Presynapse Formation Assay mit Presynapse Organizer Perlen und "Neuron Ball" Kultur

Shumaia Parvin; Renoma Takeda; Yukio Sasaki

doi:10.3791/59893

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Methodenartikel

Presynapse Formation Assay mit Presynapse Organizer Perlen und "Neuron Ball" Kultur

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DOI:

10.3791/59893

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2. August 2019

Shumaia Parvin¹ , Renoma Takeda¹ , Yukio Sasaki¹

¹Functional Structure Biology Laboratory, Department of Medical Life Science, Yokohama City University Graduate School of Medical Life Science

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Presynapse Bildung ist ein dynamischer Prozess einschließlich der Ansammlung von synaptischen Proteinen in der richtigen Reihenfolge. Bei dieser Methode wird die Präsynapsebildung durch Perlen ausgelöst, die mit einem präsynapsischen Organizerprotein auf axonalen Blättern der "Neuronball"-Kultur konjugiert werden, so dass die Ansammlung synaptischer Proteine während der Präsynapsebildung leicht zu analysieren ist.

Zusammenfassung

Während der neuronalen Entwicklung ist die Synapsenbildung ein wichtiger Schritt, um neuronale Schaltkreise zu etablieren. Um Synapsen zu bilden, müssen synaptische Proteine in geeigneter Reihenfolge durch Transport von Zellkörpern und/oder lokale Übersetzung in unreife Synapsen geliefert werden. Jedoch, Es ist nicht vollständig verstanden, wie synaptische Proteine in Synapsen in der richtigen Reihenfolge ansammeln. Hier stellen wir eine neuartige Methode zur Analyse der präsynaptischen Bildung vor, indem wir die Kombination von Neuronenballkultur mit Perlen verwenden, um die Präsynapsebildung zu induzieren. Neuronenkugeln, die neuronale Zellaggregate sind, liefern axonale Blätter weit weg von Zellkörpern und Dendriten, so dass schwache fluoreszierende Signale von Präsynapsen erkannt werden können, indem überwältigende Signale von Zellkörpern vermieden werden. Als Perlen, um die präsynapsische Bildung auszulösen, verwenden wir Perlen, die mit Leucin-reichem Repeat-Transmembran-Neuronal 2 (LRRTM2), einem exzitatorischen präsynaptischen Organisator, konjugiert sind. Mit dieser Methode haben wir gezeigt, dass vesikulärer Glutamattransporter 1 (vGlut1), ein synaptisches Vesikelprotein, sich in Präsynapsen schneller angesammelt hat als Munc18-1, ein Wirkstoffzonenprotein. Munc18-1 akkumulierte auch nach dem Entfernen von Zellkörpern übersetzungsabhängig in Presynapse. Dieser Befund deutet auf die Munc18-1 Akkumulation durch lokale Übersetzung in Axonen hin, nicht durch Transport von Zellkörpern. Zusammenfassend ist diese Methode geeignet, die Ansammlung von synaptischen Proteinen in Präsynapsen und quelle von synaptischen Proteinen zu analysieren. Da die Neuronenballkultur einfach ist und es nicht notwendig ist, spezielle Geräte zu verwenden, könnte diese Methode auf andere experimentelle Plattformen anwendbar sein.

Einleitung

Synapse-Bildung ist einer der kritischen Schritte bei der Entwicklung von neuronalen Schaltkreisen¹^,²^,³. Die Bildung von Synapsen, die spezialisierte Kompartimente sind, die aus Prä- und Post-Synapsen bestehen, ist ein komplexer und mehrstufiger Prozess, der eine angemessene Erkennung von Axonen und Dendriten, die Bildung von aktiver Zone und postsynaptischen Dichte und die richtige Ausrichtung der Ionenkanäle und Neurotransmitter-Rezeptoren¹^,². In jedem Prozess akkumulieren viele Arten von synaptischen Proteinen in d....