Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Bewertung der Langzeit-Depressionsinduktion bei erwachsenen Cerebellarscheiben

6.4K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/59859

⸱

16. Oktober 2019

 , 
1Laboratory for Behavioral Genetics, Center for Brain Science, RIKEN, 2Senior Adviser's Office, Center for Brain Science, RIKEN

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Bei einigen genmanipulierten Tieren kann die Verwendung eines einzigen Protokolls nicht in zerebellar Purkinje-Zellen ltd induzieren, und es kann eine Diskrepanz zwischen LTD und motorischem Lernen geben. Mehrere Protokolle sind notwendig, um die LTD-Induktion bei genmanipulierten Tieren zu bewerten. Standardprotokolle werden angezeigt.

Zusammenfassung

Synaptische Plastizität bietet einen Mechanismus zum Lernen und Gedächtnis. Für das kleinhirnmotorische Lernen gilt die Langzeitdepression (LTD) synaptischer Übertragungen von Parallelfasern (PF) zu Purkinje-Zellen (PC) als Grundlage für motorisches Lernen, und Mängel sowohl des LTD- als auch des motorischen Lernens werden in verschiedenen genmanipulierten Tieren. Gemeinsame motorische Lernsets, wie die Anpassung des optokinetischen Reflexes (OKR), der vestiular-okuläre Reflex (VOR) und der Rotarod-Test wurden zur Beurteilung der motorischen Lernfähigkeit verwendet. Die Ergebnisse der GluA2-carboxy Endstation modifizierten Einschlagsmäuse zeigten jedoch eine normale Anpassung des VOR und des OKR, obwohl PF-LTD fehlte. In diesem Bericht wurde die Induktion von LTD nur mit einer Art Stimulationsprotokoll bei Raumtemperatur versucht. So wurden Bedingungen zur Induzieren von Kleinhirn-LTD in den gleichen Einschlagsmutanten mit verschiedenen Protokollen bei nahezu physiologischer Temperatur untersucht. Schließlich fanden wir Stimulationsprotokolle, mit denen LTD bei diesen genmanipulierten Mäusen induziert werden konnte. In dieser Studie wird eine Reihe von Protokollen zur Bewertung der LTD-Induktion vorgeschlagen, die eine genauere Untersuchung des kausalen Zusammenhangs zwischen LTD und motorischem Lernen ermöglichen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass experimentelle Bedingungen bei der Bewertung von LTD bei genmanipulierten Mäusen von entscheidender Bedeutung sind.

Einleitung

Die synaptische Organisation der ausgeklügelten neuronalen Netzwerke des Kleinhirnkortex, bestehend aus PCs, molekularen Schicht-Interneuronen (Korb- und Stellatzellen), Golgi-Zellen, PFs aus Granulatzellen, Moosfasern und Kletterfasern (CFs), wurden aufgeklärt in Bezug auf Erregung/Hemmung und Divergenz/Konvergenz, und das gut organisierte Schaltplan diagramm hat vorgeschlagen, dass das Kleinhirn eine "neuronale Maschine"ist 1, obwohl es vorher keine Ahnung über den Zweck dieser "Maschine" gab. Später schlug Marr vor, dass die PFs-Eingabe in PCs ein dreischichtiges assoziatives Lernnetzwerk2bilden sollte. Er schlug auch vor, dass jeder CF eine zerebrale Anweisung für Elementarbewegung2vermittelt. Er ging davon aus, dass die gleichzeitige Aktivierung von PFs und CF die PF-PC-Synapsenaktivität verbessern und eine langfristige Potenzierung (LTP) der PF-PC-Synapse verursachen würde. Andererseits ging Albus davon aus, dass die synchrone Aktivierung von PFs und CF zu LTD an den PF-PC Synapsen3führte. Beide oben genannten Studien interpretieren das Kleinhirn als einzigartiges Speichergerät, dessen Einbindung in das kleinhirnförmige kortikale Netzwerk zur Bildung des Marr-Albus-Modelllernmaschinenmodells führt.

Nach diesen theoretischen Vorhersagen deuten zwei Beweislinien auf das Vorhandensein synaptischer Plastizität im Kleinhirn hin. Die erste Beweislinie wurde von der anatomischen Organisation des Flocculus vorgeschlagen; hier konvergieren MF-Wege vestibulären Organursprungs und CF-Wege retinalen Ursprungs auf den PCs4. Dieses einzigartige Konvergenzmuster legt nahe, dass eine synaptische Plastizität, die im Flocculus auftritt, die bemerkenswerte Anpassungsfähigkeit des vestibulo-okulären Reflexes verursacht. Zweitens stützten die Aufzeichnung der PCs-Antwort im Flocculus und die Läsion des Flocculus auch die obige Hypothese5,6,7. Darüber hinausstützte das PC-Entladungsmuster während der Anpassung der Handbewegung 8 eines Affen die synaptische Plastizitätshypothese, insbesondere Albus' LTD-Hypothese3.

Um die Art der synaptischen Plastizität direkt zu bestimmen, wurde gezeigt, dass die wiederholte Konjunktivstimulation (Cjs) eines Bündels von PFs und des CF, das den PC in vivo spezifisch innerviert, LTD für die Transmissionswirksamkeit der PF-PC-Synapsen9induzierte. 10,11. In den anschließenden In-vitro-Explorationen mit einem Kleinhirnschnitt12 und kultivierten PCs, Konjunktion von kokultivierter Granulatzellstimulation und Olivzellenstimulation13 oder Konjunktion iontophoretisch angewendeter Glutamat- und somatisch Depolarisation14,15 verursacht LTD. Der der LTD-Induktion zugrunde liegende Signaltransduktionsmechanismus wurde ebenfalls intensiv mit In-vitro-Präparaten16,17untersucht.

Anpassungen des VOR und des OKR wurden häufig zur quantitativen Bewertung von Genmanipulationseffekten auf das kleinhirnmotorische Lernen verwendet, da sich der vestibule-zerebellare Kortex als wesentlicher Ursprung beim adaptiven Lernen des VOR18 erwiesen hat. ,19,20 und die OKR19,21 Die Korrelation zwischen Versagen der LTD-Induktion und Beeinträchtigung des verhaltensmotorischen Lernens wurde als Beweis dafür genommen, dass LTD eine wesentliche Rolle bei der Lernmechanismen22. Diese Ansichten werden kollektiv als die LTD-Hypothese des motorischen Lernens oder Marr-Albus-Ito-Hypothese23,24,25,26bezeichnet.

Adaptives Lernen der Augenbewegung wurde mit ähnlichen Protokollen gemessen, während verschiedene experimentelle Bedingungen verwendet wurden, um LTD in der Scheibenvorbereitung27,28,29,30,31 zu induzieren. . Kürzlich berichteten Schonewille et al.26, dass einige genmanipulierte Mäuse normales motorisches Lernen zeigten, aber die Kleinhirnscheiben zeigten keine LTD und kamen so zu dem Schluss, dass LTD für das motorische Lernen nicht wesentlich sei. Die Induktion von LTD wurde jedoch nur mit einer Art von Protokoll bei Raumtemperatur versucht. Daher verwendeten wir verschiedene Arten von LTD-induzierenden Protokollen unter Aufzeichnungsbedingungen bei etwa 30 °C, und wir bestätigten, dass die LTD zuverlässig in den genmanipulierten Mäusen induziert wurde, indem diese Protokolle bei nahe physiologischen Temperaturen32verwendet wurden.

Es bleiben jedoch einige Fragen zu den grundlegenden Eigenschaften der konjunktiven Stimulation. Die erste ist die Beziehung zwischen der Form der komplexen Spitze und der Amplitude von LTD. Zweitens war in Verbindung mit PF-Stimulation und somatischer Depolarisation, ob die Anzahl der eingesetzten Reize notwendig war oder nicht, schwer zu fassen war. In der vorliegenden Studie wurden diese Fragen mit Wildtyp-Mäusen (WT) untersucht.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Alle Versuchsverfahren wurden vom RIKEN-Ausschuss für die Pflege und Verwendung von Tieren in Experimenten genehmigt. Mäuse wurden in der Tieranlage des RIKEN Center for Brain Science unter gut kontrollierter Temperatur (23–25 °C) und Feuchtigkeit (45%–65%) gehalten. Bedingungen. Es wurden sowohl männliche als auch weibliche WT-Mäuse (C57BL/6, 3–6 Monate) verwendet.

1. Vorbereitung von Lösungen, die in den Experimenten verwendet werden

HINWEIS: Alle Lösungen sollten in metallfreiem Reinstwasser (Widerstand > 18,2 Mio. Euro) und anderen Verunreinigungen (Gesamt-Biokohlenstoff (TOC) < 5,0 ppb) hergestellt werden. Arbeitende künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) zum Schneiden und Aufnehmen werden am Tag des Experiments frisch aus einem 10-fachen (x10) ACSF-Bestand hergestellt. Blasen Sie die Lösungen vor Gebrauch mit 5%CO2/ 95%O2 Gasgemisch. Der pH-Wert von ACSF wird auf 7,4 x 0,1 und die Osmolarität um 315 x 5 mOsm/kg durch Zugabe von Reinstwasser eingestellt.

  1. Bereiten Sie 10x Bestand an ACSF mit 1250 mM NaCl, 30 mM KCl, 12,5 mM NaH2PO4und 260 mM NaHCO3vor. Diese Lösung kann bei 4 °C gelagert werden.
  2. Vorbereiten von Arbeits-ACSF mit 125 mM NaCl, 3 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM Mg2SO4, 1,25 mM NaH2PO4, 26 mM NaHCO3 und 20 mM Glukose.
    1. Fügen Sie zunächst 1 ml 2 M CaCl2 Lösung gefolgt von 1 ml 1 M Mg2SO4 Lösung in ca. 800 ml Reinstwasser, um Niederschläge zu vermeiden. Dann 100 ml 10x ACSF und Glukose hinzufügen. Schließlich machen Sie ein Gesamtvolumen von 1.000 ml durch Zugabe von Reinstwasser.
  3. Bereiten Sie 3,3% Agar für die Behandlung des Gehirns. 1 g Agar in 30 ml 0,9% NaCl-Lösung auflösen und in einer Mikrowelle bis zum Kochen erhitzen. Rühren, um zu mischen, dann gießen Sie es in eine sterile 4 cm x 10 cm Kunststoff-Box und lassen Sie zu erstarren. Bewahren Sie die Agarplatte(8mm Dicke) im Kühlschrank auf.
  4. Bereiten Sie die interne Lösung vor.
    1. Bereiten Sie die K+-basierte interne Lösung mit 60 mM KCl, 60 mM K-Gluconat, 0,3 mM EGTA, 4 mM MgCl2, 4 mM ATP, 0,4 mM GTP und 30 mM HEPES (pH 7,2) vor.
      HINWEIS: Niedrige Konzentration (0,3 mM) von EGTA, einem langsamen Ca2+-Chelat, wird hinzugefügt, um möglicherweise kontaminierte Ca2+ in reinem Wasser zu chelaten, aber diese niedrige Konzentration von EGTA in der internen Lösung blockiert niemals die Induktion von LTD (Abbildung 3, Abbildung 4, Abbildung 5) während der Vollzellaufzeichnung. Gemessener osmotischer Druck beträgt 285 mOsm/kg.
    2. Bereiten Sie die Cs+-basierte interne Lösung mit 60 mM CsCl, 46 mM D-Gluconat, 27 mM Tetraethylammoniumchlorid (TEA-Cl), 0,3 mM EGTA, 4 mM MgCl2, 4 mM ATP, 0,4 mM GTP und 30 mM HEPES (pH 7,2, angepasst mit CsOH) vor.
      HINWEIS: Cs+ blockiert spannungsabhängige K-Kanäle und verbessert die Raumklemmbedingungen bei entfernten Dendriten durch Erhöhung der Längenkonstante. Gemessener osmotischer Druck beträgt 285 mOsm/kg.
    3. Bereiten Sie 200 L Aliquots der Lösungen vor und lagern Sie sie bei -30 °C.

2. Gehirnsektion und Trimmen

  1. Kühlen und sauerstoffhaltigen zwei 50 ml Becher von ACSF auf Eis, bis die Temperatur unter 4 °C liegt. Fügen Sie 50 l Tetrodotoxin (TTX, 1 mM) in einen der eiskalten Becher von ACSF ein und reservieren Sie ihn für scheibenschneidende Scheiben. Um Maus-Kleinhirnscheibe zu erhalten, die ltd-induzierende Fähigkeit vorbehält, ist die Zugabe von TTX zum normalen ACSF notwendig.
  2. Kühlen Sie die Metall-Probenschale ab, indem Sie einen Eisbadbereich der Schneidkammer mit Eis füllen.
  3. Gießen Sie 1 ml Isofluran in ein Anästhesisierungsglas(ca.1000 ml) und legen Sie dann eine Maus für 30–45 s hinein. Stellen Sie sicher, dass die Maus tief beästhebt ist, indem Sie ihre Unfähigkeit bestätigen, auf mechanische Stimulation zu reagieren.
  4. Enthaupten Sie die Maus mit einer chirurgischen Schere. Halten Sie den Kopf und schneiden Sie die oberflächliche Haut entlang der Mittellinie mit einer ophthalmologischen Schere. Ziehen Sie die Haut, indem Sie mit den Fingern halten, um die Schädeloberfläche weit zu belichten.
  5. Schneiden Sie den Schädel horizontal entlang einer Linie aus dem großen spinokerebellären Loch direkt über Ohr und Auge mit einer ophthalmologischen Schere. Schneiden Sie den Schädel entlang einer Linie über beiden Augen und entfernen Sie, um den Schädel zu isolieren.
  6. Schneiden Sie das Gehirn in der Mitte des Großhirns mit einem Skalpell, dann isolieren Sie den kaudalen Teil des Gehirns einschließlich des Kleinhirns vom Schädel. Tauchen Sie es in einen eiskalten Becher von ACSF ein. Normalerweise sollte die Gesamtzeit von der Enthauptung bis zum Eintauchen des Hirnblocks in das vorgekühlte Becherglas von ACSF weniger als 60 s betragen.
  7. Die Position der sprudelnden Schläuche sollte so eingestellt werden, dass der Hirnblock im Becher nicht umgerührt wird. Mechanische Schäden können während der Aufnahme zu Schwellungen der Scheibe führen. Lassen Sie es für mindestens 7 min und lassen Sie das Gehirn abkühlen.
  8. Um den Hirnblock zu schneiden, schneiden Sie ein rechteckiges Agarstück (2 cm x 2 cm) von einer großen Agarplatte (4 cm x 10 cm, bei 4 °C gelagert) und legen Sie es auf ein Filterpapier, um die überschüssige Flüssigkeit zu absorbieren.
  9. Drehen Sie das Agarstück auf dem Filterpapier auf den Kopf, und legen Sie das Agarstück dann auf ein Filterpapier auf ein vorgekühltes Metallprobenfach (16 cm x 20 cm). Nehmen Sie den Gehirnblock mit einem Spachtel und absorbieren übermäßige Flüssigkeit um sie herum mit einem Stück Filterpapier.
  10. Montieren Sie den Hirnblock mit Kleber (medizinischer Cyanoacrylat-Sofortkleber) auf den Agarblock. Achten Sie darauf, den Boden (ventrale Seite) des Hirnblocks an den Agar zu befestigen.
  11. Schneiden Sie die rechte Hemisphäre mit einer Klinge aus. Stellen Sie sicher, dass die Seite der Schnittebene so parallel wie möglich zur dendritischen Ebene des PCs verläuft, da diese Seite an der Oberfläche der Probenschale befestigt ist. Schneiden und entfernen Sie die andere Seite der Hemisphäre. Dann schneiden Sie das Gehirn zwischen dem überlegenen und dem minderwertigen Colliculi und schneiden Sie das Rückenmark ab.
  12. Kleben Sie die rechte Seite des getrimmten Kleinhirns mit dem Agarblock auf das vorgekühlte Probentablett. Überschüssigen Kleber mit dem flachen Teil eines Spachtels um das Kleinhirn verteilen, um zu verhindern, dass überschüssiger Kleber an der Kleinhirnoberfläche befestigt wird. Neigen Sie das Metalltablett und gießen Sie ACSF, um den Kleber zu fixieren und den überschüssigen Kleber wegzuwaschen.

3. Gehirn-Slicing

  1. Richten Sie die Probe so aus, dass sich die Dorsalseite des Kleinhirns auf der Vorderseite befindet. Gießen Sie eiskaltes Schneiden ACSF, mit 1 M TTX, ausreichend, um das Kleinhirn vollständig einzutauchen. Legen Sie eine Gasröhre in den ACSF und beginnen Sie mit dem Gasgemisch O2/CO2 zu sprudeln.
  2. Entfernen Sie die Arachnoide Mater mit einer feinen Pinzette unter dem Fernglas. Schneiden Sie den Kleinhirn-Pedunkel mit einer Klinge, und entfernen Sie das Hirnstamm und Agar-Block. Drehen Sie das Tablett um 180°, so dass die dorsale Oberfläche des Kleinhirns einer Rasierklinge gegenübersteht.
  3. Stellen Sie die Klinge ein, und passen Sie die erste Schnittposition an. Stellen Sie die Vibratome-Slicing-Parameter auf Folgendes ein: Amplitude auf 5,5, Frequenz auf 85 Hz, Geschwindigkeit auf 3–4 und Scheibendicke auf 300 m.
  4. Die Kleinhirnscheibe auf einem Nylonnetz in einen Acryl-Inkubator übertragen und vollständig in den sauerstoffreichen ACSF eintauchen. Der Inkubator sollte in ein Wasserbad gelegt werden, das eine Temperatur bei 26 °C hält.
  5. Bewahren Sie die Scheiben mindestens 1 h auf, um die Wiederherstellung des Schadens während des Schneidens zu ermöglichen.

4. Ganzzellige Patch-Clamp-Aufnahme

HINWEIS: Eine Patch-Clamp-Aufzeichnung erfordert folgendes Gerät: ein aufrechtes Mikroskop mit Infrarot-Differential-Interferenz-Kontrast (IR-DIC)-Optik, ein Patch-Clamp-Verstärker, Datendigitalisierer, Digitalstimulator, Isolator, Computer, Software zur Datenerfassung und Analyse, motorisierter Manipulator, Mikroskopplattform, Vibrationsisolationstisch, Faraday-Käfig, Lösungsheizung, Peristaltikpumpen und Elektrodenzieher.

  1. Fügen Sie Picrotoxin (0,1 mM) zu ACSF hinzu und lösen Sie es mit Ultraschall für 3 min.
  2. Durchdringen Sie eine Aufnahmekammer mit Picrotoxin-haltigen,O2-CO2-gesättigten ACSF mit einer Rate von 2 ml/min. Halten Sie die Temperatur der Aufnahmekammer bei ca. 30 °C.
  3. Machen Sie eine Aufnahmeelektrode, indem Sie eine Borosilikatglaskapillare mit Filament (Außendurchmesser = 1,5 mm) mit einem Abzieher mit 4 Schritten ziehen. Der Spitzendurchmesser sollte etwa 1 m betragen.
  4. Machen Sie eine stimulierende Elektrode, indem Sie die gleiche Kapillare mit dem Puller mit 2 Schritten ziehen, dann brechen, um eine feine Spitze zu produzieren, indem Sie die Spitze gegen einen Eisenblock unter einem Binokularmikroskop schlagen. Der endgültige Durchmesser sollte 3–5 m betragen.
  5. Übertragen Sie die Kleinhirnscheibe in die Aufnahmekammer und fixieren Sie sie mit einem Pt-Gewicht mit Nylonfäden. Füllen Sie eine stimulierende Elektrode mit ACSF.
  6. Zur Stimulation der PFs legen Sie die stimulierende Elektrode auf die Oberfläche der Molekülschicht, etwa 50 m von der Purkinje-Zellschicht entfernt.
  7. Zur Stimulation des CF die stimulierende Elektrode an der Unterseite der Purkinje-Zellschicht (Schritte 5.3, 5.4) platzieren.
  8. Filter K+-basiert oder Cs+-basierte interne Lösung mit einem 0,45-m-Filter. Verwenden Sie einen Mikrolader, um eine Aufnahmeelektrode mit 8 L interner Lösung zu füllen.
  9. Wenden Sie einen schwachen positiven Druck auf die Aufnahmeelektrode an, bevor Sie sie in den ACSF eintauchen. Sein Widerstand sollte 2–4 Mio. betragen und das flüssige Anschlusspotential korrigiert werden.
  10. Nähern Sie sich dem gesunden, hellen Zellkörper des PCs mit der Aufnahmeelektrode. Drücken Sie die Oberfläche der Purkinje-Zelle leicht, stoppen Sie die Anwendung von positivem Druck, als nächstes unterdruck, bis eine Giga-Ohm-Dichtung bilden. Richten Sie dann die Ganzzellenkonfiguration unter Negativem Druck ein.
  11. Halten Sie das Membranpotential bei -70 mV und wenden Sie -2 mV Puls (Dauer, 100 ms) bei 0,1 Hz an, um Eingangswiderstand, Reihenwiderstand und Eingangskapazität kontinuierlich zu überwachen. Verwenden Sie nicht die Widerstandskompensation der Serie. Verwerfen Sie Daten, wenn der Serienwiderstand um mehr als 15 % variiert.

5. Induktion von LTD

  1. Stimulieren Sie die molekulare Schicht mit einem Puls (Dauer, 0,1 ms). Identifizieren Sie die PF-exzitatorischen postsynaptischen Ströme (EPSC) durch Anwendung eines Doppelpulsreizes (Interspike-Intervall (ISI) von 50 ms). Das PF-EPSC sollte gepaarte Pulserleichterungen und eine allmähliche Erhöhung der Amplitude im Verhältnis zur Erhöhung der Stimulationsintensität aufweisen.
  2. Zeichnen Sie das Testverhalten des PF-EPSC auf, indem Sie einen einzigen Impuls bei 0,1 Hz anwenden. Passen Sie die Intensität des Stimulus so an, dass die evozierte EPSC-Amplitude etwa 200 pA beträgt. Vermeiden Sie eine Verunreinigung des Stroms durch den spannungsabhängigen Ionenkanal.
  3. Stimulieren Sie das CF am unteren Rand der Purkinje-Zellschicht, und identifizieren Sie das EPSC, das durch die CF-Aktivierung ausgelöst wird (durch Anwendung eines Doppelpulsreizs). Der CF-EPSC sollte eine gepaarte Pulsdepression und eine Alles-oder-Nichts-Manier entsprechend der Erhöhung der Stimulationsintensität aufweisen. Für die LTD-Induktion sollte ein einziger Stimulus verwendet werden.
  4. LTD-induzierendes Protokoll 1
    1. Mit einer Elektrode, die K+-basierte interne Lösung unter Stromklemmenbedingungen enthält, wenden Sie einen einzelnen PF-Stimulus und einen einzelnen CF-Stimulus gleichzeitig bei 1 Hz für 5 min (300 Impulse) an (Abbildung 1A).
  5. LTD-induzierendes Protokoll 2
    1. Mit einer elektrodenhaltigen K+-basierten internen Lösung unter Stromklemmenbedingungen doppelPF-Stimuli (ISI von 50 ms) und einzelnen CF-Stimulus anwenden, da der zweite PF-Stimulus mit CF-Stimuli bei 1 Hz für 5 min zusammenfällt(Abbildung 1B).
  6. LTD-induzierendes Protokoll 3
    1. Mit einer Elektroden, die Cs+-basierte interne Lösung unter Spannungsklemmenbedingungen enthält, einen doppelten PF-Stimulus (ISI von 50 ms) und einen einzelnen depolarisierenden Spannungsschritt (-70 bis 0 mV, 50 ms) auf das Soma bei 1 Hz für 3 min auftragen, so dass der zweite PF-Stimulus entspricht dem Beginn des depolarisierenden Spannungsschritts (Abbildung 1C).
  7. LTD-induzierendes Protokoll-4
    1. Mit einer Elektrode, die Cs+-basierte interne Lösung unter Spannungsklemmenbedingungen enthält, die PF-Stimuli (5x bei 100 Hz) und einen einzelnen depolarisierenden Spannungsschritt (-70 bis 0 mV, 50 ms) gleichzeitig auf das Soma bei 0,5 Hz auftragen (Abbildung 1D ).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Vier Protokolle wurden in dieser Studie verwendet, um Kleinhirn-LTD zu induzieren. In den ersten beiden Protokollen (Protokoll 1 und 2) wurde die Konjunktion der PF-Stimulation und der CF-Stimulation unter stromlastigen Bedingungen angewendet. In den beiden anderen Protokollen (Protokoll 3 und 4) wurde die somatische Depolarisation durch die CF-Stimulation unter Spannungsklemme ersetzt. Spannungsspuren oder Stromspuren bei der Konjunktivstimulation wurden verglichen (Abbildung 2).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Unterschiede zwischen den vier Protokollen

In den LTD-induzierenden Protokollen 1 und 2 reicht Cjs 300 mal bei 1 Hz aus, um Kleinhirn-LTD zu induzieren. Die Stimulationshäufigkeit des CF schien sich in einem physiologischen Bereich zu befinden, da die komplexe Spike-Feuerrate bei alarmierten erwachsenen Mäusen (P60) 1,25 Hz36betrug. Die CF-Stimulation allein verursachte jedoch keine langfristige Plastizität in der PF-CF-Synapse, wie sie in den Protokollen 1 und 2 (

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Wir danken A. Oba für ihre technische Hilfe. Diese Forschung wurde teilweise durch Grant-in-Aid for Scientific Research (C) 17K01982 an K.Y. unterstützt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
VerstärkerMolecular Devices-AxonMulticlamp 700B
Borosilikatglas KapillareSutterBF150-110-10
DigitizerMolecular Devices-AxonDigidata1322A
ElektrodenabzieherSutterModell P-97
IsofluranFUJIFILM Wako Pure Chemical26675-46-7
IsolatorA.M.P.I.ISOflex
LinearschneiderDosaka EMPRO7N
MikroskopNIKONEclipse E600FN
SchlauchpumpeGilsonMP1 Einkanalpumpe
PicrotoxinSigma-AldrichP1675
ReinwasserbereiterMerck-MilliporeMilliQ 7000
Software für ExperimenteMolekularsonde-AxonpClamp 10
Software für StatistikKyensLabKyPlot 5.0
StimulatorWPIDS8000
TemperaturreglerWarnerTC-324B
TetrodotoxinTocris1078

Referenzen

  1. Eccles, J. C., Ito, M., Szentagothai, J. The Cerebellum as a Neuronal Machine. , Springer. New York. (1967).
  2. Marr, D. A theory of cerebellar cortex. Journal of Physiology. 202 (2), 437-470 (1969).
  3. Albus, J. S. Theory of cerebellar function. Mathematical Biosciences. 10 (1), 25-61 (1971).
  4. Maekawa, K., Simpson, J. I. Climbing fiber responses evoked in vestibulocerebellum of rabbit from visual system. Journal of Neurophysiology. 36 (4), 649-666 (1973).
  5. Ito, M., Shiida, T., Yagi, N., Yamamoto, M. Visual influence on rabbit horizontal vestibulo-ocular reflex presumably effected via the cerebellar flocculus. Brain Research. 65 (1), 170-174 (1974).
  6. Ghelarducci, B., Ito, M., Yagi, N. Impulse discharge from flocculus Purkinje cells of alert rabbits during visual stimulation combined with horizontal head rotation. Brain Research. 87 (1), 66-72 (1975).
  7. Robinson, D. A. Adaptive gain control of vestibulo-ocular reflex by the cerebellum. Journal of Neurophysiology. 39 (5), 954-969 (1976).
  8. Gilbert, P. F. C., Thach, W. T. Purkinje cell activity during motor learning. Brain Research. 128 (2), 309-328 (1977).
  9. Ito, M., Sakurai, M., Tongroach, P. Climbing fibre induced depression of both mossy fibre responsiveness and glutamate sensitivity of cerebellar Purkinje cells. Journal of Physiology. 324, 113-134 (1982).
  10. Ito, M., Kano, M. Long-lasting depression of parallel fiber-Purkinje cell transmission induced by conjunctive stimulation of parallel fibers and climbing fibers in the cerebellar cortex. Neuroscience Letters. 33 (3), 253-258 (1982).
  11. Ekerot, C. F., Kano, M. Long-term depression of parallel fibre synapses following stimulation of climbing fibres. Brain Research. 342 (2), 357-360 (1985).
  12. Sakurai, M. Synaptic modification of parallel fibre-Purkinje cell transmission in in vitro guinea-pig cerebellar slices. Journal of Physiology. 394, 462-480 (1987).
  13. Hirano, T. Depression and potentiation of the synaptic transmission between a granule cell and a Purkinje cell in rat cerebellar culture. Neuroscience Letters. 119 (2), 141-144 (1990).
  14. Linden, D. J. A long-term depression of AMPA currents in cultured cerebellar purkinje neurons. Neuron. 7 (1), 81-89 (1991).
  15. Linden, D. J., Connor, J. A. Participation of postsynaptic PKC in cerebellar long-term depression in culture. Science. 254 (5038), 1656-1659 (1991).
  16. Ito, M. Cerebellar long-term depression: characterization, signal transduction and functional roles. Physiological Reviews. 81 (3), 1143-1195 (2001).
  17. Ito, M. The molecular organization of cerebellar long-term depression. Nature Reviews Neuroscience. 3, 896-902 (2002).
  18. Ito, M., Jastreboff, P. J., Miyashita, Y. Specific effects of unilateral lesions in the flocculus upon eye movements in albino rabbits. Experimental Brain Research. 45 (1-2), 233-242 (1982).
  19. Nagao, S. Effects of vestibulocerebellar lesion upon dynamic characteristics and adaptation of vestibulo-ocular and optokinetic responses in pigmented rabbits. Experimental Brain Research. 53 (1), 36-46 (1983).
  20. Watanabe, E. Neuronal events correlated with long-term adaptation of the horizontal vestibulo-ocular reflex in the primate flocculus. Brain Research. 297 (1), 169-174 (1984).
  21. van Neerven, J., Pompeiano, O., Collewijn, H. Effects of GABAergic and noradrenergic injections into the cerebellar flocculus on vestibulo-ocular reflexes in the rabbit. Progress in Brain Research. 88, 485-497 (1991).
  22. Ito, M. Mechanism of motor learning in the cerebellum. Brain Research. 886, 237-245 (2000).
  23. De Schutter, E. Cerebellar long-term depression might normalize excitation of Purkinje cells: a hypothesis. Trends in Neurosciences. 18 (7), 291-295 (1995).
  24. Hansel, C., Linden, D. J. Long-term depression of the cerebellar climbing fiber-Purkinje neuron synapse. Neuron. 26 (2), 473-482 (2000).
  25. Safo, P., Regehr, W. G. Timing dependence of the induction of cerebellar LTD. Neuropharmacology. 54 (1), 213-218 (2007).
  26. Schonewille, M., et al. Reevaluating the role of LTD in cerebellar motor learning. Neuron. 70 (1), 43-500 (2011).
  27. Karachot, L., Kado, T. R., Ito, M. Stimulus parameters for induction of long-term depression in in vitro rat Purkinje cells. Neuroscience Research. 21 (2), 161-168 (1994).
  28. Hartell, N. A. Induction of cerebellar long-term depression requires activation of glutamate metabotropic receptors. Neuroreport. 5, 913-916 (1994).
  29. Aiba, A., et al. Deficient cerebellar long-term depression and impaired motor learning in mGluR1 mutant mice. Cell. 79, 377-388 (1994).
  30. Steinberg, J. P., et al. Targeted in vivo mutations of the AMPA receptor subunit GluR2 and its interacting protein PICK1 eliminate cerebellar long-term depression. Neuron. 46 (6), 845-860 (2006).
  31. Koekkoek, S. K., et al. Deletion of FMR1 in Purkinje cells enhances parallel fiber LTD, enlarges spines, and attenuates cerebellar eyelid conditioning in Fragile X syndrome. Neuron. 47 (3), 339-352 (2005).
  32. Yamaguchi, K., Itohara, S., Ito, M. Reassessment of long-term depression in cerebellar Purkinje cells in mice carrying mutated GluA2 C terminus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (36), 10192-10197 (2016).
  33. De Schutter, E., Bower, J. M. An active membrane model of the cerebellar Purkinje cell II. Simulation of synaptic responses. Journal of Neurophysiology. 71 (1), 401-419 (1994).
  34. Swensen, A. M., Bean, B. Ionic mechanisms of burst firing in dissociated Purkinje neurons. Journal of Neuroscience. 23 (29), 9650-9663 (2003).
  35. Fukuda, J., Kameyama, M., Yamaguchi, K. Breakdown of cytoskeletal filaments selectively reduces Na and Ca spikes in cultured mammal neurones. Nature. 294 (5836), 82-85 (1981).
  36. Arancillo, M., White, J. J., Lin, T., Stay, T. L., Silltoe, R. V. In vivo analysis of Purkinje cell firing properties during postnatal mouse development. Journal of Neurophysiology. 113, 578-591 (2015).
  37. Ishikawa, T., Shimuta, M., Häusser, M. Multimodal sensory integration in single cerebellar granule cell in vivo. eLife. 4, e12916(2015).
  38. Tempia, F., Minlaci, M. C., Anchisi, D., Strata, P. Postsynaptic current mediated by metabotropic glutamate receptors in cerebellar Purkinje cells. Journal of Neurophysiology. 80, 520-528 (1998).
  39. Wang, S. S., Denk, W., Häusser, M. Coincidence detection in single dendritic spines mediated by calcium release. Nature Neuroscience. 3, 1266-1273 (2000).
  40. Kuroda, S., Schweighofer, N., Kawato, M. Exploration of signal transduction pathways in cerebellar long-term depression by kinetic simulation. Journal of Neuroscience. 21 (15), 5693-5702 (2001).
  41. Wang, W., et al. Distinct cerebellar engrams in short-term and long-term motor learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), E188-E193 (2014).
  42. Inoshita, T., Hirano, T. Occurrence of long-term depression in the cerebellar flocculus during adaptation of optokinetic response. eLife. 27, 36209(2018).
  43. Belmeguenai, A., et al. Intrinsic plasticity complements long-term potentiation in parallel fiber input gain control in cerebellar Purkinje cells. Journal of Neuroscience. 30 (41), 13630-13643 (2010).
  44. Ohtsuki, G., Piochon, C., Adelman, J. P., Hansel, C. SK2 channel modulation contributes to compartment specific dendritic plasticity in cerebellar Purkinje cells. Neuron. 75, 108-120 (2012).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Tags

Patch-ClampParallelfasernPurkinje-ZellenKletterfasernVibratom-SchnitttechnikACSF-PerfusionTetrodotoxin-ApplikationPicrotoxin-Behandlung
Bewertung der Langzeit-Depressionsinduktion bei erwachsenen Cerebellarscheiben
Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.