Messung der relativen Insulinsekretion mit einem co-secreted Luciferase Surrogate

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt, wie man schnelle low-cost Luziferase-Assays bei mittlerem Durchsatz mit einer Insulin-verknüpften Gaußsia-Luziferase als Proxy für Insulinsekretion aus Beta-Zellen durchführt. Der Assay kann mit den meisten Lumineszenzplattenlesern und Mehrkanalpipetten durchgeführt werden.

Zusammenfassung

Die Durchführung von Antikörper-basierten Assays für die sekrete Insulin-Nachprobensammlung erfordert in der Regel ein paar Stunden bis zu einem Tag Assay-Zeit und kann teuer sein, je nach dem spezifischen Assay. Abgesonderte Luziferase-Assays beschleunigen die Ergebnisse und senken die Assay-Kosten pro Probe erheblich. Hier stellen wir einen relativ ungenutzten Ansatz zur Messung der insulinsekretotischen Aktivität von Bauchspeicheldrüsenzellen mit Gaussia luciferase vor, die genetisch in das C-Peptid eingefügt wurde. Während der proteolytischen Verarbeitung von Proinsulin wird das C-Peptid ausgeschnitten und die Luziferase innerhalb des Insulinsekretotische vesikelfrei freigesetzt, wo es mit Insulin mitsekretiert wird. Die Ergebnisse können innerhalb von Minuten nach der Probenentnahme aufgrund der Geschwindigkeit von Luziferase-Assays erhalten werden. Eine Einschränkung des Assays ist, dass es sich um eine relative Messung der Insulinsekretion handelt und nicht um eine absolute Quantifizierung. Dieses Protokoll ist jedoch wirtschaftlich, skalierbar und kann mit den meisten Standard-Leuchtplattenlesern durchgeführt werden. Analoge und digitale Mehrkanalpipetten ermöglichen mehrere Schritte des Assays. Viele verschiedene experimentelle Variationen können gleichzeitig getestet werden. Sobald eine fokussierte Reihe von Bedingungen entschieden ist, sollten Insulinkonzentrationen direkt mit Antikörper-basierten Assays mit Standardkurven gemessen werden, um die Ergebnisse des Luziferase-Assays zu bestätigen.

Einleitung

Die hier vorgestellte Methode ermöglicht es, die Insulinsekretion aus einer genetisch veränderten Beta-Zelllinie schnell und kostengünstig im 96-Well-Platten-Format zu erhalten. Der Schlüssel zu diesem Protokoll ist eine modifizierte Version von Insulin mit der natürlich sezernierten Gaussia-Luziferase (GLuc, 18 kDa) in das C-Peptid eingeführt, um Insulin-Gaussia (InsGLuc)^1,2zu erzeugen. Andere größere Proteine, wie GFP (ca. 25 kDa), wurden erfolgreich in das C-Peptid von Insulin eingeführt und zeigten die erwartete posttranslationale Verarbeitung von Proinsulin-....

Protokoll

1. Herstellung von Reagenzien, Medien und Puffern (Tabelle 1)

1. Bereiten Sie MIN6-Komplettmedium in 500 ml hochglukosen (4,5 g/L) Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit folgenden Additiven vor: 15% fetales Rinderserum (FBS), 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 g/mL Streptomycin, 292 g/ml L-Glutamin und 50 Mercaptoethanol.
   HINWEIS: Die stabile Zelllinie wird in diesem Fall in 250 g/ml G418-Antibiotikum gehalten.
2. Bereiten Sie Krebs-Ringer BicarbonatPuffer (KRBH) durch eine Lösung mit 5 mM KCl, 120 mM NaCl, 15 mM HEPES (pH 7.4), 24 mM NaHCO₃, 1 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂und 1 mg/mL radioimmunoassay-grade Rinderserumal....

Ergebnisse

Um die Leistung des Assays unter Kontrollbedingungen zu messen, kann eine einfache Glukose-Dosis-Wirkungs-Kurve oder eine Stimulation mit dem Diazoxid-Paradigma abgeschlossen werden. Im Falle ersterer sollte die Vorinkubation der Zellen für 1 h unter glukosefreien Bedingungen, gefolgt von der Behandlung von 1 h mit steigenden Glukosekonzentrationen, zu einer sehr geringen sekretotigen Aktivität bei und unter 5 mM führen, während eine erhöhte Sekretion über 8 mM Glukose (

Diskussion

Hierbei stellen wir eine Methode zur schnellen Bewertung der Glukose-stimulierten Insulinsekretionsreaktionen aus MIN6-Zellen vor. Für die besten Antworten im Test ist es wichtig, die MIN6-Zellen bei der richtigen Dichte auszusäen und sie zu 85-95% konfluent zu machen. Dies verbessert die Zellreaktionen auf Glukose aufgrund verbesserter Zell-Zell-Kontakte und Synchronisation, die sowohl in primären Inselchen^17,18,19,<.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Zellkulturmaterialien
rIns-GLuc stabile MIN6-Zellen			Elterliche MIN6-Zelllinie, die pcDNA3.1+rInsp-Ins-eGLuc stabil exprimiert und in 250 μg/ml G418
DMEM	Sigma	D6429	4,5 g/L Glukosemedium
fötales Rinderserum aufbewahrt, hitzeinaktiviertes	Sigma	F4135
Penicillin/ Streptomycin	Thermo-Fisher Scientific	SV30010
Beta-Mercaptoethanol	Thermo-Fisher Scientific	BP 176-100
Glutamin	Thermo-Fisher Scientific	BP379-100
Trypsin-EDTA	Sigma	T3924-500
G418	Gold Biotechnology	G418-10	Stammlösung 250 mg/ml in Wasser. Frieren Sie die Aliquoten bei -20 °C ein.
T75 Gewebekulturflaschen	Fisher Scientific	07-202-000
96-Well-Gewebekulturplatten	Celltreat	229196
Reagenzreservoire (50 mL)	Corning	4870
Name	Company<	strong>Katalognummer	Kommentare
SekretionsassayBSA (RIA-Qualität
)	Thermo-Fisher Scientific	50-146-952
D-(+)-Glukose	Sigma	G8270-1KG
KCl	Thermo-Fisher Scientific	P217-500
NaCl	Thermo-Fisher Scientific	S271-3
Hepes, pH 7,4	Thermo-Fisher Scientific	50-213-365
NaHCO3	Thermo-Fisher Scientific	15568414
MgCl2	Thermo-Fisher	Scientific M9272-500G
CaCl2	Sigma	C-7902
Name	Company	Katalognummer	<>Kommentare
Optionale Medikamente für Stimulationsexperimente
Diazoxide	Sigma	D9035	Stammlösung: 50 mM in 0,1N NaOH. Geben Sie die gleiche Menge von 0,1 N HCl zu jedem Puffer, dem Diazoxid zugesetzt wird.
Adrenalin (Bitartratsalz)	Sigma	E4375	Stammlösung: 5 mM in Wasser
PMA (Phorbol-12-Myristat)	Sigma	P1585	Stammlösung: 100 µ M in DMSO
strong>Name	<>Company	Katalognummer	Kommentare
Guassia Assay-Materialien
Dinatriumphosphat (Na2HPO4)	Thermo-Fisher Scientific	S374-500
Glycerin	Thermo-Fisher Scientific	G334
Natriumbromid	Thermo-Fisher Scientific	AC44680-1000
EDTA	Thermo-Fisher Scientific	AC44608-5000	Stammlösung: 0,5 M pH 8
Trisbase	RPI	T60040-1000.0	Stammlösung: 1 M pH 8
Ascorbinsäure	Fisher Scientific	AAA1775922	Das US-Patent US7718389 darauf hindeutet, dass Ascorbat die Stabilität von Coelenterazin erhöhen kann.
Na2SO3	Sigma	S0505-250G	US-Patent US8367357 suggeriert, dass Sulfit den Hintergrund aufgrund von BSA verringern kann
Coelenterazin (nativ)	Nanolight / Prolume	3035MG	Stammlösung: 1 mg/ml in angesäuertem MeOH (2,36 mM)
OptiPlate-96, weiße, undurchsichtige 96-Well-Mikroplatte	Perkin Elmer	6005290	Jede undurchsichtige weiße 96-Well-Platte sollte ausreichend sein. Durchsichtige Bodenplatten funktionieren auch, allerdings geht ein gewisses Signal verloren.
Name	Company	Katalognummer	Comments
<>Equipment
Synergy H1 Hybrid Plate Reader oder gleichwertig	BioTek	8041000	Ein Platten-Reader mit Lumineszenzerkennung und 96-Well-Plattenfunktionen ist erforderlich.
8-Kanal VOYAGER Pipette (50-1250 &Mikro; L)	Integra	4724	Eine automatisierte Mehrkanalpipette ist äußerst nützlich für die schnelle Zugabe von Luciferase-Reagenzien und Plattierungszellen im 96-Well-Format
8-Kanal 200 & Mikro; L Pipette	Transferpette S 20-200 µ L	2703710

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