Method Article

Optimierung, Design und Vermeidung von Fallstricken in der manuellen Multiplex-Fluoreszenz-Immunhistochemie

DOI:

10.3791/59915

⸱

July 26th, 2019

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1Department of Surgery, University of Michigan, 2Department of Molecular and Cellular Physiology, University of Michigan, 3Department of Pathology, University of Michigan

In This Article

Summary

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Multiplex-Fluoreszenz-Immunhistochemie ist eine neue Technologie, die die Visualisierung mehrerer Zelltypen innerhalb intakten formalinfixierten, paraffineingebetteten (FFPE) Gewebeermöglicht. Präsentiert werden Richtlinien zur Sicherstellung eines erfolgreichen 7-Farben-Multiplex mit Anweisungen zur Optimierung von Antikörpern und Reagenzien, zur Vorbereitung von Dias, Design und Tipps zur Vermeidung von häufigauftretenden Problemen.

Abstract

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Die Mikroumweltbewertung von intaktem Gewebe zur Analyse der Zellinfiltration und räumlichen Organisation ist für das Verständnis der Komplexität von Krankheitsprozessen von entscheidender Bedeutung. Zu den in der Vergangenheit verwendeten Prinziptechniken gehören Immunhistochemie (IHC) und Immunfluoreszenz (IF), die die Visualisierung von Zellen als Momentaufnahme in der Zeit mit 1 bis 4 Markern ermöglichen. Beide Techniken weisen Mängel auf, darunter Schwierigkeiten bei der Färbung schlecht anogener Ziele und Einschränkungen im Zusammenhang mit der artenübergreifenden Reaktivität. IHC ist zuverlässig und reproduzierbar, aber die Art der Chemie und die Abhängigkeit vom sichtbaren Lichtspektrum ermöglicht nur wenige Marker und macht die Kolokalisierung schwierig. Die Verwendung von IF erweitert potenzielle Marker, beruht aber aufgrund der umfangreichen Gewebe-Autofluoreszenz nach formaler Fixierung in der Regel auf gefrorenes Gewebe. Durchflusszytometrie, eine Technik, die die gleichzeitige Etikettierung mehrerer Epitope ermöglicht, beseitigt viele der Mängel von IF und IHC, jedoch verliert die Notwendigkeit, Zellen als einzelzellige Suspension zu untersuchen, den räumlichen Kontext von Zellen, die wichtige biologische Beziehungen. Multiplex fluoreszierende Immunhistochemie (mfIHC) überbrückt diese Technologien, die eine multiepitopzelluläre Phänotypisierung in formalin fixiertem Paraffin-eingebettetem (FFPE) Gewebe ermöglichen und gleichzeitig die gesamte Mikroumgebungsarchitektur und die räumliche Beziehung der Zellen innerhalb intakten, ungestörten Gewebes. Fluorophore mit hoher fluoreszierender Intensität, die kovalent mit dem Gewebeepitop verbunden sind, ermöglichen mehrere Anwendungen primärer Antikörper, ohne sich um eine artspezifische Kreuzreaktivität durch sekundäre Antikörper zu kümmern. Obwohl sich diese Technologie als zuverlässige und genaue Bilder für die Untersuchung von Krankheiten erwiesen hat, kann der Prozess der Erstellung einer nützlichen mfIHC-Färbestrategie aufgrund umfangreicher Optimierung und Design zeitaufwändig und anspruchsvoll sein. Um robuste Bilder zu erstellen, die genaue zelluläre Interaktionen vor Ort darstellen, und um den Optimierungszeitraum für die manuelle Analyse zu mildern, werden hier Methoden zur Folienvorbereitung, Optimierung von Antikörpern, Multiplex-Design sowie Fehler vorgestellt. häufig während des Färbevorgangs auftreten.

Introduction

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Die Visualisierung einer intakten Tumormikroumgebung (TME) ist wichtig, um nicht nur die zelluläre Infiltration bei festen Malignomen, sondern auch bei Zell-zu-Zell-Wechselwirkungen zu bewerten. Multiplex fluoreszierende Immunhistochemie (mfIHC) hat sich als wirksames Werkzeug für Multi-Antigen-Phänotypisierung von Zellen in der Untersuchung von Krebs und assoziierten Krankheiten1,2,3,4, 5,6,7. Dies ermöglicht in Kombination mit neuartig....

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Protocol

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Alle Arbeiten wurden vom internen Überprüfungsausschuss der University of Michigan genehmigt.

1. Optimierung der primärantikörper und Der Diavorbereitung

  1. Bestimmen Sie die ideale Konzentration von Antikörpern für Multiplex mit konventionellem IHC.
    1. Testen Sie die Antikörper für den Multiplex durch manuelle konventionelle Immunhistochemie (IHC)13.
    2. Verwenden Sie spezifische Gewebe, die einen reichlichen Zelltyp für jeden getesteten Antikörper haben, z. B. die Verwendung von Tonsillengewebe für CD3-Antikörpertests.
    3. Verwenden Sie die vom Unternehmen empfohlene Referenzkonzentration für ....

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Results

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Der gesamte Prozess der Erlangung eines 7-Farben-Multiplex-Assays folgt einem sich wiederholenden Muster. Abbildung 1 beschreibt den Prozess in einer schemamatischen Form. Sobald die Dias geschnitten und getrocknet oder aus dem Labor empfangen und in einem Hybridisierungsofen bei 60 °C für 1 h gebacken werden, dann gehen Sie zur Deparaffinierung und Rehydrierung, fixieren Sie die Dias in Formalin wieder, gefolgt von Antigen-Retrieval. Jede Multiplexing-Runde beginnt bei der Antigenabrufung u.......

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Discussion

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Intakte Gewebeproben aus der soliden Tumorbiopsie und der chirurgischen Resektion bleiben wichtige diagnostische und prädiktive Werkzeuge für die Krankheitsanalyse sowie patientenprognose. Multiplex fluoreszierende Immunhistochemie (mfIHC) ist eine neuartige Technik, die die Vorteile der Immunhistochemie (IHC), der Immunfluoreszenz (IF) und der Durchflusszytometrie kombiniert. Frühere Methoden zur Untersuchung von Zellen vor Ort haben die Auswertung der Zell-zu-Zell-Anordnungen in einer Gewebeumgebung8<.......

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgements

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Die Autoren danken Ed Stack, zuvor von Perkin Elmer, für seine Unterstützung bei der Einrichtung und Optimierung der originalen Multiplexfärbung. Die Autoren danken auch Kristen Schmidt von Akoya Biosciences für Tipps mit der Analysesoftware. Die in dieser Publikation berichteten Forschungsergebnisse wurden von den National Cancer Institutes of Health unter der Award-Nummer P30CA046592, K08CA201581(tlf), K08CA234222 (js), R01CA15158807 (mpm), RSG1417301CSM (mpm), R01CA19807403 (mpm), U01CA22414501 (mpm, hc), CA170568 (hc). Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health dar. W....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100 % EthanolFisherHC8001GAL
70 % EthanolFisherHC10001GL
95 %Ethanol FisherHC11001GL
AnalysesoftwareAkoya BiosciencesCLS135783inForm Version 2.3.0
Antifading-EindeckmittelThermoFisherP36961ProLong
Diamond Blocking LösungVectorSP-6000Bloxall
Rinderserumalbumin (BSA)Sigma Life SciencesA9647-100G
DeckgläserFisher12-548-5E
Zartes ArbeitstuchKimberly-Clark34120
Fluoreszierendes VerdünnungsmittelAkoya BiosciencesARD1A01EAOpal TSA Verdünnungsmittel
Fluorophor 520Akoya BiosciencesFP1487001KT1:100
Fluorophor 540Akoya BiosciencesFP1494001KT1:100
Fluorophor 570Akoya BiosciencesFP1488001KT1:100
Fluorophor 620Akoya BiosciencesFP1495001KT1:100
Fluorophor 650Akoya BiosciencesFP1496001KT1:100
Fluorophor 690Akoya BiosciencesFP1497001KT1:100
Fluorophor DAPIAkoya BiosciencesFP14903 Tropfen in TBST oder PBS
Hitzebeständige BoxTissue-Tek25608-904Kunststoff-Schiebebox-grün
Befeuchtete KammerIbi ScientificAT-12
HybridisierungsofenFisherBiotech
Hydrophober BarrierestiftVectorH-4000ImmEdge
MikroskopPerkin ElmerCLS140089Mantra quantitative Pathologie-Workstation
MikrowellePanasonicNN-A661Smit Inverter-Technologie
Neutral gepuffertes FormalinFisherScientific SF100-410% neutral gepuffertes Formalin
pH 6 Antigen Retrieval PufferAkoya BiosciencesAR600AR6
pH 9 Antigen Retrieval PufferAkoya BiosciencesAR900AR9
Phosphatgepufferte KochsalzlösungFisherBP3994PBS
Kunststoff-ObjektträgerboxTissue-Tek25608-906
PlastikfolieFisherNC9070936
Polysorbat 20FisherBP337-800Tween 20
Primär Antikörper CD163LeciaNCL-LCD1631:400
Primärer Antikörper CD3DakoA04521:400
Primärer Antikörper CD8Spring BioM53901:400
Primärer Antikörper FOXP3DakoM35151:400
Primärer Antikörper PancytokeratinCell Signaling126531:500
Primärer Antikörper PD-L1Cell Signalisierung136841:200
SekundärantikörperAkoya BiosciencesARH1001EAOpalpolymer
Objektträger-FärbesetElektronenmikroskopie Sciences6254001
Tris gepufferte KochsalzlösungCorning46-012-CMTBS
Vertikales ObjektträgergestellElektronenmikroskopie Sciences50-294-72
XylolFischer
X3P1GAL

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lazarus, J., et al. Spatial and phenotypic immune profiling of metastatic colon cancer. JCI Insight. 3 (22), (2018).
  2. Barua, S., et al. A Funct....

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Multiplex Fluorescent ImmunohistochemistryFormalin Fixed Paraffin Embedded TissueAntibody OptimizationMultiplex DesignSlide PreparationAntigen RetrievalFluorophore ApplicationMonoplex AssaySpatial AnalysisTumor Microenvironment

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