Dieser Artikel enthält eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Untersuchung der subzellulären Lokalisierungsdynamik von Proteinen und zur Überwachung morphologischer Veränderungen mithilfe der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie in Bacillus subtilis und Staphylococcus aureus.
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Methodenartikel
Live-Cell Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung subzellulärer Proteinlokalisierung und Zellmorphologie Veränderungen in Bakterien
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Untersuchungen von Faktoren, die die Zellteilung und die Zellform von Bakterien beeinflussen, werden häufig in Verbindung mit einer hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt, da Beobachtungen auf Populationsebene möglicherweise nicht wirklich widerspiegeln, was auf einer einzelnen Zellebene geschieht. Die Zeitraffermikroskopie mit Live-Zellen ermöglicht es den Forschern, die Veränderungen in der Zellteilung oder Zellmorphologie zu überwachen, die wertvolle Erkenntnisse über die subzelluläre Lokalisierung von Proteinen und den Zeitpunkt der Genexpression liefern, um möglicherweise bei der Beantwortung wichtiger biologischer Fragen zu helfen. Hier beschreiben wir unser Protokoll zur Überwachung phänotypischer Veränderungen bei Bacillus subtilis und Staphylococcus aureus mit einem hochauflösenden Dekonvolutionmikroskop. Ziel dieses Berichts ist es, ein einfaches und klares Protokoll zu erstellen, das von anderen Forschern angenommen werden kann, die an der Durchführung von Fluoreszenzmikroskopieexperimenten interessiert sind, um verschiedene biologische Prozesse bei Bakterien und anderen Organismen zu untersuchen.
Einleitung
Der Bereich der bakteriellen Zellbiologie wurde durch die jüngsten Fortschritte in den Mikroskopietechniken1,2deutlich verbessert. Unter anderem sind Mikroskope, die in der Lage sind, Zeitrafferfluoreszenzmikroskopieexperimente durchzuführen, ein wertvolles Werkzeug. Die Forscher können verschiedene physiologische Ereignisse in Echtzeit mit fluoreszierenden Proteinen wie grünem fluoreszierendem Protein (GFP) basierende Transkriptions- und Translationalreporterfusionen, fluoreszierende D-Aminosäuren (FDAA)3überwachen oder andere Flecken zur Kennzeichnung der Zellwand, Membran und DNA ver....
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Protokoll
1. Allgemeine Wachstumsbedingungen
- Impfen 2 ml des geeigneten Wachstumsmediums mit Antibiotika (falls erforderlich) mit einer einzigen Kolonie der Stämme abgebildet werden. Inkubieren Sie diese Samenkulturen über Nacht bei 22 °C in einem Schüttelbrutzentrum.
HINWEIS: Die in diesem Artikel verwendeten spezifischen bakteriellen Wachstumsbedingungen finden Sie unter dem Abschnitt repräsentative Ergebnisse. - Verdünnen Sie die Nachtkulturen 1:20 in frischen Medien in einem 125 ml Kolben, ergänzen Sie sie mit Antibiotika (falls erforderlich).
- Kultur(en) bei 37 °C in einem Schüttelinkubator bis zur mittelogarithmischen Phase (OD600 ....
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Ergebnisse
GpsB-Phänotypen
Zuvor haben wir gezeigt, dass Sa-GpsB ein essentielles Protein ist, da die Erschöpfung von GpsB mit einer Antisense-RNA zu einer Zelllyse9führt. Hier beschreiben wir, wie die Entstehung verschiedener Zellteilungsphänotypen und Veränderungen in der Proteinlokalisierung mit dem in diesem Artikel beschriebenen Zeitraffermikroskopieprotokoll erfasst werden konnten. Zu diesem Zweck wurden die S. aureus-Stämme RB143 [SH1000 mit pEPSA5 (leerer Vektor)] und GGS.......
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Diskussion
Die Mikroskopie ist nach wie vor eine tragende Säule in Studien über mikrobielle Organismen. Angesichts ihrer Mikron-Zellgröße stützten sich Einzelzell-Level-Studien traditionell auf Elektronenmikroskopie (EM). Obwohl EM in den letzten Jahren zu einer recht leistungsfähigen Technik geworden ist, hat es neben dem eingeschränkten Benutzerzugriff16seine eigenen intrinsischen Einschränkungen. Verbesserungen in fluoreszenzmikroskopischen Techniken und die Entwicklung verschiedener Fluoreszenzsonden, wi.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Wir danken unseren Labormitgliedern für ihre Kommentare zu diesem Artikel. Diese Arbeit wurde durch ein Start-up-Stipendium der University of South Florida (PE) finanziert.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Agarose | Fisher BioReagents | BP160-100 | Molekularbiologie - Low EEO |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | Mikroskopie |
| FM4-64 | Invitrogen | T3166 | Mikroskopie |
| Glasbodenschale | MatTek | P35G-1.5-14-C | Mikroskopie |
| IPTG | Fisher BioReagents | BP1755-10 | Dioxanfrei |
| Mikroskop | GE | DeltaVision Elite | Customized Olympus IX-71 Inverses Mikroskopstativ; Kundenspezifischer Beleuchtungsturm und Durchlichtbeleuchtungsmodul. Objektive: PLAPON 60X (N.A. 1,42, WD 0,15 mm); OLY 100X ÖL (N.A. 1,4, WD 0,12 mm); DIC Prism Nomarski für 100X Objektiv; CoolSnap HQ2 Kamera; SSI-Montage 7-farbig; Klimakontrollkammer - undurchsichtig. |
| PC190723 | MilliporeSigma | 3445805MG | FtsZ-Inhibitor |
| SoftWorx | GE | Vom Hersteller bereitgestellte Bildgebungssoftware |
Referenzen
- Coltharp, C., Xiao, J. Superresolution microscopy for microbiology. Cellular Microbiology. 14 (12), 1808-1818 (2012).
- Holden, S. Probing the mechanistic principles of bacterial cell division with super-resolution microscopy. Current Opinion in ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
