Methodenartikel

Onkogene Genfusionsdetektion mit verankerter Multiplex-Polymerase-Kettenreaktion gefolgt von Sequenzierung der nächsten Generation

DOI:

10.3791/59895

⸱

5. Juli 2019

 ,  , 
1Department of Pathology, University of Colorado - Anschutz Medical Campus

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieser Artikel beschreibt die Verwendung eines verankerten Multiplex-Polymerase-Kettenreaktions-basierten Bibliotheksvorbereitungskits, gefolgt von einer Sequenzierung der nächsten Generation, um onkogene Genfusionen in klinischen soliden Tumorproben zu bewerten. Es werden sowohl Die Nassbank- als auch die Datenanalyseschritte beschrieben.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genfusionen tragen häufig zum onkogenen Phänotyp vieler verschiedener Krebsarten bei. Darüber hinaus beeinflusst das Vorhandensein bestimmter Fusionen in Proben von Krebspatienten häufig direkt die Diagnose, Prognose und/oder Therapieauswahl. Infolgedessen ist der genaue Nachweis von Genfusionen für viele Krankheitstypen zu einem kritischen Bestandteil des klinischen Managements geworden. Bis vor kurzem wurde der klinische Genfusionsnachweis überwiegend durch den Einsatz von Single-Gen-Assays durchgeführt. Die ständig wachsende Liste von Genfusionen mit klinischer Bedeutung hat jedoch dazu führen, dass der Fusionsstatus mehrerer Gene gleichzeitig bewertet werden muss. NGS-basierte Tests der nächsten Generation haben diese Nachfrage durch die Fähigkeit, Nukleinsäure massiv parallel zu sequenzieren, erfüllt. Mehrere NGS-basierte Ansätze, die unterschiedliche Strategien für die Genzielanreicherung anwenden, stehen nun für den Einsatz in der klinischen Molekulardiagnostik zur Verfügung, die jeweils ihre eigenen Stärken und Schwächen haben. Dieser Artikel beschreibt die Verwendung von verankerter Multiplex-PCR (AMP)-basierte Zielanreicherung und Bibliotheksvorbereitung, gefolgt von NGS, um Genfusionen in klinischen soliden Tumorproben zu bewerten. AMP ist einzigartig unter Amplikon-basierten Anreicherungsansätzen, da es Genfusionen unabhängig von der Identität des Fusionspartners identifiziert. Hier sind sowohl die Nassbank- als auch die Datenanalyseschritte aufgeführt, die einen genauen Genfusionsnachweis aus klinischen Proben gewährleisten.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Verschmelzung von zwei oder mehr Genen zu einer einzigen transkriptionellen Einheit kann als Ergebnis großflächiger chromosomaler Variationen auftreten, einschließlich Deletionen, Duplizierungen, Insertionen, Inversionen und Translokationen. Durch veränderte Transkriptionskontrolle und/oder veränderte funktionelle Eigenschaften des exprimierenden Genprodukts können diese Fusionsgene Krebszellen onkogene Eigenschaften verleihen1. In vielen Fällen sind Fusionsgene dafür bekannt, als primäre onkogene Treiber zu fungieren, indem sie die Zellproliferation und Überlebenswege direkt aktivieren.

Die klinische Relevanz vo....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bibliotheksvorbereitung und -sequenzierung

  1. Allgemeine Assay-Überlegungen und Pre-Assay-Schritte
    1. Assay-Läufe bestehen in der Regel aus sieben klinischen Proben und einer positiven Kontrolle (obwohl die Anzahl der Proben pro Bibliotheksvorbereitungslauf bei Bedarf angepasst werden kann). Verwenden Sie eine positiv-kontroll, die mindestens mehrere Genfusionen enthält (die die Assay-Ziele), die von einem Hersteller bestätigt wurden und/oder durch eine orthogonale Methodik bestätigt wurden. Eine Nicht-Vorlagenkontrolle (NTC) muss als zusätzliche Probe in jedem Testlauf enthalten sein, wird aber nur durch die cDNA-Synthese des zweiten....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In Abbildung 3, Abbildung 4 und Abbildung 5 sind Screenshots aus der Analyse-Benutzeroberfläche zu sehen, die die Ergebnisse einer Lungenadenokarzinomprobe zeigen. In Abbildung 3wird die Stichprobenzusammenfassung (oben) angezeigt, die die so genannten starken Evidenzfusionen sowie den QC-Status (rot eingekreist) auflistet. Die ADCK4-NUMBL-Fusion (von denen 3 Isoformen aufgeführt sind) wird sof.......

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Verankerte Multiplex-PCR-basierte Zielanreicherung und Bibliotheksvorbereitung, gefolgt von der Sequenzierung der nächsten Generation, eignet sich gut für die Multiplex-Genfusionsbewertung in klinischen Tumorproben. Durch die Konzentration auf DEN RNA-Eingang und nicht auf die genomische DNA wird die Notwendigkeit vermieden, große und sich wiederholende Introns zu sequenzieren. Da dieser Ansatz genfusionen unabhängig von der Identität des Fusionspartners verstärkt, werden neue Fusionen nachgewiesen. Dies ist ein kritisch.......

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.L.A. hat Beratungshonorare von Bayer Oncology, Genentech, AbbVie und Bristol Myers Squibb erhalten. K.D.D hat gesponserte Reisen von ArcherDx erhalten.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde von der Molecular Pathology Shared Resource der University of Colorado (National Cancer Institute Cancer Center Support Grant No. P30-CA046934) und vom Colorado Center for Personalized Medicine.

....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
10 mM Tris HCl pH 8,0IDT11-05-01-13Zur Verwendung für die TNA-Verdünnung
1M Tris pH 7,0Thermo FisherAM9850GZur Verwendung im Bibliothekspooling
25 mL Reagenzreservoir mit TeilerUSA Scientific9173-2000Zur Verwendung mit Mehrkanalpipetten und großen Reagenzien
96-well TemPlate Semi-Skirt 0,1 mL PCR-Platte-naturUSA Scientific1402-9700Platte für Thermocycler-Schritte
Agencourt AMPure XP PerlenBeckman CoulterA63881Wird bei der Reinigung nach mehreren Assay-Schritten verwendet
Agencourt Formapure KitBeckman CoulterA33343Wird bei der TNA-Extraktion verwendet
Archer FusionPlex Solid Tumor KitArcherDXAB0005Dieses Kit enthält die meisten Reagenzien, die für die Bibliotheksvorbereitung für die Illumina-Sequenzierung erforderlich sind (Kits für die Ionen-Torrent-Sequenzierung sind ebenfalls erhältlich)
Kaltblock, 96-Well-KalibrierungLight LabsA7079Wird zum Kühlen von Proben in verschiedenen Schritten verwendet
EthanolDecon LabsDSP-MD.43Wird für Bead-Washes verwendet
Bibliotheksquantifizierung für den Illumina Internal Control StandardKapa BiosystemsKK4906Wird für die Quantifizierung von Bibliotheken verwendet
Primer für die Bibliotheksquantifizierung und ROX Low qPCR-MixKapa BiosystemsKK4973Wird für die Quantifizierung
von Bibliotheken verwendet Standards für die BibliotheksquantifizierungKapa BiosystemsKK4903Wird für die Quantifizierung von Bibliotheken
verwendet Magnetplatte, 96 Well (N38-Qualität)AlpaquaA32782Wird in Bead-Reinigungsschritten verwendet
MBC Adapter Set BArcherDXAK0016-48Adapter, die probenspezifische Indizes enthalten, um die Multiplex-Sequenzierung zu ermöglichen
MikrozentrifugeUSA Scientific2641-0016Wird zum Schleudern von PCR-Röhrchen
verwendet MicroAmp EnduraPlate Optical 96 Well PlateThermo-Fisher 4483485Wird für die Pre-Seq-QClibrary-Quantifizierung verwendet
Mikroampere Optisches FilmkompressionspadAngewandte Biosysteme4312639Wird für die Quantifizierung von Bibliotheken
Mini Plate SpinnerLabnetMPS-1000Wird zum Sammeln von Flüssigkeit am Boden der Plattenvertiefungen verwendet
MiSeq Reagent Kit v3 (600 Zyklen)IlluminaMS-102-3003Enthält Komponenten, die für einen MiSeq-Sequenzierungslauf erforderlich
sind MiSeqDx SystemIlluminaNGS Sequenziergerät
Modell 9700 ThermocyclerAngewandte BiosystemeWird für mehrere Schritte verwendet während Assay
Nuklease freies WasserAmbion9938Wird als allgemeines Verdünnungsmittel verwendet
Optische ABI 96-Well-PCR-PlattenabdeckungenThermo-Fisher4311971Wird für die Pre-Seq QClibrary-Quantifizierung
verwendet PCR-Workstation Modell 600Air Clean SystemsBZ10119636Nassbank-Assay-Schritte, die in dieser "Dead Air Box" durchgeführt werdenProteinase
KQiagen1019499Verwendet in der TNA-Extraktion
QuantStudio 5Applied BiosystemsLSA28139qPCR-Instrument für die PreSeq- und Bibliotheksquantifizierung
Qubit RNA HS Assay KitLife TechnologiesQ32855Verwendung zur Bestimmung der RNA-Konzentration in TNA-Proben
RNase AwayFisher12-402-178Wird für die allgemeine RNase-Dekontamination von Arbeitsbereichen verwendet
Seraseq FFPE Tumorfusion RNA-Referenzmaterial v2SeraCare0710-0129Wird als Assay-Positivkontrolle
verwendet NatriumhydroxidFisherBP359-212Wird in Reinigungsschritten und für die Sequenzierungseinrichtung verwendet
SYBR Green SupermixBio Rad172-5120Komponente des PreSeq QC Assay
TempAssure PCR 8-Tube StripsUSA Scientific1402-2700Wird zum Mischen von Reagenzien und Proben usw. verwendet.
Vorlage RT PCR-FilmUSA Scientific2921-7800Wird zum Abdecken von 96-Well-Platten
verwendet U-Bottom 96-Well-MikroplatteLSPMP8117-RWird bei der Bead-Aufreinigung verwendet
verwendet

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mitelman, F., Johansson, B., Mertens, F. The impact of translocations and gene fusions on cancer causation. Nature Reviews Cancer. 7 (4), 233-245 (2007).
  2. Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia ....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Verankerte Multiplex PCRklinischer SolidtumorRNA Verd nnungRandom PrimingZweitstrandsyntheseBead ReinigungBibliotheksquantifizierungSequenzierer Reagenzienkartusche

Verwandte Artikel