Dieser Artikel beschreibt die Verwendung eines verankerten Multiplex-Polymerase-Kettenreaktions-basierten Bibliotheksvorbereitungskits, gefolgt von einer Sequenzierung der nächsten Generation, um onkogene Genfusionen in klinischen soliden Tumorproben zu bewerten. Es werden sowohl Die Nassbank- als auch die Datenanalyseschritte beschrieben.
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Methodenartikel
Onkogene Genfusionsdetektion mit verankerter Multiplex-Polymerase-Kettenreaktion gefolgt von Sequenzierung der nächsten Generation
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Genfusionen tragen häufig zum onkogenen Phänotyp vieler verschiedener Krebsarten bei. Darüber hinaus beeinflusst das Vorhandensein bestimmter Fusionen in Proben von Krebspatienten häufig direkt die Diagnose, Prognose und/oder Therapieauswahl. Infolgedessen ist der genaue Nachweis von Genfusionen für viele Krankheitstypen zu einem kritischen Bestandteil des klinischen Managements geworden. Bis vor kurzem wurde der klinische Genfusionsnachweis überwiegend durch den Einsatz von Single-Gen-Assays durchgeführt. Die ständig wachsende Liste von Genfusionen mit klinischer Bedeutung hat jedoch dazu führen, dass der Fusionsstatus mehrerer Gene gleichzeitig bewertet werden muss. NGS-basierte Tests der nächsten Generation haben diese Nachfrage durch die Fähigkeit, Nukleinsäure massiv parallel zu sequenzieren, erfüllt. Mehrere NGS-basierte Ansätze, die unterschiedliche Strategien für die Genzielanreicherung anwenden, stehen nun für den Einsatz in der klinischen Molekulardiagnostik zur Verfügung, die jeweils ihre eigenen Stärken und Schwächen haben. Dieser Artikel beschreibt die Verwendung von verankerter Multiplex-PCR (AMP)-basierte Zielanreicherung und Bibliotheksvorbereitung, gefolgt von NGS, um Genfusionen in klinischen soliden Tumorproben zu bewerten. AMP ist einzigartig unter Amplikon-basierten Anreicherungsansätzen, da es Genfusionen unabhängig von der Identität des Fusionspartners identifiziert. Hier sind sowohl die Nassbank- als auch die Datenanalyseschritte aufgeführt, die einen genauen Genfusionsnachweis aus klinischen Proben gewährleisten.
Einleitung
Die Verschmelzung von zwei oder mehr Genen zu einer einzigen transkriptionellen Einheit kann als Ergebnis großflächiger chromosomaler Variationen auftreten, einschließlich Deletionen, Duplizierungen, Insertionen, Inversionen und Translokationen. Durch veränderte Transkriptionskontrolle und/oder veränderte funktionelle Eigenschaften des exprimierenden Genprodukts können diese Fusionsgene Krebszellen onkogene Eigenschaften verleihen1. In vielen Fällen sind Fusionsgene dafür bekannt, als primäre onkogene Treiber zu fungieren, indem sie die Zellproliferation und Überlebenswege direkt aktivieren.
Die klinische Relevanz vo....
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Protokoll
1. Bibliotheksvorbereitung und -sequenzierung
- Allgemeine Assay-Überlegungen und Pre-Assay-Schritte
- Assay-Läufe bestehen in der Regel aus sieben klinischen Proben und einer positiven Kontrolle (obwohl die Anzahl der Proben pro Bibliotheksvorbereitungslauf bei Bedarf angepasst werden kann). Verwenden Sie eine positiv-kontroll, die mindestens mehrere Genfusionen enthält (die die Assay-Ziele), die von einem Hersteller bestätigt wurden und/oder durch eine orthogonale Methodik bestätigt wurden. Eine Nicht-Vorlagenkontrolle (NTC) muss als zusätzliche Probe in jedem Testlauf enthalten sein, wird aber nur durch die cDNA-Synthese des zweiten....
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Ergebnisse
In Abbildung 3, Abbildung 4 und Abbildung 5 sind Screenshots aus der Analyse-Benutzeroberfläche zu sehen, die die Ergebnisse einer Lungenadenokarzinomprobe zeigen. In Abbildung 3wird die Stichprobenzusammenfassung (oben) angezeigt, die die so genannten starken Evidenzfusionen sowie den QC-Status (rot eingekreist) auflistet. Die ADCK4-NUMBL-Fusion (von denen 3 Isoformen aufgeführt sind) wird sof.......
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Diskussion
Verankerte Multiplex-PCR-basierte Zielanreicherung und Bibliotheksvorbereitung, gefolgt von der Sequenzierung der nächsten Generation, eignet sich gut für die Multiplex-Genfusionsbewertung in klinischen Tumorproben. Durch die Konzentration auf DEN RNA-Eingang und nicht auf die genomische DNA wird die Notwendigkeit vermieden, große und sich wiederholende Introns zu sequenzieren. Da dieser Ansatz genfusionen unabhängig von der Identität des Fusionspartners verstärkt, werden neue Fusionen nachgewiesen. Dies ist ein kritisch.......
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Offenlegungen
D.L.A. hat Beratungshonorare von Bayer Oncology, Genentech, AbbVie und Bristol Myers Squibb erhalten. K.D.D hat gesponserte Reisen von ArcherDx erhalten.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von der Molecular Pathology Shared Resource der University of Colorado (National Cancer Institute Cancer Center Support Grant No. P30-CA046934) und vom Colorado Center for Personalized Medicine.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 10 mM Tris HCl pH 8,0 | IDT | 11-05-01-13 | Zur Verwendung für die TNA-Verdünnung |
| 1M Tris pH 7,0 | Thermo Fisher | AM9850G | Zur Verwendung im Bibliothekspooling |
| 25 mL Reagenzreservoir mit Teiler | USA Scientific | 9173-2000 | Zur Verwendung mit Mehrkanalpipetten und großen Reagenzien |
| 96-well TemPlate Semi-Skirt 0,1 mL PCR-Platte-natur | USA Scientific | 1402-9700 | Platte für Thermocycler-Schritte |
| Agencourt AMPure XP Perlen | Beckman Coulter | A63881 | Wird bei der Reinigung nach mehreren Assay-Schritten verwendet |
| Agencourt Formapure Kit | Beckman Coulter | A33343 | Wird bei der TNA-Extraktion verwendet |
| Archer FusionPlex Solid Tumor Kit | ArcherDX | AB0005 | Dieses Kit enthält die meisten Reagenzien, die für die Bibliotheksvorbereitung für die Illumina-Sequenzierung erforderlich sind (Kits für die Ionen-Torrent-Sequenzierung sind ebenfalls erhältlich) |
| Kaltblock, 96-Well-Kalibrierung | Light Labs | A7079 | Wird zum Kühlen von Proben in verschiedenen Schritten verwendet |
| Ethanol | Decon Labs | DSP-MD.43 | Wird für Bead-Washes verwendet |
| Bibliotheksquantifizierung für den Illumina Internal Control Standard | Kapa Biosystems | KK4906 | Wird für die Quantifizierung von Bibliotheken verwendet |
| Primer für die Bibliotheksquantifizierung und ROX Low qPCR-Mix | Kapa Biosystems | KK4973 | Wird für die Quantifizierung |
| von Bibliotheken verwendet Standards für die Bibliotheksquantifizierung | Kapa Biosystems | KK4903 | Wird für die Quantifizierung von Bibliotheken |
| verwendet Magnetplatte, 96 Well (N38-Qualität) | Alpaqua | A32782 | Wird in Bead-Reinigungsschritten verwendet |
| MBC Adapter Set B | ArcherDX | AK0016-48 | Adapter, die probenspezifische Indizes enthalten, um die Multiplex-Sequenzierung zu ermöglichen |
| Mikrozentrifuge | USA Scientific | 2641-0016 | Wird zum Schleudern von PCR-Röhrchen |
| verwendet MicroAmp EnduraPlate Optical 96 Well Plate | Thermo-Fisher 4483485 | Wird für die Pre-Seq-QClibrary-Quantifizierung verwendet | |
| Mikroampere Optisches Filmkompressionspad | Angewandte Biosysteme | 4312639 | Wird für die Quantifizierung von Bibliotheken |
| Mini Plate Spinner | Labnet | MPS-1000 | Wird zum Sammeln von Flüssigkeit am Boden der Plattenvertiefungen verwendet |
| MiSeq Reagent Kit v3 (600 Zyklen) | Illumina | MS-102-3003 | Enthält Komponenten, die für einen MiSeq-Sequenzierungslauf erforderlich |
| sind MiSeqDx System | Illumina | NGS Sequenziergerät | |
| Modell 9700 Thermocycler | Angewandte Biosysteme | Wird für mehrere Schritte verwendet während Assay | |
| Nuklease freies Wasser | Ambion | 9938 | Wird als allgemeines Verdünnungsmittel verwendet |
| Optische ABI 96-Well-PCR-Plattenabdeckungen | Thermo-Fisher | 4311971 | Wird für die Pre-Seq QClibrary-Quantifizierung |
| verwendet PCR-Workstation Modell 600 | Air Clean Systems | BZ10119636 | Nassbank-Assay-Schritte, die in dieser "Dead Air Box" durchgeführt werdenProteinase |
| K | Qiagen | 1019499 | Verwendet in der TNA-Extraktion |
| QuantStudio 5 | Applied Biosystems | LSA28139 | qPCR-Instrument für die PreSeq- und Bibliotheksquantifizierung |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32855 | Verwendung zur Bestimmung der RNA-Konzentration in TNA-Proben |
| RNase Away | Fisher | 12-402-178 | Wird für die allgemeine RNase-Dekontamination von Arbeitsbereichen verwendet |
| Seraseq FFPE Tumorfusion RNA-Referenzmaterial v2 | SeraCare | 0710-0129 | Wird als Assay-Positivkontrolle |
| verwendet Natriumhydroxid | Fisher | BP359-212 | Wird in Reinigungsschritten und für die Sequenzierungseinrichtung verwendet |
| SYBR Green Supermix | Bio Rad | 172-5120 | Komponente des PreSeq QC Assay |
| TempAssure PCR 8-Tube Strips | USA Scientific | 1402-2700 | Wird zum Mischen von Reagenzien und Proben usw. verwendet. |
| Vorlage RT PCR-Film | USA Scientific | 2921-7800 | Wird zum Abdecken von 96-Well-Platten |
| verwendet U-Bottom 96-Well-Mikroplatte | LSP | MP8117-R | Wird bei der Bead-Aufreinigung verwendet |
Referenzen
- Mitelman, F., Johansson, B., Mertens, F. The impact of translocations and gene fusions on cancer causation. Nature Reviews Cancer. 7 (4), 233-245 (2007).
- Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
