Kurzfristig frei schwebende Scheibenkulturen aus dem erwachsenen menschlichen Gehirn

Artur Fernandes; Niele  Dias Mendes; Glaucia  Maria Almeida; Giovanna  Orlovski Nogueira; Carla de Moraes Machado; Jose de Anchieta de Castro Horta-Junior; João  Alberto Assirati Junior; Norberto Garcia-Cairasco; Luciano Neder; Adriano Sebollela

doi:10.3791/59845

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Methodenartikel

Kurzfristig frei schwebende Scheibenkulturen aus dem erwachsenen menschlichen Gehirn

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DOI:

10.3791/59845

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5. November 2019

Artur Fernandes¹^,² , Niele Dias Mendes¹^,³ , Glaucia Maria Almeida¹ , Giovanna Orlovski Nogueira¹ , Carla de Moraes Machado⁴ , Jose de Anchieta de Castro Horta-Junior⁴ , João Alberto Assirati Junior⁵ , Norberto Garcia-Cairasco² , Luciano Neder³ , Adriano Sebollela¹

¹Department of Biochemistry and Immunology, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, ²Department of Physiology, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, ³Department of Pathology and Forensic Medicine, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, ⁴Department of Anatomy, Institute of Biosciences, São Paulo State University, ⁵Clinical Hospital at the Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Ein Protokoll zur Vorbereitung frei schwebender Scheibenkulturen aus dem erwachsenen menschlichen Gehirn wird vorgestellt. Das Protokoll ist eine Variation der weit verbreiteten Slice-Kultur-Methode mit Membraneinsätzen. Es ist einfach, kostengünstig und wird für die Durchführung von kurzfristigen Assays empfohlen, die darauf abzielen, Mechanismen der Neurodegeneration hinter altersbedingten Hirnerkrankungen zu entwirren.

Zusammenfassung

Organotypische, oder Scheibenkulturen, wurden weit verbreitet verwendet, um Aspekte des zentralen Nervensystems zu modellieren, das in vitro funktioniert. Trotz des Potenzials von Schnittkulturen in der Neurowissenschaft sind Studien, die erwachsenes Nervengewebe zur Vorbereitung solcher Kulturen verwenden, immer noch rar, insbesondere solche von menschlichen Probanden. Die Verwendung von erwachsenem menschlichem Gewebe zur Vorbereitung von Scheibenkulturen ist besonders attraktiv, um das Verständnis menschlicher Neuropathologien zu verbessern, da sie einzigartige Eigenschaften besitzen, die typisch für das reife menschliche Gehirn sind, das an Scheiben aus Nagetieren fehlt (in der Regel neonatal) Nervengewebe. Dieses Protokoll beschreibt, wie Man Gehirngewebe von lebenden menschlichen Spendern gesammelt verwendet, um resekttive Gehirnchirurgie zur Vorbereitung kurzfristiger, frei schwebender Scheibenkulturen. Es werden auch Verfahren zur Aufrechterhaltung und Durchführung biochemischer und zellbiologischer Assays mit diesen Kulturen vorgestellt. Repräsentative Ergebnisse zeigen, dass die typische kortikale Kaschierung des Menschen nach 4 Tagen in vitro (DIV4) in Scheiben konserviert wird, wobei die Hauptanzahl der neuronalen Zelltypen zu erwarten ist. Darüber hinaus erleiden Scheiben bei DIV4 einen robusten Zelltod, wenn sie mit einem toxischen Reiz herausgefordert werden (H₂O₂), was auf das Potenzial dieses Modells hindeutet, als Plattform in Zelltod-Assays zu dienen. Diese Methode, eine einfachere und kostengünstigere Alternative zum weit verbreiteten Protokoll mit Membraneinsätzen, wird hauptsächlich für die Durchführung von kurzfristigen Assays empfohlen, die darauf abzielen, Mechanismen der Neurodegeneration hinter altersbedingten Hirnerkrankungen zu entwirren. Obwohl das Protokoll der Verwendung von kortikalem Gewebe gewidmet ist, das von Patienten gesammelt wurde, die zur chirurgischen Behandlung einer pharmakoresistenten temporalen Lappenepilepsie eingereicht wurden, wird argumentiert, dass Gewebe, das aus anderen Hirnregionen/-bedingungen gesammelt wurde, auch als Quellen betrachtet werden, um ähnliche frei schwebende Scheibenkulturen zu erzeugen.

Einleitung

Die Verwendung menschlicher Proben in der Forschung ist eindeutig eine großartige Option, um menschliche Hirnpathologien zu untersuchen, und moderne Techniken haben neue Wege für robuste und ethische Experimente mit Patientengewebe eröffnet. Methoden wie organotypische/Slice-Kulturen aus erwachsenen menschlichen Gehirn wurden zunehmend in Paradigmen wie Optogenetik¹, Elektrophysiologie²^,³^,⁴^,⁵, Plastizität ⁶^,⁷^,⁸^,