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Methodenartikel

Messung der relativen Insulinsekretion mit einem co-secreted Luciferase Surrogate

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DOI:

10.3791/59926

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25. Juni 2019

 , 
1Department of Pharmacology, University of Texas Southwestern Medical Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt, wie man schnelle low-cost Luziferase-Assays bei mittlerem Durchsatz mit einer Insulin-verknüpften Gaußsia-Luziferase als Proxy für Insulinsekretion aus Beta-Zellen durchführt. Der Assay kann mit den meisten Lumineszenzplattenlesern und Mehrkanalpipetten durchgeführt werden.

Zusammenfassung

Die Durchführung von Antikörper-basierten Assays für die sekrete Insulin-Nachprobensammlung erfordert in der Regel ein paar Stunden bis zu einem Tag Assay-Zeit und kann teuer sein, je nach dem spezifischen Assay. Abgesonderte Luziferase-Assays beschleunigen die Ergebnisse und senken die Assay-Kosten pro Probe erheblich. Hier stellen wir einen relativ ungenutzten Ansatz zur Messung der insulinsekretotischen Aktivität von Bauchspeicheldrüsenzellen mit Gaussia luciferase vor, die genetisch in das C-Peptid eingefügt wurde. Während der proteolytischen Verarbeitung von Proinsulin wird das C-Peptid ausgeschnitten und die Luziferase innerhalb des Insulinsekretotische vesikelfrei freigesetzt, wo es mit Insulin mitsekretiert wird. Die Ergebnisse können innerhalb von Minuten nach der Probenentnahme aufgrund der Geschwindigkeit von Luziferase-Assays erhalten werden. Eine Einschränkung des Assays ist, dass es sich um eine relative Messung der Insulinsekretion handelt und nicht um eine absolute Quantifizierung. Dieses Protokoll ist jedoch wirtschaftlich, skalierbar und kann mit den meisten Standard-Leuchtplattenlesern durchgeführt werden. Analoge und digitale Mehrkanalpipetten ermöglichen mehrere Schritte des Assays. Viele verschiedene experimentelle Variationen können gleichzeitig getestet werden. Sobald eine fokussierte Reihe von Bedingungen entschieden ist, sollten Insulinkonzentrationen direkt mit Antikörper-basierten Assays mit Standardkurven gemessen werden, um die Ergebnisse des Luziferase-Assays zu bestätigen.

Einleitung

Die hier vorgestellte Methode ermöglicht es, die Insulinsekretion aus einer genetisch veränderten Beta-Zelllinie schnell und kostengünstig im 96-Well-Platten-Format zu erhalten. Der Schlüssel zu diesem Protokoll ist eine modifizierte Version von Insulin mit der natürlich sezernierten Gaussia-Luziferase (GLuc, 18 kDa) in das C-Peptid eingeführt, um Insulin-Gaussia (InsGLuc)1,2zu erzeugen. Andere größere Proteine, wie GFP (ca. 25 kDa), wurden erfolgreich in das C-Peptid von Insulin eingeführt und zeigten die erwartete posttranslationale Verarbeitung von Proinsulin-GFP zu Insulin und GFP-C-Peptid3,4. Für den Assay in diesem Protokoll wurde GLuc für die Expression von Säugetieren kodonoptimiert und zwei Mutationen wurden eingeführt, um die glühende Kinetik5,6zu verbessern. Mehrere Kombinationen und Replikationen von Behandlungsbedingungen können einfach im 96-Well-Plattenformat getestet werden und die Sekretionsergebnisse können unmittelbar nach dem Experiment erzielt werden.

Ein großer Vorteil, wie bereits erwähnt2, sind die niedrigen Kosten dieser auf Luziferase basierenden Sekretionsmessung (< 0,01 USD/well), die sie von den relativ höheren Kosten und technischen Aspekten enzymgebundener Immunsorbent-Assays (ELISAs) ( > 2 USD/well) und homogene zeitaufgelöste Fluoreszenz (HTRF) oder andere Aufenthalten von Förster-Resonanzenergieübertragung (FRET)-basierten Antikörpern (> 1/well) Im Vergleich zu diesen Antikörper-basierten Assays, die die Insulinkonzentration durch Bezugnahme auf eine Standardkurve messen, misst der InsGLuc-Assay die sekretorische Aktivität als relativen Vergleich zu Kontrollbrunnen auf der Platte. Aus diesem Grund erfordert jedes Experiment die Einbeziehung ordnungsgemäßer Kontrollen. Diese Unterscheidung ist ein Kompromiss, um schnelle und kostengünstige Messungen zu ermöglichen. Jedoch, InsGLuc Sekretion wurde gezeigt, dass stark mit Insulin-Sekretion gemessen mit ELISA1,2. Diese Technologie wurde für das Hochdurchsatzscreening1,2,7 skaliert und hat zur Identifizierung neuartiger Modulatoren der Insulinsekretion einschließlich eines spannungsgebundenen Kaliumkanalinhibitors7 geführt. sowie ein natürlicher Produktinhibitor der Zellfunktion, Chromomycin A28. Die Verwendung von InsGLuc ist am besten geeignet für Forscher, die planen, kontinuierlich viele verschiedene Behandlungsbedingungen auf ihre Auswirkungen auf die Insulinsekretion zu testen. In Folgeexperimenten ist es notwendig, wichtige Befunde in einer elterlichen Zelllinie und optimalerweise in murinen oder menschlichen Inseln zu wiederholen und die Insulinsekretion mit einem Antikörper-basierten Assay zu messen.

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Protokoll

1. Herstellung von Reagenzien, Medien und Puffern (Tabelle 1)

  1. Bereiten Sie MIN6-Komplettmedium in 500 ml hochglukosen (4,5 g/L) Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit folgenden Additiven vor: 15% fetales Rinderserum (FBS), 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 g/mL Streptomycin, 292 g/ml L-Glutamin und 50 Mercaptoethanol.
    HINWEIS: Die stabile Zelllinie wird in diesem Fall in 250 g/ml G418-Antibiotikum gehalten.
  2. Bereiten Sie Krebs-Ringer BicarbonatPuffer (KRBH) durch eine Lösung mit 5 mM KCl, 120 mM NaCl, 15 mM HEPES (pH 7.4), 24 mM NaHCO3, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2und 1 mg/mL radioimmunoassay-grade Rinderserumalbumin (BSA). Glucose ist zuzuführen, wenn aus einem 2 M Bestand angegeben.
    HINWEIS: KRBH wird verwendet, um die Zellen mit und ohne Stimulation zu inkubieren, um Insulin und/oder Gaussia luziferase Sekretion zu bewerten.
  3. Bereiten Sie die Coelenterazin (CTZ) Lagerlösung wie folgt vor. Bereiten Sie versauertes Methanol vor, indem Sie 106 l konzentriertem HCl auf 10 ml Methanol aufbringen. Als nächstes lyophilisiertes CTZ in angesäuertem Methanol bei 1 mg/ml auflösen und bei -80 °C in Schraubkappenrohren lagern.
    HINWEIS: Diese Bestände behalten ausreichende Aktivität in routinemäßigen Luziferase-Assays, auch nach 1 Jahr ordnungsgemäßer Lagerung.
  4. Bereiten Sie Gaußier luziferase (GLuc) Assay Puffer auf der Grundlage der Literatur9 sowie Patentinformationen10 zur Unterstützung in der Halbwertszeit der Gaußsia luciferase Assay in 96 Well Plate Format. Verwenden Sie die Formel: 25 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA, 5% Glycerin, 1 mg/mL Na2PO4, 300 mM Natriumascorbat, 200 mM Na2SO3 in Wasser. Lagerbestände bei -20 °C einfrieren. Nach dem Auftauen den Puffer bei 4 °C aufbewahren.
  5. Zur Vorbereitung der Gaussia-Luziferase-Arbeitslösung fügen Sie dem GLuc-Assaypuffer 4,2 l/ml der 1 mg/ml (2,36 mM) CTZ-Lagerlösung hinzu. Daraus ergibt sich eine 2x-Arbeitslösung von 10 m CTZ, die eine Endkonzentration von 5 m im Assay aufweist.

2. Kultur der InsGLuc MIN6-Zellen und Aussaat für Sekretionstests

  1. Um MIN6-Zellen zu kulturieren, versuchen Sie, die Zellen einmal pro Woche mithilfe von Standard-Zellkulturtechniken auszusäen. Ändern Sie die Medien in den Zellen alle zwei bis drei Tage. Fügen Sie geeignete selektionsiöse Selektionsantibiotika, wie z. B. 250 g/ml G418, in die Medien ein.
    1. Um eine ausreichende Anzahl von Zellen wöchentlich für Experimente bereitzustellen, halten Sie die Zellen in T75-Flaschen aufrecht. Die Aussaat von 6 x 106 Zellen pro T75 in 10 ml Medien ergibt in der Regel 30 x 106 bis 40 x 106 Zellen insgesamt pro T75 nach 7 Tagen Kultur.
  2. Um Zellen für die Beschichtung in 96-Well-Platten vorzubereiten, waschen Sie eine konfluente T75 von InsGLuc MIN6-Zellen zweimal mit PBS und fügen Sie 2 ml Trypsin hinzu. Inkubieren Sie bei 37 °C für ca. 5 min oder bis sich die Zellen vom Kolben lösen. Bestimmen Sie die Zellkonzentration pro Milliliter.
    1. Verdünnen Sie die Zellen in vollständigen Medien auf 1 x 106 Zellen/ml, so dass 1 x 105 Zellen in 100 l pro Brunnen in einer 96-Well-Platte entstehen. Die Zellen sollten für den Test nach 3–4 Tagen ausreichend konfluent sein.
      HINWEIS: Um die Kulturperiode zu verlängern, kann die Hälfte der Zellkonzentration plattiert werden. Medienveränderungen sind vor dem Tag des Testes nicht erforderlich, es sei denn, die Zellen sollen experimentellen Behandlungen unterzogen werden.

3. Glukose-stimulierte Gaußkoluzife-Sekretion-Test

  1. Am Tag des Assays bereiten Sie genügend KRBH für das Experiment vor (Schritt 1.2). Mindestens 50 ml KRBH pro 96-Well-Platte sind erforderlich, daher bereiten Sie mindestens 75 ml vor, um einen ausreichenden Puffer für das Experiment zu gewährleisten. Bereiten Sie zusätzlichen Puffer vor, wenn verschiedene Kombinationen von medikamentösen Behandlungsbedingungen KRBH für die Verdünnung erfordern.
  2. Bereiten Sie ein Reservoir mit glukosefreiem KRBH vor. Dekantieren Sie das Medium von 96-Well-Platten, indem Sie die Platte schnell über eine Laborspüle umkehren und dann fest auf einem Stapel Papiertücher bumchen, um überschüssiges Medium zu entfernen.
  3. Mit einer elektronischen oder manuellen 8-Kanal-Pipette, Pipette 100 l /well KRBH aus dem Reservoir über die 96-Well-Platte(n). Wiederholen Sie dies für insgesamt zwei Wähbe.
  4. (Optionaler Schritt der Akutbehandlung) Wenn Sie keine medikamentösen Behandlungen durchführen, fahren Sie mit den Schritten 3.5 und 3.6 ohne Änderung fort. Um die Auswirkungen kleiner Moleküle auf die Insulinsekretion zu testen, können den Zellen während der Vorinkubationszeit, der Stimulationsphase oder beidem Verbindungen zugesetzt werden.
    1. Eine Technik besteht darin, dem KRBH in 1,5 ml-Rohren Chargen verbindungen hinzuzufügen und eine einstellbare 8-Kanal-Digitalpipette zu verwenden, um das Medikament-KRBH von den Röhren auf Zellen in 96-Well-Platten zu übertragen.
      HINWEIS: Wenn keine verstellbare Pipette verfügbar ist, kann eine Replik 96-Well-Platte von Drug-KRBH hergestellt werden und eine Standard 8-Kanal-Pipette kann verwendet werden, um Puffer zu übertragen. Weitere Änderungen am Behandlungsparadigma können vorgenommen werden, um Zellen für 24 h in Medien vor dem Test zu behandeln, wie zuvor beschrieben1,8.
  5. Fügen Sie 100 l KRBH mit der gewünschten Glukose- oder -konzentration hinzu und legen Sie die Schale 1 h im 37 °C-Inkubator.
    HINWEIS: Je nach experimentellem Layout ist es äußerst hilfreich, eine elektronische Mehrkanalpipette zu haben, die den Übergang der Kanalabstände von einer Säule von acht 1,5-ml-Rohren zu den 8 Reihen einer 96-Well-Platte ermöglicht.
  6. Nach der 1 h Der Inkubation den Puffer in die Spüle dekantieren und fest auf dem Papiertuch bumen. Fügen Sie 100 L glukosefreien KRBH pro Brunnen hinzu, um den angesammelten Hintergrund der Gaußsia-Luziferase wegzuwaschen. Decant die Platte wieder und fügen Sie Kontroll- und Stimulatorische Bedingungen auf die Platte bei 100 l pro Brunnen. Legen Sie die Schale in den 37°C Inkubator für 1 h.
  7. Sammeln Sie vorsichtig 50 l Überstand mit einer Mehrkanalpipette, wechseln Sie bei Bedarf die Spitzen zwischen den Behandlungsbedingungen, und übertragen Sie den Überstand auf eine saubere, undurchsichtige weiße 96-Well-Assay-Platte.
    HINWEIS: Weißwandige Klarbodenplatten können bei Bedarf verwendet werden, obwohl eine erhebliche Menge an Luziferase-Signal verloren geht.
  8. Nach der Entnahme von 50 l KRBH-Überstand kann die Probe sofort untersucht werden. Bei Bedarf Proben bei 4 °C für ein paar Tage (GLuc-Aktivität Halbwertszeit von 6 Tagen) oder -20 °C für bis zu einem Monat versiegeln und lagern11,12.

4. Abgesonderte Gaußierluzifase-Assay

  1. Um die GLuc-Assay-Arbeitslösung vorzubereiten, pipette die benötigte Menge an CTZ-Lagerlösung (4,2 l/ml) in den GLuc-Assaypuffer. Um eine Erwärmung des CTZ zu verhindern, pipetten Sie den CTZ schnell am -80 °C Gefrierschrank oder halten Sie das Rohr auf Trockeneis.
  2. Mit einer elektronischen Mehrkanalpipette können Sie schnell 50 L der GLuc-Assay-Arbeitslösung pro Brunnen über die 96-Well-Schale mit den gesammelten KRBH-Überwasserstoffen hinzufügen. Wenn sich tröpft an den Seiten von Brunnen Tröpfchen befinden, drehen Sie die Platte kurz in einer Tisch-Schaukel-Eimer-Zentrifuge.
  3. Lesen Sie die Lumineszenz in einem geeigneten Plattenleser innerhalb weniger Minuten und lesen Sie jeden gut mit einer 0,1 s Integrationszeit.

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Ergebnisse

Um die Leistung des Assays unter Kontrollbedingungen zu messen, kann eine einfache Glukose-Dosis-Wirkungs-Kurve oder eine Stimulation mit dem Diazoxid-Paradigma abgeschlossen werden. Im Falle ersterer sollte die Vorinkubation der Zellen für 1 h unter glukosefreien Bedingungen, gefolgt von der Behandlung von 1 h mit steigenden Glukosekonzentrationen, zu einer sehr geringen sekretotigen Aktivität bei und unter 5 mM führen, während eine erhöhte Sekretion über 8 mM Glukose (

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Diskussion

Hierbei stellen wir eine Methode zur schnellen Bewertung der Glukose-stimulierten Insulinsekretionsreaktionen aus MIN6-Zellen vor. Für die besten Antworten im Test ist es wichtig, die MIN6-Zellen bei der richtigen Dichte auszusäen und sie zu 85-95% konfluent zu machen. Dies verbessert die Zellreaktionen auf Glukose aufgrund verbesserter Zell-Zell-Kontakte und Synchronisation, die sowohl in primären Inselchen17,18,19,<...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Die Autoren danken allen aktuellen und ehemaligen Mitgliedern des Cobb-Labors für wertvolle Arbeit und Diskussionen und Dionne Ware für die Amtshilfe. Michael Kalwat wird von der Juvenile Diabetes Research Foundation SRA-2019-702-Q-R unterstützt. Möglich wurde diese Arbeit durch NIH R37 DK34128 und Welch Foundation Grant I1243 an Melanie Cobb. Frühe Teile dieser Arbeit wurden auch von einem NIH F32 DK100113 an Michael Kalwat unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Zellkulturmaterialien
rIns-GLuc stabile MIN6-ZellenElterliche MIN6-Zelllinie, die pcDNA3.1+rInsp-Ins-eGLuc stabil exprimiert und in 250 μg/ml G418
DMEMSigmaD64294,5 g/L Glukosemedium
fötales Rinderserum aufbewahrt, hitzeinaktiviertesSigmaF4135
Penicillin/ StreptomycinThermo-Fisher ScientificSV30010
Beta-MercaptoethanolThermo-Fisher ScientificBP 176-100
GlutaminThermo-Fisher ScientificBP379-100
Trypsin-EDTASigmaT3924-500
G418Gold BiotechnologyG418-10Stammlösung 250 mg/ml in Wasser. Frieren Sie die Aliquoten bei -20 °C ein.
T75 GewebekulturflaschenFisher Scientific07-202-000
96-Well-GewebekulturplattenCelltreat229196
Reagenzreservoire (50 mL)Corning4870
NameCompany<strong>KatalognummerKommentare
SekretionsassayBSA (RIA-Qualität
)Thermo-Fisher Scientific50-146-952
D-(+)-GlukoseSigmaG8270-1KG
KClThermo-Fisher ScientificP217-500
NaClThermo-Fisher ScientificS271-3
Hepes, pH 7,4Thermo-Fisher Scientific50-213-365
NaHCO3Thermo-Fisher Scientific15568414
MgCl2Thermo-FisherScientific M9272-500G
CaCl2SigmaC-7902
NameCompanyKatalognummer<>Kommentare
Optionale Medikamente für Stimulationsexperimente
DiazoxideSigmaD9035Stammlösung: 50 mM in 0,1N NaOH. Geben Sie die gleiche Menge von 0,1 N HCl zu jedem Puffer, dem Diazoxid zugesetzt wird.
Adrenalin (Bitartratsalz)SigmaE4375Stammlösung: 5 mM in Wasser
PMA (Phorbol-12-Myristat)SigmaP1585Stammlösung: 100 µ M in DMSO
strong>Name<>CompanyKatalognummerKommentare
Guassia Assay-Materialien
Dinatriumphosphat (Na2HPO4)Thermo-Fisher ScientificS374-500
GlycerinThermo-Fisher ScientificG334
NatriumbromidThermo-Fisher ScientificAC44680-1000
EDTAThermo-Fisher ScientificAC44608-5000Stammlösung: 0,5 M pH 8
TrisbaseRPIT60040-1000.0Stammlösung: 1 M pH 8
AscorbinsäureFisher ScientificAAA1775922Das US-Patent US7718389 darauf hindeutet, dass Ascorbat die Stabilität von Coelenterazin erhöhen kann.
Na2SO3SigmaS0505-250GUS-Patent US8367357 suggeriert, dass Sulfit den Hintergrund aufgrund von BSA verringern kann
Coelenterazin (nativ)Nanolight / Prolume3035MGStammlösung: 1 mg/ml in angesäuertem MeOH (2,36 mM)
OptiPlate-96, weiße, undurchsichtige 96-Well-MikroplattePerkin Elmer6005290Jede undurchsichtige weiße 96-Well-Platte sollte ausreichend sein. Durchsichtige Bodenplatten funktionieren auch, allerdings geht ein gewisses Signal verloren.
NameCompanyKatalognummerComments
<>Equipment
Synergy H1 Hybrid Plate Reader oder gleichwertigBioTek8041000Ein Platten-Reader mit Lumineszenzerkennung und 96-Well-Plattenfunktionen ist erforderlich.
8-Kanal VOYAGER Pipette (50-1250 &Mikro; L)Integra4724Eine automatisierte Mehrkanalpipette ist äußerst nützlich für die schnelle Zugabe von Luciferase-Reagenzien und Plattierungszellen im 96-Well-Format
8-Kanal 200 & Mikro; L PipetteTransferpette S 20-200 µ L2703710
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Referenzen

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