Ziel dieser Methode ist es, ein In-vivo-Modell der Tumorangiogenese zu generieren, indem Säugetiertumorzellen in einen Zebrafisch-Embryo mit fluoreszierend gekennzeichneten Blutgefäßen gexlüftet werden. Durch die Abbildung des Xenografts und der zugehörigen Gefäße kann eine quantitative Messung der angiogenen Reaktion erreicht werden.
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Methodenartikel
In Vivo Bildgebung und Quantifizierung der Angiogenreaktion des Wirts bei Zebrafischtumor Xenografts
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Tumorangiogenese ist ein wichtiges Ziel der Anti-Krebs-Therapie und diese Methode wurde entwickelt, um ein neues Modell zur Untersuchung dieses Prozesses in vivo zur Verfügung zu stellen. Ein Zebrafisch-Xenograft entsteht, indem Säugetiertumorzellen in den Perivitelinraum von zwei Tagen nach der Befruchtung von Zebrafischembryonen implantiert werden, gefolgt von der Messung des Ausmaßes der angiogenen Reaktion, die an einem experimentellen Endpunkt bis zu zwei Tage beobachtet wurde. Nachderimplantation. Der Hauptvorteil dieser Methode ist die Fähigkeit, die Angiogene Reaktion des Zebrafische-Wirts auf das Transplantat genau zu quantifizieren. Dies ermöglicht eine detaillierte Untersuchung der molekularen Mechanismen sowie des Wirts- vs.-Tumorbeitrags zur angiogenen Reaktion. Die xenografierten Embryonen können einer Vielzahl von Behandlungen unterzogen werden, wie z. B. der Inkubation mit potenziellen Anti-Angiogenese-Medikamenten, um Strategien zur Hemmung der Tumorangiogenese zu untersuchen. Die angiogene Reaktion kann auch live abgebildet werden, um dynamischere zelluläre Prozesse zu untersuchen. Die relativ anspruchslose Versuchstechnik, die günstigen Wartungskosten von Zebrafischen und die kurze experimentelle Zeitleiste machen dieses Modell besonders nützlich für die Entwicklung von Strategien zur Manipulation der Tumorangiogenese.
Einleitung
Angiogenese ist eines der klassischen Kennzeichen von Krebs und stellt ein Ziel der Anti-Krebs-Therapie1,2. Um diesen Prozess zu untersuchen, wurden Xenograft-Modelle von Krebs durch implantieren Säugetier Tumorzellen in Tiere wie Mäuse3erstellt. Es wurde auch ein Zebrafisch-Xenograft-Modell entwickelt, das die Implantation von Tumorzellen in 2 Tage nach der Befruchtung (dpi) Zebrafische beinhaltet, was zu einem schnellen Wachstum von Zebrafisch-Blutgefäßen in das Xenograft4führt.
Dieses Protokoll beschreibt ein in vivo Zebrafisch-Embr....
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Protokoll
1. Herstellung von Mikroinjektionsnadeln
- Schalten Sie einen Micropipette-Puller ein und stellen Sie die folgenden Parameter ein (kalibriert für das in Materialtabelleaufgeführte Micropipette-Puller-Modell): Heat, 680; Ziehen, 75; Geschwindigkeit, 40; Zeit, 55; Druck: 530.
- Befestigen Sie eine Borosilikatglaskapillare in den Mikropipette-Zieher und ziehen Sie die Kapillare, um zwei Nadeln zu bilden. Wiederholen Sie dies für beliebig viele Nadeln.
2. Zellkultur zur Implantation
HINWEIS: Bei Verwendung dieses Protokolls kann jede Säugetier-Krebszelllinie für d....
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Ergebnisse
Durch die Abbildung eines einzelnen Xenografts bei 6, 24 und 48 PSi kann das angiogene Ansprechen zu verschiedenen Zeitpunkten berechnet werden, wie in Abbildung 1A-Cdargestellt. Die größte angiogene Reaktion wird zwischen 24-48 h nach der Implantation beobachtet, wobei die maximalen Konzentrationen der Transplantat-Vaskularisation um 2 dpi beobachtet werden (Abbildung 1A-C). Ein Zeitrafferfilm e.......
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Diskussion
Der erste kritische Schritt im Protokoll ist die Implantation von Tumorzellen. Es ist wichtig, dass Zellen an einen Ort injiziert werden, der es dem Xenograft ermöglicht, erfolgreich in den Embryo zu implantieren, ohne den Embryo ödematend zu machen. Eine zu vordere Injektion kann es den Zellen ermöglichen, sich in Richtung Herz zu bewegen, die Blutbahn zu blockieren und zu Ödemen zu führen, während eine zu hintere Injektion zu einem schlecht implantierten Xenograft führt. Eine vordere Injektion wird am besten vermieden,.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Wir danken Herrn Alhad Mahagaonkar für die Leitung der Zebrafischanlage der University of Auckland und der Biomedical Imaging Research Unit, School of Medical Sciences, University of Auckland, für die Unterstützung bei der konfokalen Mikroskopie im Zeitraffer. Diese Arbeit wurde durch ein Health Research Council of New Zealand Project Grant (14/105), ein Royal Society of New Zealand Marsden Fund Project Grant (UOA1602) und einen Auckland Medical Research Foundation Project Grant (1116012) unterstützt, der J.W.A. verliehen wurde.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Luftzylinder | BOC | 011G | Xenotransplantation |
| B16-F1 Zellen | ATCC | Zellkultur | |
| BD Matrigel LDEV-frei (extrazelluläre Matrixmischung) | Corning | 356235 | Xenotransplantation |
| Borosilliat-Glaskapillaren | Warner Instruments | G100T-4 | OD = 1,00 mm, ID = 0,78 mm, Länge = 10 cm Zellinjektion |
| Zelle Kulturschale 35 mm Durchmesser | Thermofisher NZ | NUN153066 | Fischzucht |
| Zellkulturschale 100 mm | Durchmesser Sigma-Aldrich | CLS430167-500EA | Fischzucht |
| Zellkulturkolben 75 cm2 | Vitro Technologies | COR430641 | Zellkultur |
| CellTracker Green | Invitrogen | C2925 | Zellmarkierung, Stammkonzentration (10 mM in DMSO), Arbeitskonzentration (0,2 μ M in serumfreien Medien) |
| Dimethylsulfoxid | Sigma-Aldrich | D8418 | Medikamentöse Behandlung, Zellmarkierung |
| E3 Medien (60x in 2 L Wasser) 34,8 g NaCl 1,6 g KCl 5,8 g CaCl2· 2H2O 9,78 g MgCl2· 6H2O passt sich mit NaOH an einen pH-Wert von 7,2 | an [1] | Fischzucht | |
| Ethyl-3-aminobenzoat, Methansulfonat (Tricain) | Sigma-Aldrich | E10521 | Xenotransplantation, Bildgebung |
| Filterspitze 1.000 μ L | VWR | 732-1491 | Wird in mehreren Schritten |
| verwendet Filterspitze 200 μ L | VWR | 732-1489 | Wird in mehreren Schritten |
| verwendet Filterspitze 10 μ L | VWR | 732-1487 | Wird in mehreren Schritten verwendet |
| Fluoreszenzmikroskop | Leica | MZ16FA | Vorbereitung von Embryonen |
| FBS (neuseeländischer Ursprung) | Thermofisher Scientific | 10091148 | Zellkulturhandschuhe |
| Jede Handelsmarke | Wird in mehreren Schritten verwendet | ||
| Hämozytometer Zellzählkammer Verbessert Neubauer | HawksleyVet | AC1000 | Xenotransplantation |
| Heraeus Multifuge X3R Zentrifuge | Thermofisher Scientific | 75004500 | Zellkultur, Zellmarkierung |
| Hoechst 33342 | Thermofisher Scientific | 62249 | Zellmarkierung, Stammkonzentration (1 mg/ml in DMSO), Arbeitskonzentration (6 μ g/ml in serumfreien Medien) |
| Low Melting Point, UltraPure Agarose | Thermofisher Scientific | 16520050 | Imaging |
| Methycellulose | Sigma-Aldrich | 9004 67 5 | Xenotransplantation |
| Methylenblau | sigma-Aldrich | M9140 | Microloader für die Fischzucht |
| 0,5-20 μ L Pipettenspitze zum Laden von Mikrokapillaren | Eppendorf | 5242956003 | Xenotransplantation |
| Mikropipetten | Jede Handelsmarke | Wird in mehreren Schritten verwendet | |
| Mikropipettenabzieher P 87 | Sutter Instruments | Xenotransplantation | |
| Mikroskop Käfig-Inkubator | Okolab | Zeitraffer-Bildgebung | |
| Mikrowelle | Jede Handelsmarke | Bildgebung | |
| Mineralöl | Sigma-Aldrich | M3516 | Xenotransplantation |
| Minimal Essential Media (MEM) - alpha | Thermofisher Scientfic | 12561056 | Zellkultur |
| MPPI-2 Druckinjektor | Angewandte wissenschaftliche Instrumentierung | Xenotransplantation | |
| Narishige Mikromanipulator | Narishige Gruppe | Xenotransplantation | |
| Nikon D Eclipse C1 Konfokalmikroskop | Nikon | Imaging | |
| N-Phenylthioharnstoff (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | Fischzucht |
| PBS | Gibco | 10010023 | Zellkultur |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | Zellkultur |
| S1 Pipettenfüller | Thermoscientific | 9501 | Zellkultur |
| Serologische Stripette 10 mL | Corning | 4488 | Zellkultur |
| Serologische Stripette 25 mL | Corning | 4489 | Zellkultur |
| Serologische Stripette 5 mL | Corning | 4485 | Zellkultur |
| Serologische Stripette 2 mL | Corning | 4486 | Zellkultur |
| Terumo Nadel 22 G | Amtech | SH 182 | Fischzucht |
| Gewebekultur-Inkubator | Thermofisher Scientfic | HeraCell 150i | Zellkultur |
| Tivozanib (AV951) | AVEO Pharmaceuticals | Arzneimittelbehandlung | |
| Transferpipette 3 mL | Mediray | RL200C | Fischzucht |
| Trypsin/EDTA (0,25%) | Life Technologies | T4049 | Zellkulturpinzette |
| Fine Science Tools | 11295-10 | Fischzucht | |
| Volocity Software (v6.3) | Improvision/Perkin Elmer | Bildanalyse |
Referenzen
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Huang, D., et al. Sunitinib acts primarily on tumor endothelium rather than tumor cells to inhibit the growth of renal cell carcinoma. Cancer Rese....
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Nachdrucke und Genehmigungen
