Antikörperfreier Assay für rna-Methyltransferase-Aktivitätsanalyse

Zusammenfassung

Hierwird wird ein antikörperfreier In-vitro-Assay zur direkten Analyse der Methyltransferase-Aktivität an synthetischer oder in vitro transkribierter RNA beschrieben.

Zusammenfassung

Es gibt mehr als 100 chemisch unterschiedliche Modifikationen der RNA, von denen zwei Drittel aus Methylierungen bestehen. Das Interesse an RNA-Modifikationen, insbesondere Methylierungen, ist aufgrund der wichtigen Rolle der Enzyme, die sie schreiben und löschen, in biologischen Prozessen, die für Krankheiten und Krebs relevant sind, wieder aufgetaucht. Hierbei wird ein empfindlicher In-vitro-Assay zur genauen Analyse der RNA-Methylierungs-Writer-Aktivität an synthetischen oder in vitro transkribierten RNAs bereitgestellt. Dieser Test verwendet eine tritiated Form von S-Adenosyl-Methionin, was zu einer direkten Etikettierung von methylierter RNA mit Tritium führt. Die geringe Energie der Tritiumstrahlung macht die Methode sicher, und bereits bestehende Methoden der Tritiumsignalverstärkung ermöglichen es, die methylierte RNA ohne den Einsatz von Antikörpern, die häufig anfällig für Artefakte sind, zu quantifizieren und zu visualisieren. Während diese Methode für die RNA-Methylierung geschrieben ist, machen wenige Optimierungen es für die Untersuchung anderer RNA-Modifikationen anwendbar, die radioaktiv markiert werden können, wie z. B. RNA-Acetylierung mit ¹⁴C Acetyl-Coenzym A. Insgesamt ermöglicht dieser Assay eine schnelle Bewertung der RNA Methylierungsbedingungen, Hemmung mit kleinen Molekülinhibitoren oder die Wirkung von RNA- oder Enzymmutanten und bietet ein leistungsfähiges Werkzeug, um die in Zellen erhaltenen Ergebnisse zu validieren und zu erweitern.

Einleitung

DNA, RNA und Proteine unterliegen Modifikationen, die die Genexpression¹streng regulieren. Unter diesen Modifikationen treten Methylierungen auf allen drei Biopolymeren auf. DNA- und Proteinmethylierungen wurden in den letzten drei Jahrzehnten sehr gut untersucht. Im Gegensatz dazu wurde das Interesse an der RNA-Methylierung erst vor kurzem angesichts der wichtigen Rolle neu entfacht, die Proteine, die RNA-Methylierungen schreiben, löschen oder binden, in Entwicklung und Krankheit²spielen. Neben bekannteren Funktionen in den reichlich ribosomalen und Transfer-RNAs regulieren RNA-Methylierungswege die spezifische Boten-RN....

Protokoll

1. In-vitro-Transkription und Gelreinigung der Ziel-RNA

1. Klonen Sie die Abfolge des Interesses in Plasmiden, die T7- und/oder SP6-Promotoren enthalten, indem Sie etablierte molekulare Klontechniken¹² oder Kits verwenden.
2. Linearisieren der DNA-Vorlage für die In-vitro-Transkription
   1. Verstärken Sie die Interessensfolge durch PCR des Plasmids mit Primern, die den T7-Promotorbereich durch den Einsatz, +20-30 bp vor- und nachgelagert, wie zuvor beschrieben^13,einschließen sollen.
   2. Alternativ können Sie 5 g des Plasmids mit hilfe einer Restriktionsenzym-Schnittstelle nach d....

Ergebnisse

In-vitro-Transkriptionsreaktion
Abbildung 2 A stellt einen typischen Lauf einer In-vitro-Transkriptionsreaktion mit der T7-RNA-Polymerase der 7SK snRNA dar, die eine relativ kurze (331 nt) und hochstrukturierte RNA ist. Wie auf diesem Rohbild gezeigt, gibt es mehrere unerwünschte Bänder, sowohl kürzer als auch länger als 7SK, wahrscheinlich als Ergebnis zufälliger transkriptionsiellen Initiierungs- oder Beendigungsereignisse. Aus diesem Grund ist die Gelr.......

Diskussion

Hierwird wird eine einfache und robuste Methode zur In-vitro-Verifizierung der RNA-Methyltransferase-Aktivität in Richtung spezifischer Transkripte berichtet. Der Test nutzt die Tatsache aus, dass S-Adenosylmethionin auf den Methylgruppenspender tritiiert werden kann (Abbildung 1), so dass die methylierte RNA ohne den Einsatz von Antikörpern genau nachgewiesen werden kann. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass dieser Test nicht darauf hinweisen kann, welcher Rückstand oder welche chemische.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10 bp DNA-Leiter	Invitrogen	10821-015	10 bp DNA-Leiter-Kit.
10% Ammoniumpersulfat (APS)	N/A	N/A	Für harnstoffdenaturierendes Polyacrylamid-Gel (Für 10 mL 1 g in 8 mL milQ Wasser auflösen; Volumen mit milliQ Wasser auf 10 mL einstellen; Lösung mit einer 10 mL Spritze filtrieren, die mit einem 0,45 & micro; m Filter).
10X TBE Puffer	N/A	N/A	Für harnstoffdenaturierendes Polyacrylamid-Gel (Für 1 l geben Sie 108 g Trisbase, 55 g Borsäure in einen Zylinder mit einem Rührstab; fügen Sie 800 mL destilliertes Wasser hinzu und lassen Sie es auflösen; fügen Sie 40 mL 0,5 M Na2EDTA (pH 8,0) hinzu; stellen Sie das Volumen auf 1 l mit milliQ Wasser ein; filtern Sie die Lösung mit einem 0,22 μm; m Filter).
10X TBS	N/A	N/A	Für 1 l geben Sie 60,5 g Tris Base und 87,6 g NaCl in einen Zylinder mit einem Rührstab; fügen Sie 800 mL destilliertes Wasser hinzu und lassen Sie es auflösen; stellen Sie den pH-Wert auf 7,5 mit konzentriertem HCl ein; stellen Sie das Volumen auf 1 l mit milliQ Wasser ein; filtern Sie die Lösung mit einem 0,22 & Mikro; m Filter.
Acrylamid: Bis-Acrylamid 29:1 (40% Lösung/Elektrophorese), Fisher BioReagents	Fisher	BP1408-1	Für harnstoffdenaturierendes Polyacrylamidgel.
ADENOSYL-L-METHIONIN, S-[METHYL-3H]; (SAM[3H])	Perkin Elmer	NET155V250UC	Für die In-vitro-Methylierung von RNA; Konzentration = 1,0 mCi/ml; Spezifische Aktivität = 17,1 Ci/mmol; Molarität= (1,0 Ci/L)/(83,2 Ci/mmol) = 0,0584 mmol/L = 58,4 μm;M.    Nach Erhalt des gefrorenen 3H-SAM-Röhrchens wird es bei 4 μg aufgetaut. C, mach 20 & Mikro; L aliquote und frieren Sie sie bei -30°C ein. Frieren Sie ein teilweise verwendetes Aliquot niemals wieder ein und verwenden Sie es nicht wieder.
Amersham Hyperkassette Autoradiographie-Kassetten	GE Healthcare	RPN11649	Für die Exposition von Autoradiogramm-Gelen.
Amersham Hyperfilm MP	GE Healthcare	28906846	Für die Exposition mit Autoradiogramm-Gel.
Beckman Szintillationszähler	Beckman	LS6500	Für die Flüssigszintillationszählung.
Biorad Mini Horizontales Elektrophoresesystem	Biorad	1704466	Mini Horizontales Elektrophoresesystem.
cOmplete Mini EDTA-freie Proteasehemmer-Cocktail-Tabletten Roche	Applied Science	4693159001	Für eine 20-fache Lösung lösen Sie 1 Tablette in 0,525 ml nukleasefreiem Wasser auf.
Criterion Cell	Biorad	345-9902	RNasefreie leere Kassette für Polyacrylamid-Gel.
Criterion leere Kassetten	Biorad	1656001	Vertikale Elektrophoresezelle im Midiformat.
DeNovix DS-11 Mikrovolumen-Spektralphotometer	DeNovix	DS-11-S	Mikrovolumen-Spektralphotometer zur Messung der DNA- und RNA-Konzentration.
Ecoscint Original	National Diagnostics	LS-271	Für die Flüssigszintillationszahl.
Fisherbrand 7mL HDPE-Szintillationsfläschchen	Fisher	03-337-1	Für die Flüssigszintillationszählung.
Fluor-Hance-Schnell wirkender Autoradiographie-Verstärker	RPI CORP	112600	Für die Vorbehandlung von Autoradiogramm-Gelen.
Geltrockner	Biorad	1651745	Zum Trocknen von Gel.
Gel-Ladepuffer II	Ambion	AM8547	Zum Laden von RNA in denaturierendem Polyacrylamid-Harnstoffgel (Zusammensetzung: 95 % Formamid, 18 mM EDTA und 0,025 % SDS, Xylolcyanol und Bromphenolblau).
GeneCatcher Einweg-Gel-Exzisionsspitzen	Gel Company	NC9431993	Zum Entfernen von Banden aus Agarose- und Polyacrylamid-Gelen.
Megascript Kit		Ambion AM1333	Für die In-vitro-Transkription mit T7-RNA-Polymerase.
Perfectwestern Extralarge Container	Genhunter Corporation	NC9226382 (klar)/ NC9965364 (schwarz)	Gel-Färbebox.
pRZ	Addgen	#27663	Plasmid zur Herstellung von in vitro Transkripten mit homogenen Enden
Qiagen RNeasy MinElute Cleanup	Qiagen	74204	Für die RNA-Reinigung verwenden Sie das modifizierte Protokoll, das im Protokoll bereitgestellt wird.
QIAquick Gel-Extraktionskit (50)	Qiagen	28704	Kit für die Gelextraktion und Aufreinigung von dsDNA-Fragmenten, die für die In-vitro-Transkription verwendet werden.
Saran Premium Plastic Wrap	Saran Wrap	Amazon	Zum Trocknen von Gel.
SYBR Gold	Invitrogen	S11494	Ultra-empfindliche Nukleinsäure-Gel-Färbung.
SYBR Safe	Invitrogen	S33102	Nukleinsäure-Gel-Färbung.
TE	Sigma	93283-100ML	10 mM Tris-HCl, 1 mM Dinatrium EDTA, pH 8,0
TEMED	Fisher	110-18-9	Für harnstoffdenaturierendes Polyacrylamidgel.
Thermomixer mit SMARTBLOCK 24X 1,5 mL TUBES	eppendorf	5382000023/5361000038	Für die temperaturkontrollierte Inkubation von 1,5 mL Röhrchen.
TOPO TA Cloning Kit	life		technologies Kits für die schnelle Klonierung von Taq-Polymerase– amplifizierte PCR-Produkte in Vektoren, die T7- und/oder SP6-Promotoren für die in vitro RNA-Transkription enthalten.
TURBO DNase (2 U⁄ &Mikro; L)	Ambion	AM2238	Zur DNA-Entfernung aus in vitro Transkriptionsreaktionen.
Harnstoff	Sigma	51456-500G	Für harnstoffdenaturierendes Polyacrylamidgel.
Whatman 3MM Papier	GE Healthcare	3030-154	Chromatographiepapier zum Trocknen von Gel.