Methodenartikel

Presynapse Formation Assay mit Presynapse Organizer Perlen und "Neuron Ball" Kultur

DOI:

10.3791/59893

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2. August 2019

 ,  , 
1Functional Structure Biology Laboratory, Department of Medical Life Science, Yokohama City University Graduate School of Medical Life Science

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Presynapse Bildung ist ein dynamischer Prozess einschließlich der Ansammlung von synaptischen Proteinen in der richtigen Reihenfolge. Bei dieser Methode wird die Präsynapsebildung durch Perlen ausgelöst, die mit einem präsynapsischen Organizerprotein auf axonalen Blättern der "Neuronball"-Kultur konjugiert werden, so dass die Ansammlung synaptischer Proteine während der Präsynapsebildung leicht zu analysieren ist.

Zusammenfassung

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Während der neuronalen Entwicklung ist die Synapsenbildung ein wichtiger Schritt, um neuronale Schaltkreise zu etablieren. Um Synapsen zu bilden, müssen synaptische Proteine in geeigneter Reihenfolge durch Transport von Zellkörpern und/oder lokale Übersetzung in unreife Synapsen geliefert werden. Jedoch, Es ist nicht vollständig verstanden, wie synaptische Proteine in Synapsen in der richtigen Reihenfolge ansammeln. Hier stellen wir eine neuartige Methode zur Analyse der präsynaptischen Bildung vor, indem wir die Kombination von Neuronenballkultur mit Perlen verwenden, um die Präsynapsebildung zu induzieren. Neuronenkugeln, die neuronale Zellaggregate sind, liefern axonale Blätter weit weg von Zellkörpern und Dendriten, so dass schwache fluoreszierende Signale von Präsynapsen erkannt werden können, indem überwältigende Signale von Zellkörpern vermieden werden. Als Perlen, um die präsynapsische Bildung auszulösen, verwenden wir Perlen, die mit Leucin-reichem Repeat-Transmembran-Neuronal 2 (LRRTM2), einem exzitatorischen präsynaptischen Organisator, konjugiert sind. Mit dieser Methode haben wir gezeigt, dass vesikulärer Glutamattransporter 1 (vGlut1), ein synaptisches Vesikelprotein, sich in Präsynapsen schneller angesammelt hat als Munc18-1, ein Wirkstoffzonenprotein. Munc18-1 akkumulierte auch nach dem Entfernen von Zellkörpern übersetzungsabhängig in Presynapse. Dieser Befund deutet auf die Munc18-1 Akkumulation durch lokale Übersetzung in Axonen hin, nicht durch Transport von Zellkörpern. Zusammenfassend ist diese Methode geeignet, die Ansammlung von synaptischen Proteinen in Präsynapsen und quelle von synaptischen Proteinen zu analysieren. Da die Neuronenballkultur einfach ist und es nicht notwendig ist, spezielle Geräte zu verwenden, könnte diese Methode auf andere experimentelle Plattformen anwendbar sein.

Einleitung

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Synapse-Bildung ist einer der kritischen Schritte bei der Entwicklung von neuronalen Schaltkreisen1,2,3. Die Bildung von Synapsen, die spezialisierte Kompartimente sind, die aus Prä- und Post-Synapsen bestehen, ist ein komplexer und mehrstufiger Prozess, der eine angemessene Erkennung von Axonen und Dendriten, die Bildung von aktiver Zone und postsynaptischen Dichte und die richtige Ausrichtung der Ionenkanäle und Neurotransmitter-Rezeptoren1,2. In jedem Prozess akkumulieren viele Arten von synaptischen Proteinen in diesen speziellen Fächern im richtigen Timing, indem sie synaptische Proteine aus Zellkörpern und/oder durch lokale Übersetzung in den Kompartimenten transportieren. Diese synaptischen Proteine gelten als organisiert angeordnet, um funktionelle Synapsen zu bilden. Dysfunktion einiger synaptischer Proteine mit Synapsenbildung führt zu neurologischen Erkrankungen4,5. Es bleibt jedoch unklar, wie sich synaptische Proteine im richtigen Timing ansammeln.

Um zu untersuchen, wie sich synaptische Proteine in organisierter Weise ansammeln, ist es notwendig, die Ansammlung synaptischer Proteine in chronologischer Reihenfolge zu untersuchen. Einige Berichte zeigten Live-Bildgebung, um synapsische Bildung in dissoziierten Kultur der Neuronen zu beobachten6,7. Es ist jedoch zeitaufwändig, Neuronen zu finden, die gerade die Synapsenbildung unter der Mikroskopie beginnen. Um die Ansammlung synaptischer Proteine effizient zu beobachten, muss die Synapsenbildung zu dem Zeitpunkt beginnen, zu dem Forscher die Bildung induzieren wollen. Die zweite Herausforderung besteht darin, die Ansammlung synaptischer Proteine durch den Transport von Zellkörpern oder die lokale Übersetzung in Synapsen zu unterscheiden. Zu diesem Zweck ist die Translationsebene unter der Bedingung zu messen, dass der Transport von synaptischen Proteinen aus Zellkörpern nicht erlaubt ist.

Wir entwickelten neuartigen Presynapse-Formationstest mit Kombination von Neuronenballkultur mit Perlen, um die Präsynapsebildung zu induzieren8. Neuronenkugelkultur wurde entwickelt, um axonalen Phänotyp zu untersuchen, aufgrund der Bildung von axonalen Blättern um Zellkörper9,10. Wir verwendeten magnetische Perlen konjugiert mit Leucin-reichen Wiederholungtransmembran neuronal 2 (LRRTM2), die ein präsynaptischer Organisator ist, um erregende Präsynapsen zu induzieren (Abbildung 1A)11,12,13. Durch die Verwendung der LRRTM2-Perlen beginnt die Präsynapsebildung zu dem Zeitpunkt, zu dem die Perlen aufgetragen werden. Dies bedeutet, dass die Präsynapsebildung in Tausenden von Axonen eines Neuronenballs zu gleichen Zeiten beginnt, so dass es ermöglicht, den genauen Zeitverlauf der Ansammlung synaptischer Proteine effizient zu untersuchen. Darüber hinaus ist die Neuronenkugelkultur einfach, den Transport synaptischer Proteine aus dem Soma zu blockieren, indem Zellkörper entfernt werden (Abbildung 1B)8. Wir haben bereits bestätigt, dass Axone ohne Zellkörper überleben können und mindestens 4 h nach Entfernung von Zellkörpern gesund sind. Daher ist dieses Protokoll geeignet, um zu untersuchen, woher synaptische Proteine abgeleitet werden (Zellkörper oder Axon), und wie sich synaptische Proteine organisiert ansammeln.

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Protokoll

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Die in diesem Manuskript beschriebenen Experimente wurden gemäß den Richtlinien durchgeführt, die im Institutional Animal Care and Use Committee der Yokohama City University beschrieben wurden.

1. Vorbereitung von Neuronenkugeln als hängende Tropfenkultur (Tage in vitro (DIV) 0-3)

HINWEIS: Die hier beschriebenen Verfahren zur Vorbereitung der Neuronenkugelkultur basieren auf der Methode, die zuvor von der Sasaki-Gruppe mit einigen Modifikationen9,10berichtet wurde. Wir haben auch mehrere Verfahren aus der Banker-Methode für die dissoziierte Kultur14angenommen.

  1. Bestätigen der folgenden Punkte vor Beginn der Zerlegung
    1. Bereiten Sie alle erforderlichen Lösungen vor und sterilisieren Sie sie durch Autoklav/Filtration im Voraus.
    2. Halten Sie bereit alle Instrumente und Materialien in jedem Schritt dieser kortikalen Neuronenkultur verwendet werden.
    3. Sprühen und wischen Sie den laminaren Luftstromschrank, den Seziertisch, die Bühnenplatte des Stereomikroskops, die Schere und die Zange mit 70 % Ethanol.
  2. Euthanisieren Sie die Maus nach Anwendung von CO2 und sezieren Sie den Bauch, um E16-Embryonen zu erhalten.
  3. Entfernen Sie die Gehirne von Embryonen sorgfältig mit Hilfe von feinen Spitzen der Zange und übertragen Sie sie in 60 mm Zellkulturschalen mit 4 ml HEPES Buffered Salt Solution (HBSS).
    HINWEIS: Das Seziermedium HBSS enthält 10 mM HEPES (pH 7.4), 140 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1,09 mM Na2HPO4, 1,1 mM KH2PO4, 5,6 mM D-Glucose und 5,64 mM Phenolrot.
  4. Entfernen Sie die Kopfhaut, schneiden Sie die Olfaktorinde, trennen Sie Die Kortiken von jeder zerebralen Hemisphäre mit den feinen Spitzen der Zange unter Stereomikroskop, und übertragen Sie auf weitere 60 mm Gerichte, die frische HBSS enthalten. Verwenden Sie mindestens 3-5 Embryonen für jede einzelne Neuronenkugelkultur.
  5. Schneiden Sie die Kortiken in kleine Stücke mit mikrosezierenden Federscheren in einer laminaren Flow Cell Culture Kapuze.
  6. Hackfleischkortikin in ein 15 ml-Rohr geben und die gehackten Kortices in 4 ml 0,125% Trypsin in HBSS für 4,5 min in einem Wasserbad bei 37 °C versuchen.
    HINWEIS: Diese Trypsinisierungszeit ist entscheidend für eine effiziente Neuronenkultur, da die zunehmende Zeit (> 4,5 min) zu viel mehr toten Neuronen führt.
  7. Übertragen Sie die Zellaggregate durch eine sterile Transferpipette in ein neues 15 ml-Rohr mit 10 ml HBSS und inkubieren Sie 5 min bei 37 °C. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal.
  8. Übertragen Sie die Zellaggregate in ein neues 15 ml-Rohr, das 2 ml neurobasale Medien enthält, die GlutaMax, B27-Ergänzung (NGB-Medium), 0,01% DNase I und 10% Pferdeserum enthalten.
  9. Trituieren Sie die trypsinisierten Kortiken, indem Sie sie wiederholt (3-5 Mal) mit feuerpolierter Feinglas-Pasteurpipetette nach oben und unten pfeifen.
    HINWEIS: Durchmesser der feuerpolierten Feinglas Pasteur Pipette ist sehr wichtig, wie in der Banker-Methode Papier14beschrieben. Wenn die Pipette zu schmal ist, um Kortiken zu passieren, bereiten Sie Pipetten mit 2-3 verschiedenen Größen vor und versuchen Sie es mit einer größeren Pipette.
  10. Für die Vorbereitung von Neuronenkugeln nehmen Sie die oben genannte Zellsuspension und passen Sie die Zelldichte auf 1 x 106 Zellen/ml mit NGB-Medium an.
  11. Kultur die kortikalen Neuronen als hängende Tropfen mit 10.000 Zellen/Tropfen (1 Tropfen ist 10 l) in den oberen Deckeln von 10 cm Kulturgerichten.
  12. Fügen Sie 7 ml Phosphat gepufferte Saline (PBS) in den unteren Teil der Kulturgerichte, dann halten Sie in einem Inkubator für 3 Tage bei 37 °C mit 5% CO2 unter befeuchtetem Zustand, um Neuronkugelbildung zu ermöglichen.

2. Platzieren von Neuronenkugeln auf PLL-beschichteten Glasabdeckungen und Kulturpflege (DIV 3-11)

HINWEIS: Vor der Beschichtung von Glasabdeckungen mit Poly-L-Lysin (PLL) ist das Waschen der Abdeckungen mit Reinigungsmittel wichtig. Glasabdeckungen sind manchmal nicht so sauber für neuronale Kultur und gleichmäßige Beschichtung mit PLL. Eine ungleichmäßige PLL-Beschichtung kann zu einer ungleichmäßigen axonalen Ausdehnung von Neuronenkugeln führen.

  1. Die Abdeckungen in 1/20 verdünnten neutralen nichtphosphorhaltigen Reinigungsmitteln in Keramikregalen für 1-3 Übernachtungen einweichen.
  2. Die Deckelbeutel 8 Mal in Reinstwasser waschen und dann im Ofen bei 200 °C für 12 h sterilisieren.
    HINWEIS: Alle Schritte von hier müssen in einer laminaren Luftstromzellenkulturhaube durchgeführt werden.
  3. Backte Coverslips auf 100-mm-Gerichte übertragen. Nach dem Versiegeln der Schale durch Parafilm zwischen einem Deckel und einer Bodenschale können gebackene Abdeckungen für die langfristige Lagerung aufbewahrt werden.
  4. (Optional) Tragen Sie Paraffinpunkte auf die Abdeckungen auf. Die Punkte machen Platz, um zu verhindern, dass sich Neuronenkugeln während der Immunfärbung durch direkten Kontakt von Neuronenkugeln zu Plastikgeschirr von den Abdeckungen lösen. Paraffin in einer geeigneten Flasche in einem Warmwasserbad bei ca. 90 °C schmelzen. Tauchen Sie eine Pasteur Pipette in das Paraffin, dann schnell berühren, um drei Flecken in der Nähe der Kante eines Coverslip zu machen.
  5. PLL (MW > 300.000) mit PLL-Lösung (15 g/ml im Boratpuffer) auf die Paraffin-Perlenglas-Abdeckungen in 60-mm-Schalen aufschichten und mindestens 1 h in einem CO2-Inkubator aufbewahren.
  6. Nach dem 4-fachen Waschen mit PBS die PLL-beschichteten Abdeckungen auf eine 4-Well-Platte mit 350 L NGB-Medium in jedem Brunnen und Cytosin-D-Arabinofuranosidhydrochlorid (AraC, 3 m) auf die Medien übertragen, um teilende Zellen abzutöten.
  7. Bewahren Sie diese 4-Well-Platte mit den PLL-beschichteten Abdeckungen im CO2-Inkubator mindestens 20 min auf, um sicherzustellen, dass die Temperatur des Mediums 37 °C erreicht, bevor Neuronenkugeln übertragen werden.
  8. Bei DIV 3, wenn "Neuronenkugeln" sehr gut ausgebildet sind, übertragen Sie sie auf PLL-beschichtete Abdeckungen innerhalb der 4-Well-Platte (5 Neuronenkugeln/well), die im CO2-Inkubator aufbewahrt wird.
  9. Ersetzen Sie nach 48 h das Neuronenballkulturmedium durch ein frisches AraC-freies NGB-Medium. Verwenden Sie eine Kochplatte in einer laminaren Luftstromzellenkulturhaube, deren Temperatur unmittelbar vor diesem Eingriff bei 37 °C gehalten wird.
    HINWEIS: Es ist notwendig, das Medium so schnell wie möglich auf einer Kochplatte zu wechseln, um die Zeit zu reduzieren, die die Kulturen außerhalb des CO2-Inkubators sind.
  10. Bewahren Sie diese Neuronenballkultur im CO 2-Inkubator für bis zu DIV 11 auf.
    HINWEIS: Bei DIV 11-12 werden Neuronenkugeln, die Neuriten bis zu 1-2 mm ausdehnen, für Experimente verwendet.

3. Anwendung von LRRTM2-Perlen auf Neuronenballkultur mit oder ohne Zellkörper (DIV 11-12)

HINWEIS: Vor der Anwendung von LRRTM2 Perlen auf Neuron Kugelkultur, Es wird empfohlen, Zellkörper zu entfernen. Daher bereiten Sie zuerst LRRTM2 Perlen, dann entfernen Sie die Zellkörper und später verwenden LRRTM2 Perlen auf Kultur so früh wie möglich. Biotinylated LRRTM2 wird von der Nogi-Gruppe (Yokohama City University) als konditioniertes Medium zur Verfügung gestellt. Sie verwenden einen Expressionsvektor einschließlich Biotin-Akzeptorsequenz und Biotinligase aus E. coli (BirA) 15 , 16 biotin an LRRTM2 anzuhängen, und der Expressionsvektor wird in Expi293F-Zellen transfiziert, die im Expi293-Expressionssystem enthalten sind. Die Vektorinformationen sind in der ergänzenden Abbildung 1verfügbar. Biotinylierte LRRTM2-konjugierte Streptavidinperlen reduzierten den Hintergrund der Immunfärbung stark im Vergleich zu LRRTM2-Fc -konjugierten Protein-A-Perlen, die für Prototypen des LRRTM2-Systems 8 verwendet werden.

  1. Herstellung von biotinylierten LRRTM2 Perlen
    1. Um überschüssiges Biotin aus dem konditionierten Medium der Expi293F-Zellen zu entfernen, die biotinyliertes LRRTM2 exdrücken, wenden Sie 1,7 ml des konditionierten Mediums gemischt mit 0,8 ml PBS (insgesamt 2,5 ml) auf die PD-10-Gelfiltrationssäule auf. Die PD-10-Säule wird mit 25 ml Reinstwasser und 25 ml PBS vorausgeglichen.
    2. Elute mit 3,5 ml PBS und sammeln Sie den Durchfluss als LRRTM2-Bestand.
      HINWEIS: Dieser LRRTM2-Bestand kann langfristig an Aliquots abgegeben und bei -80 °C gelagert werden. Expressionsniveaus von biotinylierten LRRTM2 variieren manchmal von Los zu Los. Daher sollte das richtige Volumen des LRRTM2-Lagers, um die Perlen zu konjugieren, bestimmt werden, um Presynapsen genug auf Neuronenkugeln zu bilden, wenn neue Charge nLRRTM2-Bestand beim ersten Mal verwendet wird.
    3. Nehmen Sie 20 l von der Suspension von Streptavidin-beschichteten magnetischen Partikeln (Durchmesser: 4-5 m) zu einem Mikrozentrifugenrohr. Immobilisieren Sie die Perlen zu einem handgefertigten Gerät, das mit Neodym-Permanentmagneten befestigt ist, und waschen Sie dreimal mit 100 l PBS-MCBC in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhren.
      HINWEIS: PBS-MCBC enthält PBS einschließlich 5 mM MgCl2, 3 mM CaCl2, 0.1% BSA und 0.1% Complete EDTA-frei.
    4. Nachdem Sie PBS-MCBC vollständig aus den Perlen entfernt haben, fügen Sie den gewaschenen Perlen ein vorbestimmtes Volumen an LRRTM2-Lager (in der Regel 500-1.000 l, siehe Anmerkung 3.1.2) hinzu. Inkubieren Sie das Gemisch mit Rotator bei 4 °C für 1-2 h.
    5. Waschen Sie die Perlen zweimal mit 100 l PBS-MCBC und später mit 100 L NGB-Medium.
    6. Setzen Sie die LRRTM2-Perlen in 50 l NGB-Medium für die Anwendung auf die Neuronenballkultur aus.
    7. Verwenden Sie die gleichen Verfahren für die Vorbereitung der Kontrollperlen (Negativkontrolle) in einem anderen Mikrozentrifugenrohr außer zugabe von biotinylierten-LRRTM2-Proteinen.
  2. Entfernen von Zellkörpern aus Neuronenkugeln bei DIV 11-12 und Auftragen von LRRTM2-Perlen
    1. Beschriften Sie die Brunnen einer 4-Well-Platte als "Zellkörper (+)" und "Zellkörper (-)".
    2. Schneiden Sie das Ende einer gelben Spitze im 45°-Winkel mit einer Rasierklinge, die zuvor mit 70 % Ethanol unter Stereomikroskop besprüht wurde (Abbildung 1B).
    3. Setzen Sie das gelbe Spitzenende auf den Zellkörperbereich eines Neuronenballs und entfernen Sie die Zellkörper durch Absaugen (Abbildung 1B).
    4. Um jede angegebene Bedingung des Experiments zu identifizieren, kennzeichnen Sie die Brunnen erneut als "LRRTM2-Perlen" und "Kontrollperlen".
    5. Tragen Sie die LRRTM2 und Steuern Perlen auf Neuron Kugelkultur, und tauchen Sie auf der Unterseite der Platten für 1 min mit Ferrit-Magneten, um Presynapse-Bildung zu starten. Dieses Verfahren sorgt dafür, dass alle Perlen gleichzeitig touchdown. Insbesondere wäre es bei der kurzzeitigen Inkubation (z.B. 30 min und 1 h) mit LRRTM2 Perlen synchron wirksam.
    6. Um Zeit-Kurs-Experimente durchzuführen, beschriften Sie jeweils einen separaten Wert sowie 0 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h und 18 h und tragen LRRTM2-Perlen in den angegebenen Zeitintervallen auf.
    7. Nach dem Hinzufügen von LRRTM2 Perlen, inkubieren Sie die Neuronenballkultur mit den Perlen für die angegebene Zeit (0 min bis 18 h), um Presynapsen zu bilden.

4. Immunostainierung und Mikroskopie

HINWEIS: Fixieren Sie die Zellen für 4 h über Inkubation mit LRRTM2 Perlen in den experimentellen Bedingungen mit und ohne Zellkörper, da die Axone neigen dazu, allmählich in Abwesenheit von Zellkörpern nach 4 h zu sterben. Im Zeitverlauf mit LRRTM2-Perlen, fixieren Sie die Zellen zur angegebenen Zeit.

  1. Fixierung und Färbung von Neuronen in der Neuronenballkultur nach Präsynapsebildung mit LRRTM2-Perlen
    1. Entfernen Sie NGB-Medium und fixieren Sie die Neuronenkugeln mit 4% PFA in PBS (250 l/well) für 20 min bei Raumtemperatur, und waschen Sie dann mit 500 l PBS 4-mal pro 5 min.
    2. Waschen Sie die festen Zellen mit TBS (Tris-gepufferte Salin: 50 mM Tris-HCl (pH 7.3) und 150 mM NaCl) für mehr als 5 min.
    3. Permeabilisieren Sie die Zellen/Axone der Neuronenkugelkultur mit TBS, die 0,3% Triton X-100 für 5 min enthalten.
    4. Halten Sie die Zellen 1 h für die Blockierung mit Blockierpuffer (0,1% Triton X-100 und 5% NGS (normales Ziegenserum) in TBS).
    5. Inkubieren Sie die Zellen mit primären Antikörpern; Anti-Kaninchen-vGlut1 (vesikulärer Glutamattransporter 1 (1:4000)) und Anti-Maus-Munc18-1 (1:300) mit Antikörperverdünnungsmittel für die Nacht bei 4 °C verdünnt.
    6. Waschen Sie die Deckellipsen 4 mal mit Immunfluoreszenz (IF) Puffer (0,1% Triton X-100 und 2% BSA in TBS) und inkubieren für 30 min mit Fluorophor (Alexa Farbstoff)-konjugierten 2. Antikörpern; Anti-Maus-IgG-Alexa 555 (1:500), Anti-Kaninchen-IgG-Alexa 488 (1:1000).
    7. Stain die Kerne der Zellkörper der Neuronen für 5 min mit 4,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI, 1 g/ml) in PBS.
    8. Waschen Sie die Abdeckungen dreimal mit PBS und montieren Sie sie dann auf Glasschlitten mit Montagemedien, die 167 mg/ml Poly (Vinyl) Alkohol und 6 mg/ml N-Propylgallat enthalten.
    9. Bewahren Sie die Glasgletten bis zur Mikroskopie bei -20 °C im Kühlschrank auf. Fluoreszierende Signale der Glasschlitten sind mindestens 1 Jahr lang nachweisbar, wenn die Dias bei -20 °C gelagert werden.
  2. Aufnahme von Bildern unter Fluoreszenzmikroskop
    1. Erfassen Sie Differentialinterferenzkontraste und IF-Bilder unter einem invertierten Fluoreszenzmikroskop mit einer gekühlten CCD-Kamera mit 60-facher Öl-Tauchlinse. Verwenden Sie für die Bildaufnahmesoftware ein softwareinstalliertes Mikroskopsystem. Verwenden Sie Image J als Bildanalysesoftware.
    2. Messen Sie die IF-Intensität in Presynapsen im Axon mit der folgenden Formel; IF-Intensitäten der Region of Interest auf Perlen (ROI) – Off-Perlen-Regionsintensität/Axonalintensität entlang 20 m von Perlen – Hintergrundintensität. Diese Verhältnisintensität liefert einen Proteinakkumationsindex (Abbildung 4A). Führen Sie die Messungen auf originalen 16-Bit-Bildern mit der Image J-Software durch.
    3. Um den Akkumulationsgrad eines bestimmten Proteins in der mit LRRTM2-Perlen induzierten Präsynapse zu quantifizieren, wählen Sie immer den Bereich weg von 2-Sichtfeld oder mehr außer dem Zellkörper mit Mikroskop (60X).
      HINWEIS: Die Auswahl der Fläche in Neuronenkugel für die Bildgebung ist entscheidend, da dichte Axone in der Nähe des Zellkörpers sind und die Peripherie des Neuronenballs einzelne Axonliefern liefern kann.
    4. Für eine genaue Messung wählen Sie 5-verschiedene axonale Feld (ähnliche Entfernung von Zellkörpern)/Coverslip.
    5. Halten Sie identische Bildbedingungen an verschiedenen Tagen und zwischen den Experimenten

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Ergebnisse

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Hier zeigen wir repräsentative Ergebnisse der Anhäufung von präsynaptischen Proteinen in LRRTM2-induzierten Präsynapsen von axonalen Blättern der Neuronenkugelkultur. Als präsynaptische Proteine analysierten wir das exzitatorische synaptische Vesikelprotein vGlut1 und das Wirkstoffzonenprotein Munc18-1. Wir untersuchten auch den Zeitlichen Verlauf der Akkumulation von vGlut1 und Munc18-1 in Presynapsen und erzielten Ergebnisse, die die Quelle von Munc18-1 in Presynapsen mit Axonen, die Zellkörper entfernen, und einem Pro...

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Diskussion

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Wir entwickelten eine neuartige Methode zur Untersuchung der Präsynapse-Bildung, die mit LRRTM2-Perlen mit Neuronenballkultur stimuliert wurde. Derzeit umfasst der größte Teil des Präsynapse-Formations-Assays Poly-D-Lysin (PDL)-beschichtete Perlen und dissoziierte Kultur/Mikrofluidische Kammer20,21,22. Einer der Vorteile dieser Methode ist LRRTM2-Perlen. Während LRRTM2 interagiert mit Neurexin, um exzitatorische Präsynapsen spez...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

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Diese Arbeit wird teilweise von JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) (C) (Nr. 22500336, 25430068, 16K07061) (Y. Sasaki) unterstützt. Wir danken Dr. Terukazu Nogi und Frau Makiko Neyazaki (Yokohama City University) für die freundliche Bereitstellung von biotinyliertem LRRTM2-Protein. Wir danken auch Honami Uechi und Rie Ishii für die technische Unterstützung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Antikörper-VerdünnungsmittelDAKOS2022
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch715-585-151
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch711-545-152
Maus Anti-Munc18-1BD Biosciences610336
B-27 Supplement (50X), Serum kostenlosThermo Fisher Scientific17504044
Rinderserum Alubumin (BSA)Nacalai Tesque01863-48
Mit Zellkulturen behandelte Multischalen (4-Well-Schale)Nunc176740
Komplette EDTA-freie CCD-KameraRoche11873580001
AndorTechnologyiXON3
DeckglasMatsunamiC015001Größe: 15 mm, Dicke: 0,13-0,17 mm
Cytosin β-D-Arabinofuranosid (AraC)Sigma-AldrichC1768
4',6-Diamidino-2-phenylindol-Dihydrochlorid (DAPI)Nacalai Tesque11034-56
Desoxyribonuklease 1 (DNase I)Wako reine Chemikalien047-26771
Expi293 ExpressionssystemThermo Fisher ScientificA14635
PferdeserumSigma-AldrichH1270
BilderfassungssoftwareNikonNIS-Element AR
BildanalysesoftwareNIHImage Jhttps://imagej.nih.gov/ij/
Inverses FluoreszenzmikroskopNikonEclipse Ti-E
GlutaMAXThermo Fisher Scientific
Neurobasal mediaThermo Fisher Scientific#21103-049
Normales Ziegenserum (NGS)Thermo Fisher Scientific#143-06561
N-PropylgallatNacalai Tesque29303-92
Paraformaldehyd (PFA)Nacalai Tesque26126-25

Paraplast Plus		Sigma-AldrichP3558
Poly-L-Lysin-Hydrobromid (MW > 300.000)Nacalai Tesque28359-54
Poly (Vinylalkohol)SigmaP8136
Vorverpackte Einweg-PD-10-SäulenGE17085101
Kaninchen 1Synaptic Systems135-302
SCAT 20X-N (neutral, nicht phosphorhaltig) Waschmittel)Nacalai Tesque41506-04
Streptavidin-beschichtete MagnetpartikelSpherotech IncSVM-40-10Durchmesser: 4-5 µ m
TritonX-100Nacalai Tesque35501-15
TrypsinNacalai Tesque18172-94
von 35050061 für das Gesundheitswesen antivesikulärer Glutamattransporter für

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Waites, C. L., Craig, A. M., Garner, C. C. Mechanisms of Vertebrate Synaptogenesis. Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 251-274 (2005).
  2. Ziv, N. E., Garner, C. C. Cellular and molecular mechanisms of presynaptic assembly. Nature Reviews Neuroscience. 5 (5), 385-399 (2004).
  3. Chia, P. H., Li, P., Shen, K. Cellular and molecular mechanisms underlying presynapse formation. Journal of Cell Biology. 203 (1), 11-22 (2013).
  4. Südhof, T. C. Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease. Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).
  5. Saitsu, H., et al. CASK aberrations in male patients with Ohtahara syndrome and cerebellar hypoplasia. Epilepsia. 53 (8), 1441-1449 (2012).
  6. Friedman, H. V., Bresler, T., Garner, C. C., Ziv, N. E. Assembly of New Individual Excitatory Synapses. Neuron. 27 (1), 57-69 (2000).
  7. Bresler, T., et al. Postsynaptic density assembly is fundamentally different from presynaptic active zone assembly. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24 (6), 1507-1520 (2004).
  8. Parvin, S., Takeda, R., Sugiura, Y., Neyazaki, M., Nogi, T., Sasaki, Y. Fragile X mental retardation protein regulates accumulation of the active zone protein Munc18-1 in presynapses via local translation in axons during synaptogenesis. Neuroscience Research. , (2018).
  9. Sasaki, Y., et al. Phosphorylation of Zipcode Binding Protein 1 Is Required for Brain-Derived Neurotrophic Factor Signaling of Local β-Actin Synthesis and Growth Cone Turning. Journal of Neuroscience. 30 (28), 9349-9358 (2010).
  10. Sasaki, Y., Gross, C., Xing, L., Goshima, Y., Bassell, G. J. Identification of axon-enriched microRNAs localized to growth cones of cortical neurons. Developmental neurobiology. 74 (3), 397-406 (2014).
  11. Linhoff, M. W., et al. An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers. Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).
  12. de Wit, J., et al. LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).
  13. Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., Südhof, T. C. LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).
  14. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).
  15. Hirai, H., et al. Structural basis for ligand capture and release by the endocytic receptor ApoER2. EMBO reports. , (2017).
  16. Yasui, N., et al. Functional Importance of Covalent Homodimer of Reelin Protein Linked via Its Central Region. Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 35247-35256 (2011).
  17. Bassell, G. J., Warren, S. T. Fragile X Syndrome: Loss of Local mRNA Regulation Alters Synaptic Development and Function. Neuron. 60 (2), 201-214 (2008).
  18. Darnell, J. C., Klann, E. The translation of translational control by FMRP: therapeutic targets for FXS. Nat Neurosci. 16 (11), 1530-1536 (2013).
  19. Richter, J. D., Bassell, G. J., Klann, E. Dysregulation and restoration of translational homeostasis in fragile X syndrome. Nature Reviews Neuroscience. 16 (10), 595-605 (2015).
  20. Lucido, A. L., et al. Rapid Assembly of Functional Presynaptic Boutons Triggered by Adhesive Contacts. Journal of Neuroscience. 29 (40), 12449-12466 (2009).
  21. Taylor, A. M., Wu, J., Tai, H. C., Schuman, E. M. Axonal Translation of β-Catenin Regulates Synaptic Vesicle Dynamics. Journal of Neuroscience. 33 (13), 5584-5589 (2013).
  22. Batista, A. F. R., Martínez, J. C., Hengst, U. Intra-axonal Synthesis of SNAP25 Is Required for the Formation of Presynaptic Terminals. Cell reports. 20 (13), 3085-3098 (2017).

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LRRTM2 BeadsvGlut1 AkkumulationMunc18 1 Akkumulationaxonaler Protein Transportlokale TranslationImmunfluoreszenz Bildgebungsynaptisches Vesikelproteinaktive Zonenprotein

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