erkennungseinheit umfassen sollte, und richten Sie die kodierenden Laserstrahlen in die Scaneinheit aus.
  6. Öffnen der zweikanaligen Epi-Erkennungseinheit, Entfernen des Filterwürfels und Ersetzen des Rotwellenlängen-Erkennungsfilters durch einen Bandpassfilter, der das 2.840 cm-1 CARS-Signal auswählen kann, das bei 663 nm für die 817/1.064 nm Pumpe/Stokes-Erregung zentriert ist schema. Ein Filter mit schmaler Bandbreite (20 nm) wird bevorzugt, um die Erfassung hoher Fluoreszenz-Hintergrundsignale zu vermeiden.
  7. Legen Sie eine Schale auf die Bühne des invertierten CARS-Mikroskops und verschieben Sie mit einem 100-fachen Öl-Immersion-Objektiv die vertikale Position des Objektivs, um sich auf die Zellen zu konzentrieren.
  8. Richten Sie die Mikroskop-Software ein, um hochauflösende (1024 x 1024 Pixel) Bilder über ein Sichtfeld zu sammeln, das sich über 127 x 127 x 127 cm erstreckt.
  9. Stellen Sie die Mikroskopsoftware so ein, dass sie kontinuierlich Bilder des Sichtfelds von 127 x 127 m erfasst und anzeigen und die angezeigten Bilder überprüfen und gleichzeitig die Bildaufnahmeparameter optimieren. Stellen Sie sicher, dass die Laserleistungen für eine schnelle Bildaufnahme und minimale Beschädigungen ausgeglichen sind, indem Sie bei Bedarf geeignete Neutraldichtefilter in die Strahlpfade einfügen, und wählen Sie eine Pixelverweilzeit aus, die die Sammlung von Bildern mit einem guten Signal-rausch-Signal ermöglicht. Verhältnis unter den gewählten Laserleistungsbedingungen.
  10. Erfassen und speichern Sie Bilder von verschiedenen Sichtfeldern innerhalb der Schale unter den optimierten Bedingungen. Optional können Multiphotonenfluoreszenzbilder, die durch eine grüne Wellenlängenemission (meist aus zwei photonen anregung bei 817 nm) erzeugt werden, gleichzeitig über den anderen Epidetektor gesammelt werden. Wiederholen Sie die Schritte 8.7-8.10 für jedes Gericht.
  11. Für die CARS-Bildanalyse verarbeiten Sie Bilder mit der FIJI-Implementierung von ImageJ. Betreiben Sie die Despeckle-Funktion (oder ein ähnliches Denoising-Tool) auf jedem Bild vor einer weiteren Analyse, um die Signal-Rausch-Verhältnisse ohne Detailverlust zu verbessern.
  12. Verwenden Sie FIJI, um Zellen manuell auszuwählen und dann automatisch Lipidtröpfchen innerhalb segmentierter Einzelzellen zu zählen, um Statistiken über Lipidtröpfchenbereiche und Zahlen für jede Zelle und für das gesamte Bild-Dataset für jede Schale zu erstellen.

9. MTT Cell Viability Assay

  1. Platte differenzierte HepaRG-Zellen zu einer 96-Well-Platte mit einer Dichte von 1 x 105 Zellen/Well in einem abschließenden 100-L-Volumen des Differenzierungskulturmediums.
  2. 24 h nach der Aussaat, behandeln Sie die Zellen mit 99% Methanol (Fahrzeug) und mit 100 'M, 250 'M und 500 'M Natriumoleat und Natriumpalmitat verdünnt in 100 l Differenzierungskultur Medium/gut in Dreifach.
  3. Ändern Sie das Medium mit 99 % Methanol und mit 100 m, 250 m und 500 m Natriumoleat und Natriumpalmitat, das alle 24 h in 100 l Differenzierungskultur medium/well verdünnt wird.
  4. 96 h nach Methanol/Natriumoleat/Natriumpalmitat-Behandlung, behandeln Sie die Zellen mit 2 'M Doxorubicin verdünnt in 100 'L Differenzierungskultur medium/gut in Triplicate als Kontrolle.
  5. 18 h nach Doxorubucin-Behandlung, ändern Sie das Medium mit 100 l Differenzierungskulturmedium.
  6. Pipette 20 l von 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-Tetrazolium-Reagenz MTT (Materialtabelle) in jeden Brunnen der 96-Well-Assay-Platte, die die Zellen in 100 l Differenzierungskulturmedium enthält . Fügen Sie eine Hintergrundsteuerung ein, indem Sie 20 l Reagenz in einen Kontrollbrunnen ohne Zellen in 100 l Differenzierungskulturmedium in Dreifache pipettieren.
  7. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C in einer befeuchteten, 5% CO2-Atmosphäre.
  8. Nach der Inkubation für 30, 60 und 90 min mit MTT TetrazoliumReagenz, notieren Sie die Absorption bei 490 nm mit einem 96-Well-Plattenleser. Subtrahieren Sie die Hintergrundabsorption der zellfreien Kontrollbrunnen von den Absorptionswerten für die anderen Proben.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Methode zur Induzieren und Charakterisierung der vesikulären Steatose in DMSO-differenzierten HepaRG-Zellen durch Natriumoleatbehandlung (Abbildung 1A).

Differenzierung von HepaRG-Zellen.
Um eine Differenzierung effizient zu induzieren, müssen vermehrende Zellen mit einer geringen Dichte (2,5 x 104 Zellen/cm2) im Proliferationsmedium ausgesät werden. Bei geringer...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt, wie HepaRG-Zellen zu unterscheiden und wie vesikuläre Steatose durch Natriumoleatbehandlung induzieren (Abbildung 1A). Tatsächlich weist die HepaRG-Zelllinie im Vergleich zu anderen menschlichen Hepatozellulären Karzinom-Zelllinien Merkmale von erwachsenen menschlichen Hepatozyten auf, die eine wertvolle Alternative zu ex vivo kultivierten primären menschlichen Hepatozytendarstellen 13,14

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Prof. Christian Trepo (INSERM U871, Lyon, Frankreich), der freundlicherweise HepaRG-Zellen zur Verfügung gestellt hat. Wir danken Rita Appodia für die administrative Hilfe. Diese Arbeit wurde von MIUR- Ministero dell'istruzione, dell'université e della ricerca (FIRB 2011–2016 RBAP10XKNC) und der Universität Sapienza in Rom (prot. C26A13T8PS; Prot. C26A142MCH; Prot. C26A15LSXL).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Hyclone HyClone Fötaler Klon II GE HealthcareSH30066
William' s E medium mit GlutaMAX Thermofisher32551087
Penicillin/Streptomycin SIGMAP4333
Insulin SIGMAI9278
Hydrocortison-HemisuccinatSIGMAH2270
DMSO, DimethylsulfoxidSIGMAD2438     
NatriumoleatSIGMAO7501 
MethanolSIGMA179337
IsopropanolSIGMA278475
BODIPY 505/515ThermofisherD3921
PBSThermofisher14190-250
FormaldehydlösungSIGMA252549
RNAse freie DNAseIPromegaM198A 
Schalen mit GlasbodenWillco WellsGWST-5040
Oil Red SolutionSIGMAO625
CellTiter 96 AQueous One SolutionPromega G3582
q-PCR OligonameSequenz
ACACB FÜRCAAGCCGATCACCAAGAGTAAA
ACACB REVCCCTGAGTTATCAGAGGCTGG&BETA;
-AKTIN FÜRGCACTCTTCCAGCCTTCCT
β-Aktin REVAGGTCTTTGCGGATGTCCAC
ALBUMIN FÜRTGCTTGAATGTGCTGATGACAGG
ALBUMIN REVAAGGCAAGTCAGCAGGCATCTCATC
ALDOB FÜRGCATCTGTCAGCAGAATGGA 
ALDOB REVTAGACAGCAGCCAGGACCTT
APOB FORCCTCCGTTTTGGTGGTAGAG
APOB REV  CCTAAAAGCTGGGAAGCTGA
APOC3 FORCTCAGCTTCATGCAGGGTTA
APOC3 REVGGTGCTCCAGTAGTCTTTCAG
CPT1A FORTCATCAAGAAATGTCGCACG
CPT1A REVGCCTCGTGTGTGAGGCAAAA
CYP2E1 FORTTGAAGCCTCTCGTTGACCC
CYP2E1 REVCGTGGTGGGATACAGCCAA
CYP3A4 FÜRCTTCATCCAATGGACTGCATAAAT
CYP3A4 REVTCCCAAGTATAACACTCTACACAGACAA
GAPDH FÜRTGACAACTTTGGTATCGTGGAAGG
GAPDH REVAGGGATGATGTTCTGGAGAGCC
GPAM FÜRTCTTTGGGTTTGGGAATGTT
GPAM REVATGCACATCTCGCTCTTGAATAA
IL6 FÜRCCTGAACCTTCCAAAGATGGC
IL6 REVACCTCAAACTCCAAAAGACCAGTG
PDK4 FÜRACAGACAGGAAACCCAAGCCAC
PDK4 REVTGGAGGTGAGAAGGAACATACACG
PLIN2 FÜRTTGCAGTTGCCAATACCTATGC
PLIN2 REVCCAGTCACAGTAGTCGTCACA
PLIN4 FÜRAATGAGTTGGAGGGCTGGGGGACATC
PLIN4 REVGGTCACCTAAACGAACGAAGTAGC
SCD FÜRTCTAGCTCCTATACCACCACCA
SCD REVTCGTCTCCAACTTATCTCCTCC
SLC2A1 FÜRTGCTCATCAACCGCAACGAG
SLC2A1 REVCCGACTCTCTTCCTTCATCTCCTG
18S FÜRCGCCGCTAGAGGTGAAATTC
18S REVTTGGCAAATGCTTTCGCTC

Referenzen

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