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Methodenartikel

Kurzfristig frei schwebende Scheibenkulturen aus dem erwachsenen menschlichen Gehirn

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DOI:

10.3791/59845

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5. November 2019

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1Department of Biochemistry and Immunology, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 2Department of Physiology, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 3Department of Pathology and Forensic Medicine, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 4Department of Anatomy, Institute of Biosciences, São Paulo State University, 5Clinical Hospital at the Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Ein Protokoll zur Vorbereitung frei schwebender Scheibenkulturen aus dem erwachsenen menschlichen Gehirn wird vorgestellt. Das Protokoll ist eine Variation der weit verbreiteten Slice-Kultur-Methode mit Membraneinsätzen. Es ist einfach, kostengünstig und wird für die Durchführung von kurzfristigen Assays empfohlen, die darauf abzielen, Mechanismen der Neurodegeneration hinter altersbedingten Hirnerkrankungen zu entwirren.

Zusammenfassung

Organotypische, oder Scheibenkulturen, wurden weit verbreitet verwendet, um Aspekte des zentralen Nervensystems zu modellieren, das in vitro funktioniert. Trotz des Potenzials von Schnittkulturen in der Neurowissenschaft sind Studien, die erwachsenes Nervengewebe zur Vorbereitung solcher Kulturen verwenden, immer noch rar, insbesondere solche von menschlichen Probanden. Die Verwendung von erwachsenem menschlichem Gewebe zur Vorbereitung von Scheibenkulturen ist besonders attraktiv, um das Verständnis menschlicher Neuropathologien zu verbessern, da sie einzigartige Eigenschaften besitzen, die typisch für das reife menschliche Gehirn sind, das an Scheiben aus Nagetieren fehlt (in der Regel neonatal) Nervengewebe. Dieses Protokoll beschreibt, wie Man Gehirngewebe von lebenden menschlichen Spendern gesammelt verwendet, um resekttive Gehirnchirurgie zur Vorbereitung kurzfristiger, frei schwebender Scheibenkulturen. Es werden auch Verfahren zur Aufrechterhaltung und Durchführung biochemischer und zellbiologischer Assays mit diesen Kulturen vorgestellt. Repräsentative Ergebnisse zeigen, dass die typische kortikale Kaschierung des Menschen nach 4 Tagen in vitro (DIV4) in Scheiben konserviert wird, wobei die Hauptanzahl der neuronalen Zelltypen zu erwarten ist. Darüber hinaus erleiden Scheiben bei DIV4 einen robusten Zelltod, wenn sie mit einem toxischen Reiz herausgefordert werden (H2O2), was auf das Potenzial dieses Modells hindeutet, als Plattform in Zelltod-Assays zu dienen. Diese Methode, eine einfachere und kostengünstigere Alternative zum weit verbreiteten Protokoll mit Membraneinsätzen, wird hauptsächlich für die Durchführung von kurzfristigen Assays empfohlen, die darauf abzielen, Mechanismen der Neurodegeneration hinter altersbedingten Hirnerkrankungen zu entwirren. Obwohl das Protokoll der Verwendung von kortikalem Gewebe gewidmet ist, das von Patienten gesammelt wurde, die zur chirurgischen Behandlung einer pharmakoresistenten temporalen Lappenepilepsie eingereicht wurden, wird argumentiert, dass Gewebe, das aus anderen Hirnregionen/-bedingungen gesammelt wurde, auch als Quellen betrachtet werden, um ähnliche frei schwebende Scheibenkulturen zu erzeugen.

Einleitung

Die Verwendung menschlicher Proben in der Forschung ist eindeutig eine großartige Option, um menschliche Hirnpathologien zu untersuchen, und moderne Techniken haben neue Wege für robuste und ethische Experimente mit Patientengewebe eröffnet. Methoden wie organotypische/Slice-Kulturen aus erwachsenen menschlichen Gehirn wurden zunehmend in Paradigmen wie Optogenetik1, Elektrophysiologie2,3,4,5, Plastizität 6,7,8,9, Neurotoxizität/Neuroprotektion10,11,12,13, Zelltherapie14, Arzneimittelscreening15,16,17, Genetik und Genbearbeitung12,18,19,20, unter anderem als Strategie für eine bessere Neurologische Erkrankungen im Erwachsenenalter zu verstehen.

Das Verständnis der Mechanismen, die menschlichen Gehirnpathologien zugrunde liegen, hängt von experimentellen Strategien ab, die eine große Anzahl von Probanden erfordern. Umgekehrt umgeht bei Scheibenkulturen, obwohl der Zugang zu menschlichen Proben immer noch schwierig ist, die Möglichkeit, bis zu 50 Scheiben aus einer einzigen kortikalen Probe zu erzeugen, teilweise die Anforderung, mehrere Freiwillige zu rekrutieren, durch die Erhöhung der Anzahl der Repliken und durchgeführten Assays pro gesammeltem Gewebe21.

Es wurden mehrere Protokolle für Organotypische/Scheibenkulturen des Gehirns beschrieben, von den klassischen Oculo-Entwürfen22,23 bis hin zu Rollenrohr24,25,26, halbdurchlässigen Membranen Schnittstelle27,28,29,30und frei schwebende Slices31,32. Je nach den Besonderheiten eines experimentellen Designs hat jede Technik ihre eigenen Vor- und Nachteile. Kurzfristige, frei schwebende Scheibenkulturen aus erwachsenen menschlichen Gehirnen ist in einigen Fällen vorteilhaft gegenüber der von Stoppini et al.27verwendeten Methode, wenn man bedenkt, dass das langfristige Zellüberleben in vitro zwar in der Regel ein Hauptanliegen bei der Bewertung ist. eine Kulturmethode, in vielen Experimenten werden nur kurze Zeiträume in der Kultur benötigt12,31,32,33,34,35. Unter diesen Bedingungen bietet die Verwendung frei schwebender Kulturen den Vorteil, einfacher und kostengünstiger zu sein und dem ursprünglichen menschlichen Gewebezustand genauer zu ähneln als Scheiben, die in der Kultur über 2-3 Wochen aufbewahrt werden.

Trotz des Potenzials von Schnittkulturen für die Neurowissenschaften sind Studien, die erwachsenes Nervengewebe zur Vorbereitung solcher Kulturen verwenden, immer noch rar, insbesondere von menschlichen Probanden. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Verwendung von gesammeltem Hirngewebe von lebenden menschlichen Spendern, die sich einer resektierenden Gehirnchirurgie unterziehen, um frei schwebende Scheibenkulturen vorzubereiten. Die Verfahren zur Pflege und Durchführung biochemischer und zellbiologischer Assays mit diesen Kulturen sind detailliert. Dieses Protokoll hat sich als wertvoll für die Analyse der Lebensfähigkeit und neuronalen Funktion in Untersuchungen über die Mechanismen von Neuropathologien im Zusammenhang mit dem Erwachsenenalter erwiesen.

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Protokoll

Lebende erwachsene Hirngewebe wurden von Patienten gewonnen, die sich einer resekttiven Neurochirurgie zur Behandlung einer pharmakoresistenten temporalen Lappenepilepsie unterziehen (Abbildung 1A). Alle Verfahren wurden von der Ethikkommission des Klinikkrankenhauses der Ribeiréo Preto Medical School (17578/2015) genehmigt, und die Patienten (oder ihre verantwortliche Person) stimmten zu und unterzeichneten die Vereinbarten Zustimmungsbedingungen. Die Entnahme des Gewebes erfolgte durch das Neurochirurgie-Team am Epilepsie-Chirurgiezentrum (CIREP - Clinics Hospital an der Ribeiréo Preto Medical School, Universität Sao Paulo, Brasilien).

1. Sterilisation von Materialien

HINWEIS: Alle Materialien und Lösungen müssen vor der Verwendung sterilisiert werden.

  1. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Werkzeuge und Vibratome-Slicing-Material (Messerhalter, Probenscheibe, Pufferschale) in einem trockenen Sterilisationsofen für 4 h bei 180 °C.
  2. Sterilisieren Sie temperaturempfindliches Material oder Geräte durch UV- oder Gammabestrahlung.
  3. Sterilisieren Sie Medien und Lösungen durch Autoklavierung oder Filtration durch 0,22 m Porenmembranen.

2. Vorbereitung von Lösungen

  1. Vorbereiten von 15-20 ml Transportlösung: 50% v/v Hanks' balanced salt solution (HBSS) pH 7.4, 50% v/v basales Medium zur Erhaltung von postnatalen und erwachsenen Hirnneuronen (Materialtabelle), ergänzt durch 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1- Piperazinthansulfonsäure (Hepes), 3 mg/ml Glukose und 33 g/ml Gentamicin.
    HINWEIS: Die Transportlösung muss vor der Probenentnahme mindestens 20 min gekühlt und mit Sauerstoff versorgt werden (sprudelnd mit Carbogengas).
  2. 300 ml Schneidlösung (HBSS ergänzt mit 10 mM HEPES und 3 mg/ml Glukose) vorbereiten und in einem Gefrierschrank bis zur anfänglichen Kristallbildung abkühlen.
  3. Bereiten Sie 20 ml Kulturmedium: Basalmedium für die Aufrechterhaltung der postnatalen und erwachsenen Gehirnneuronen (Tabelle der Materialien) ergänzt mit 1% L-Glutamin-Derivat ( Tabelle derMaterialien), 2% Ergänzung für neuronale Kultur (Tabelle der Materialien), 1% Penicillin/Streptomycin und 0,25 g/ml Amphotericin B.

3. Einrichten des Schneidegeräts

HINWEIS: Dieses Protokoll wird idealerweise mit Hilfe eines Kollegen durchgeführt, da die Probenentnahme im Operationssaal logistik.

  1. In einem Eimer mit salziertem Eis die Schneidlösung vor der Verwendung mindestens 20 min unter carbogen-Mischung sprudeln lassen (95%O2, 5%CO2).
  2. Bereiten Sie einen Block von 3% Agarose (ca. 2 cm x 2 cm x 2 cm) vor und kleben Sie ihn auf die Vibram-Probenscheibe, um eine zusätzliche mechanische Unterstützung der Gewebeprobe beim Schneiden zu schaffen (Abbildung 1E).
  3. Stellen Sie das Vibratom zum Schneiden ein: Schnittdicke von 200 m, Schwingungsfrequenz von 100 Hz und Schnittgeschwindigkeit zwischen 0,5-1,0 mm/s.
  4. Verriegeln Sie die Vibram-Pufferschale an der Vibram-Basis und fügen Sie Eis hinzu, um sie vor Dem Empfang der Schneidlösung und der Probe und während des gesamten Schneidvorgangs gekühlt zu halten.

4. Probensammlung

HINWEIS: In diesem Protokoll wurde menschliches neokortikales Gewebe im Operationssaal gesammelt und ins Labor transportiert.

VORSICHT: Befolgen Sie beim Umgang mit menschlichen Proben die von der Institution festgelegten Sicherheitsprotokolle.

  1. Richten Sie das Transportgerät ein (Abbildung 1C), das aus: einer tragbaren Gasflasche mit Carbogen-Gemisch besteht, die mit einem Druck-/Flussventil verbunden ist, das den Gasausgang steuert, der mit einem Siliziumschlauch verbunden ist, der die Gasleistung mit dem Transport verbindet Gefäß; ein Transportgefäß, in der Regel ein 50 ml kegelförmiges Zentrifugenrohr mit perforiertem Deckel für den Gaseintrag, das die Transportlösung enthält; und Eis zur Probenkühlung während des Transports.
  2. Sammeln und transportieren Sie die Probe (Abbildung 1B) sofort ins Labor. Tauchmittel die Probe in Kalttransportlösung (ständig mit Carbogen-Mischung geblasen).

5. Schneiden

  1. Die Probe auf eine Petrischale (100 mm x 20 mm) mit Schneidlösung übertragen und mit feinen chirurgischen Werkzeugen so viel wie möglich der verbleibenden Meningen in der Probe sorgfältig entfernen (Abbildung 1D).
  2. Wählen Sie die beste Probenausrichtung für die Herstellung von Scheiben mit den besonderen Eigenschaften des experimentellen Designs, und mit einer Nr. 24 Skalpellklinge, trimmen Sie eine flache Oberfläche, um die Basis auf die Probenscheibe geklebt werden.
  3. Mit einem Einweg-Kunststofflöffel und zarten Pinsel, sammeln Sie das Fragment aus der Petrischale und trockene überschüssige Lösung mit Filterpapier (trocknen Sie durch Kapillarität und vermeiden Sie das Berühren des Gewebefragments mit Papier).
  4. Mit Superkleber das Gewebe an der Vibram-Probenscheibe befestigen, bis es fest an der Scheibe befestigt ist und mit dem Agaroseblock in Kontakt kommt (Abbildung 1E).
  5. Legen Sie die Vibram-Probenscheibe (mit ordnungsgemäß emsobelhaftem Gewebe) in die Vibrampufferschale, gefüllt mit Schneidlösung, die während des gesamten Prozesses sprudeln muss.
  6. Verriegeln Sie den Messerhalter mit fest fest an der Rasierklinge.
  7. Die Schneidlösung muss sowohl die Probe als auch die Klinge abdecken, erst dann mit dem Schneiden beginnen (Abbildung 1F).
  8. Schneiden Sie die Probe in 200 m Scheiben.
    HINWEIS: Obwohl einige Vibratome die Proben automatisch schneiden, können die genaue Beobachtung und kleinere Anpassungen der Schnittgeschwindigkeit während des Prozesses dazu beitragen, bessere Scheiben zu produzieren. Entsorgen Sie erste unregelmäßige Slices.
  9. Übertragen Sie die Scheiben aus der Pufferschale auf eine Petrischale mit Schneidlösung und trimmen Sie lose Kanten und überschüssige weiße Mater auf einen Anteil von etwa 70% Kortex/30% weißer Materie.

6. Kultur

HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt in einem laminaren Strömungsschrank unter steriler Umgebung aus.

  1. Fügen Sie 600 l Kulturmedium pro Brunnen (in einer 24-Well-Platte) hinzu und brüten Sie mindestens 20 min bei 36 °C und 5%CO2 vor dem Beschichten der Scheiben.
  2. Platte eine Scheibe pro Brunnen mit einem Pinsel (Abbildung 1G).
  3. Wenn sich ungenutzte Brunnen in der Platte befinden, füllen Sie sie mit 400 l sterilem Wasser.
  4. Inkubieren Sie die Platte bei 36 °C, 5%CO2.
    HINWEIS: Der erste mittlere Austausch muss zwischen 8-16 h nach der Beschichtung durchgeführt werden, abhängig von der Größe der Scheibe.
  5. Ergänzung 10 ml des zuvor vorbereiteten Kulturmediums mit 50 ng/ml neurotrophen Faktor (BDNF).
    HINWEIS: Während der ersten 8-16 h werden die Scheiben in 600 l Medium inkubiert, um Nährstoffmangel und Versauerung zu vermeiden, da der mittlere Verbrauch in dieser Phase beschleunigt wird. Ab dem nächsten Schritt wird das Volumen des Mediums pro Bohrgut auf 400 l eingestellt.
  6. Entfernen Sie 333 l des konditionierten Mediums aus jedem Brunnen und fügen Sie 133 l frisches BDNF-ergänzungsmedium hinzu.
  7. Wiederholen Sie den Prozess des mittleren Austauschs alle 24 h, indem Sie ein Drittel des konditionierten Mediums durch frisches BDNF-ergänzungsmittelersetzen.

7. Bewertung von Gesundheit, Morphologie und Funktion in kultivierten Slices

HINWEIS: Um den Zelltod zum Zwecke der Veranschaulichung in den repräsentativen Ergebnissen zu induzieren, wurden einige Scheiben einer 24-stunden-Behandlung mit dem oxidativen StressinduktorH2O2unterzogen. Die Schritte 7.1.2 und 7.1.3 beschreiben die Verwendung von H2O2 zur Induzinithedes von Zellen.

  1. Zelllebensfähigkeit
    ANMERKUNG: Eine einfache, unkomplizierte Methode zur Bewertung des neurotoxischen/neuroprotektionsfreien In-/Darm-/Spezien-Assays 36 ist der 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium (MTT)-Assay36, der den Prozentsatz der metabolischen aktiven Zellen misst. unter normalen Bedingungen im Vergleich zu behandelten Proben.
    1. Ersetzen Sie im laminaren Strömungsschrank ein Drittel des Mediums durch frisches Medium.
    2. Von einer 30% H2O2-Lagerlösung ein Volumen von H2O2 pro Bohrung hinzufügen, um die beabsichtigte Endkonzentration (30 mM oder 300 mM) zu erreichen.
      HINWEIS: H2O2 wurde nach dem täglichen Wechsel des Mediums hinzugefügt, um die ordnungsgemäße Versorgung mit frischen Nährstoffen vor der Herausforderung zu gewährleisten.
    3. Inkubieren Sie die Platte für 24 h bei 36 °C, 5%CO2.
      HINWEIS: Nach der Behandlung von H2O2 (oder einem anderen toxischen Reiz von Interesse) beschreiben die folgenden Schritte die Bestimmung der Zelllebensfähigkeit durch den MTT-Assay.
    4. Fügen Sie 40 l MTT-Lösung zu einer Endkonzentration von 0,5 mg/ml zu jedem Brunnen in der Platte hinzu.
    5. Inkubieren Sie die Platte bei 36 °C, 5%CO2 für 3 h.
    6. Die Scheiben mit phosphatgepufferter Saline (PBS) waschen und in ein Mikrorohr übertragen.
    7. Entfernen Sie sorgfältig alle verbleibenden Lösungen durch Pipettieren.
    8. Wiegen Sie die Mikroröhrchen, die die Scheiben enthalten, um die Masse jeder Scheibe zu bestimmen (dies ist der Schlüssel zur Normalisierung der erhaltenen Absorptionswerte).
      HINWEIS: Bei Bedarf können Proben in dieser Phase für die spätere Verarbeitung eingefroren werden (-20 °C).
    9. Homogenisieren Sie die Scheiben in 200 l Isopropanol/HCl mit einem motorisierten Stößel.
    10. Zentrifuge bei Raumtemperatur (RT) für 2 min bei 2600 x g.
    11. Sammeln Sie den Überstand und messen Sie die Absorption bei 540 nm.
  2. KCl-induzierte neuronale Depolarisation
    HINWEIS: Die Phosphorylierung der mitogenaktivierten Proteinkinase (MAPK) signalisiert Kaskadenprotein ERK, gefolgt von Western Blotting, kann zur Quantifizierung der neuronalen Reaktion auf KCl-induzierte Depolarisation37 verwendet werden.
    1. Ersetzen Sie am Strömungsschrank das Kulturmedium durch 300 l HBSS, die zuvor auf 36 °C ausgeglichen wurden.
    2. Ersetzen Sie den HBSS durch 300 L frische HBSS, die zuvor auf 36 °C ausgeglichen wurden.
    3. Inkubieren Sie die Platte bei 36 °C, 5%CO2 für 15 min.
    4. Ersetzen Sie den HBSS entweder durch die frische HBSS oder mit 80 mM KCl Depolarisationslösung (beide bei 36 °C) und inkubieren Bei 36 °C, 5%CO2 für 15 min.
    5. Übertragen Sie die Scheiben von der Platte auf Mikroröhren. In diesem Schritt können Slices bei -20 °C für die spätere Verarbeitung gelagert werden.
    6. Bereiten Sie Gewebeextrakte in 150 L Radioimmunpräzipitations-Assay (RIPA)-Puffer (50 mM Tris-HCl; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1% nichtionisches Tensid; 0,1% Natriumdodecylsulfat; pH 7,5) vor. Zentrifugenextrakte bei 4 °C für 10 min bei 16000 x g,sammeln Überstand und bestimmen die Gesamtproteinkonzentration nach der Bradford-Methode.
    7. 30 g Gesamtprotein auf eine 12% Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) aufladen.
    8. Nach der Elektrophorese den Gelgehalt auf eine Nitrocellulosemembran übertragen.
    9. Nach Blockierung der Membran mit 5% fettfreier Trockenmilch in TBS plus 0,1% Tween, mit Maus anti-pERK (1:1,000) für 16 h bei 4 °C inkubieren. Nach dem Waschen 2 h bei RT mit Kaninchen Anti-ERK1/2 (1:1.000) inkubieren.
    10. Mit dem entsprechenden HRP-konjugierten Sekundärantikörper bei RT für 1 h inkubieren.
    11. Offenbaren Sie mit dem bevorzugten HRP-Substrat.
  3. Morphologische Bewertung
    HINWEIS: Neben dem Zellüberleben und funktionellen Auswertungen ist es wichtig, die Gewebemorphologie zu analysieren. Beachten Sie, dass die Resektion der kultivierten Scheibe ein wichtiger Schritt ist, um so viel hochwertiges Material wie möglich für die morphologische Analyse zu produzieren.
    1. Fixierung, Kryoschutz und Resektion der Scheiben
      1. Übertragen Sie die Scheiben aus den Brunnen mit Kulturmedium auf eine neue 24 Wellplatte mit PBS.
      2. Entfernen Sie die PBS und fügen Sie 1 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) hinzu. Es ist wichtig, dass die Scheiben vor dem Hinzufügen von PFA flach gehalten werden. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
      3. Entfernen Sie vorsichtig die PFA-Lösung und fügen Sie 1 ml 30% Saccharoselösung hinzu. 48 h bei 4 °C inkubieren.
      4. Stellen Sie das Gefriermikrotome auf -40 °C ein.
      5. Bereiten Sie eine Saccharosebasis auf der Mikrotome-Stufe vor, auf der die Scheiben platziert werden sollen (Abbildung 2A). Lassen Sie es vollständig einfrieren und sorgfältig schneiden einige der gefrorenen Saccharose, um eine flache Oberfläche zu produzieren, auf der die Scheibe platziert wird.
      6. Legen Sie jede Scheibe über eine gestreckte Kunststofffolie und verwenden Sie einen Pinsel, um das Gewebe zu flachen.
      7. Übertragen Sie die gestreckte Scheibe in einem zugweise auf die gefrorene Saccharosebasis.
        HINWEIS: Es ist nicht möglich, die Scheibe zu bewegen, sobald sie sich über der gefrorenen Saccharosebasis befindet. Führen Sie diesen Übertragungsschritt sorgfältig aus.
      8. Lassen Sie die Scheibe für 5-10 min für das richtige Einfrieren ruhen.
      9. Schneiden Sie die Scheibe in 30 m Abschnitte.
      10. Übertragen Sie die 30-mm-Abschnitte auf eine Petrischale, die PBS enthält.
      11. Gehen Sie zum Histologieprotokoll über, das dem experimentellen Design angemessener ist.
        ANMERKUNG: Die 30-mm-Abschnitte können problemlos für die freischwebende Immunhistochemie verwendet, zur weiteren Histologie auf Mikroskopie-Dias montiert oder in Frostschutzlösung bei -20 °C gelagert werden.
    2. Immunohistochemistry
      HINWEIS: Immunhistochemie und Immunfluoreszenz-Standardprotokolle variieren zwischen den Laboren. Eine ausführliche Version des hier verwendeten Protokolls finden Sie unter Horta et al.38. Zu den primären Antikörpern, die für Immunfärbungen verwendet werden, wie in Abbildung 2 dargestellt, gehören neuronale Kerne (NeuN), gesunde reife Neuronenmarker, glial fibrilläres saures Protein (GFAP), Astorzytenmarker, ionisierter Calciumbindungsadapter (Iba-1) und Mikroglia anschreiber.
      1. Inkubieren Sie die Scheiben in blockblockierender Lösung (z. B. 2% normales Eselsserum in PBS) für 40 min.
      2. Über Nacht mit primärem Antikörper unter leichter Agitation bei 4 °C inkubieren.
      3. Nach dem Waschen mit PBS 120 min mit biotinyliertem Sekundärantikörper unter leichter Agitation bei RT inkubieren.
      4. Nach dem Waschen mit PBS bei RT für 120 min mit Avidin-Peroxidase-Konjugat(Materialtabelle )inkubieren.
      5. Mit DAB + 0,04% Nickelammonium enthüllen.
      6. Montieren Sie die gebeizten Abschnitte auf gelatinebeschichteten Mikroskopien und lassen Sie sie an der Luft trocknen. Dehydrieren in Ethanol, Diaphanize in Xylol, beenden mit Montagemedium (Tabelle der Materialien), Abdeckung mit einem Deckblatt, und Bild.

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Ergebnisse

Ein kritischer Aspekt, um die Qualität und Gesundheit von kultivierten Scheiben zu bewerten, ist das Vorhandensein und die typische Morphologie der erwarteten neuronalen Zelltypen, Neuronen und Gliazellen. Die typische Architektur der menschlichen kinetischen Laminierung wurde in einer Scheibe bei DIV4 beobachtet, die durch neuronale Immunlabelierung(Abbildung 2D) offenbart wurde. Darüber hinaus wurde auch das erwartete Vorhandensein von Mikroglia und Astroglia (

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Diskussion

Dieses Protokoll zur Herstellung frei schwebender, kurzfristiger Scheibenkulturen ist eine alternative Methode zur Kultivierung erwachsener menschlicher neokortikaler Scheiben. Ein solches Protokoll für Scheibenkulturen kann für Studien über (aber nicht beschränkt auf) Optogenetik1,44,45, Elektrophysiologie2,3,4,

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Arbeit wird unterstützt von FAPESP (Grant 25681-3/2017 to AS), CAPES (Post-Doctoral fellowship PNPD/INCT-HSM to A.F. and Pre-Doctoral fellowship to N.D.M.) und FAEPA. G.M.A. hält ein Master-Stipendium von FAPESP (MS 2018/06614-4). N.G.C. besitzt ein CNPq Research Fellowship. Wir danken den Patienten und ihren Familien für die Vermehrung der resezierten Gewebe für diese Studie. Wir möchten die Unterstützung von Bewohnern, Krankenschwestern, Technikern und dem CIREP-Team des Klinischen Krankenhauses der Ribeiréo Preto Medical School, Universität von Sao Paulo, würdigen, die in verschiedenen Phasen des Prozesses geholfen haben.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2-PropanolMerck1096341000
Acrylamid/Bis-Acrylamid, 30%ige LösungSigma AldrichA3449 
AgaroseSigma AldrichA9539
AmmoniumpersulfatSigmaA3678-25G
Amphotericin BGibco15290-018
Antikörper anti-ERK 2 (Kaninchen)Santa Cruz Biotecnologysc-154Verdünnung 1:1.000 in BSA 2,5%
Antikörper anti-pERK (Maus)Santa Cruz Biotecnologysc-7383Verdünnung 1:1.000 in BSA 2,5%
B27Gibco17504-044
BDNFSigma AldrichSRP3014
Rinderserum AlbuminSigma AldrichA7906
Bradford 1x FarbstoffreagenzBioRad500-0205
EDTASigmaT3924Verwendet in RIPA-Puffer
GlukoseMerck108337
GlutamaxGibco35050-061
Hank's Balanced SaltsSigma AldrichH1387-10X1L
HepesSigma AldrichH4034
SalzsäureMerck1003171000
Wasserstoffperoxid (H2O2)Vetec194
Maus IgG, HRP-gebundenes ganzes Ab (Anti-Maus)GENA931-1ML
NaClMerck1064041000Verwendet in RIPA-Puffer
Neurobasal AGibco10888-022
Fettfreie Trockenmilch (Molico)NestléWird zur Membranblockierung
verwendet: PBS-Puffer, pH 7,2Laborclin590338
Penicilin/Streptomicin,Sigma AldrichP4333,
KaliumchloridMerck1049361000
Prime Western Blotting Detection ReagenzGERPN2232
Kaninchen-IgG, HRP-gebundenes ganzes Ab (Anti-Kaninchen)GENA934-1ML
SDSSigmaL5750Wird in RIPA-Puffer
verwendet TEMEDGE17-1312-01
Thiazolylblaues Tetrazoliumbromid (MTT)Sigma AldrichM5655
TrisSigmaT-1378Wird in RIPA-Puffer
verwendet Triton x-100SigmaX100Verwendet in RIPA-Puffer
ReinstwasserMilliporeSteriles Wasser, gewonnen aus dem MiliQ Wasseraufbereitungssystem
Equipment and Material24-Well-Platten
CorningCL S3526Flacher Boden mit Deckel
Amersham Potran Premium (Nitrozellulosemembran) GE29047575
Carbogen MixtureWhite Martins95% O2, 5% CO2
CO2 InkubatorNew Brunswick ScientificCO-24Inkubation von Scheiben 5% CO2, 36º C
Microplate ReaderMolecular Devices
MikroröhrchenGreiner0016081,5mL Mikroröhrchen
Motorisierter StößelKimble Chase
PlastiklöffelGröße eines Dessertlöffels
RasierklingeBicChrome Platinum, wird beim Schneiden mit Vibratom
verwendet SkalpellklingeBecton Dickinson (BD)Nummer 24Zum Schneiden von Gewebe; empfohlener Sekundenkleber in gleicher oder kleinerer Größe
(Loctite Super Bonder)HenkelZusammensetzung: Etilcianoacrilato; 2-Propensäure; 6,6'-di-terc-butil-2,2'-metilenodi-p-cresol; Homopolymer
Vibratom Leica14047235612 - VT1000S
Name des Materials/ Ausrüstung für Immunhistochemie
Antikörper anti-NeuN (Maus)Millipore MAB377Verdünnung 1:1.000 in Phosphatpuffer
Antikörper gegen GFAP (Maus)MerckMAB360Verdünnung 1:1.000 in Phosphatpuffer
Antikörper gegen Iba1 (Kaninchen)AbcamEPR16588 - ab178846Verdünnung 1:2.000 in Phosphatpuffer
Biotinylierter Anti-Maus-IgG-Antikörper (H+L)VectorBA-9200
DABSigma AldrichD-9015
EntellanMerck107960
EthanolMerck1.00983.1000
GelatinSynth00G1002.02.AEWird zur Beschichtung von Objektträgern
verwendet MikrotomLeicaSM2010RAusgestattet mit Gefriertisch (BFS-10MP, Physiotemp), eingestellt auf -40º C
Normales EselserumJackson Immuno Research017-000-121
ParaformaldehydSigma Aldrich158127
Kaninchen IgG, HRP-linked whole Ab (Anti-Kaninchen)GENA934-1ML
Objektträger (Star Frost)Knittel GlaserGelatine beschichtete Objektträger
SaccharoseVetec60REAVET017050
Vectastain ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard)VectorPK-4000, Kit Standard
XylolSynth01X1001.01.BJ
, , , ,

Referenzen

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  2. Granholm, A. C., et al. Morphological and electrophysiological studies of human hippocampal transplants in the anterior eye chamber of athymic nude rats. Experimental Neurology. 104 (2), 162-171 (1989).
  3. Köhling, R., et al. Spontaneous sharp waves in human neocortical slices excised from epileptic patients. Brain. 121 (6), 1073-1087 (1998).
  4. Simon, A., et al. Gap junction networks can generate both ripple-like and fast ripple-like oscillations. European Journal of Neuroscience. 39 (1), 46-60 (2014).
  5. Israel, J. M., Oliet, S. H., Ciofi, P. Electrophysiology of hypothalamic magnocellular neurons in vitro: A rhythmic drive in organotypic cultures and acute slices. Frontiers in Neuroscience. 10, MAR issue 1-13 (2016).
  6. Bolz, J., Novak, N., Staiger, V. Formation of specific afferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus. The Journal of Neuroscience. 12 (8), 3054-3070 (2018).
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