Methodenartikel

Herstellung von Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Zellen für die Adoptivimmuntherapie

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DOI:

10.3791/59949

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17. Dezember 2019

 , 
1Center for Cellular Immunotherapies, Perelman School of Medicine at the University of Pennsylvania

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben einen Ansatz zur zuverlässigen Generierung von chimeric antigen receptor (CAR) T-Zellen und testen deren Differenzierung und Funktion in vitro und in vivo.

Zusammenfassung

Die Adoptivimmuntherapie verspricht die Behandlung von Krebs und Infektionskrankheiten. Wir beschreiben einen einfachen Ansatz, um primäre menschliche T-Zellen mit chimärem Antigenrezeptor (CAR) zu transduzieren und ihre Nachkommen ex vivo zu erweitern. Wir umfassen Assays zur Messung des CAR-Ausdrucks sowie Differenzierung, Proliferativfähigkeit und zytolytische Aktivität. Wir beschreiben Assays zur Messung der Cytokinproduktion und der entzündlichen Zytokinsekretion in CAR-T-Zellen. Unser Ansatz bietet eine zuverlässige und umfassende Methode zur Kultur von CAR-T-Zellen für präklinische Modelle der Adoptivimmuntherapie.

Einleitung

Chimäre Antigenrezeptoren (CARs) bieten einen vielversprechenden Ansatz, um T-Zellen gegen verschiedene Tumorantigene umzuleiten. CARs sind synthetische Rezeptoren, die ein Antigenziel binden. Obwohl ihre genaue Zusammensetzung variabel ist, enthalten CARs im Allgemeinen 3 verschiedene Domänen. Die extrazelluläre Domäne leitet die Bindung an ein Zielantigen und besteht in der Regel aus einem einkettigen Antikörperfragment, das über ein extrazelluläres Scharnier mit dem CAR verknüpft ist. Die zweite Domäne, die üblicherweise von der CD3-Kette des T-Zell-Rezeptor-Komplexes (TCR) abgeleitet wird, fördert die T-Zellaktivierung nach CAR-Eingriff. Eine dritte Costimulatorische Domäne ist enthalten, um T-Zell-Funktion zu verbessern, Transplantation, Stoffwechsel, und Persistenz. Der Erfolg der CAR-T-Zelltherapie bei verschiedenen hämatopoetischen Malignomen, einschließlich akuter lymphatischer Leukämie (ALL), chronischer lymphatischer Leukämie (CLL) und multiplem Myelom, unterstreicht das therapeutische Versprechen dieses Ansatzes1,2,3,4,5,6. Die jüngsten Zulassungen der Food and Drug Administration (FDA) für zwei CD19-spezifische CAR-T-Zelltherapien, Tisagenlecleucel für pädiatrische und junge Erwachsene ALL und Axicabtagene ciloleucel für diffuses großes B-Zell-Lymphom, verstärken den translationalen Wert der CAR T-Zelltherapie.

CAR T-basierte Ansätze beinhalten die Isolierung von T-Zellen aus peripherem Blut, Aktivierung, genetische Veränderung und Expansion ex vivo. Die Differenzierung ist ein wichtiger Parameter, der die Wirksamkeit von CAR-T-Zellen reguliert. Dementsprechend verbessert die Einschränkung der T-Zell-Differenzierung während der Ex-vivo-Kultur die Fähigkeit des infundierten Produkts, sich zu engrafieren, zu erweitern und fortzubestehen, was eine langfristige Immunüberwachung nach derAdoption2,7,8,9bietet. T-Zellen bestehen aus mehreren unterschiedlichen Teilmengen, darunter: naive T-Zellen (Tn), Zentralgedächtnis (Tcm), Effektorspeicher (Tem), Effektor differenziert (Tte) und Stammzellgedächtnis (Tscm). Effektor differenzierte T-Zellen haben starke zytolytische Fähigkeit; jedoch sind sie kurzlebig und veredeln schlecht10,11,12. Im Gegensatz dazu weisen T-Zellen mit einem weniger differenzierten Phänotyp, einschließlich naiver T-Zellen und Tcm, nach der Adoptivzellübertragung13,14,15,16,17,18eine überlegene Engraftmentierung und proliferative Fähigkeiten auf. Die Zusammensetzung der gesammelten T-Zellen im vorgefertigten Produkt kann von Patient zu Patient variieren und korreliert mit dem therapeutischen Potenzial von CAR-T-Zellen. Der Anteil der T-Zellen mit einem naiven Immunophenotyp im Ausgangsapherese-Produkt ist stark korreliert mit der Transplantation und dem klinischen Ansprechen19.

Die Kulturdauer ist ein wichtiger Parameter, der die Differenzierung in CAR-T-Zellen beeinflusst, die für die Adoptivübertragung vorbereitet sind. Wir haben vor kurzem einen Ansatz entwickelt, um CAR-T-Zellen von höchster Qualität mit einem abgekürzten Kulturparadigma20zu erzeugen. Mit unserem Ansatz zeigten wir, dass eine begrenzte Kultur zu CAR-T-Zellen mit überlegener Effektorfunktion und Persistenz nach Derisübertragung bei Xenograft-Modellen von Leukämie führt. Hier stellen wir die Ansätze zur zuverlässigen Generierung von CART19-Zellen vor (autologe T-Zellen, die entwickelt wurden, um Anti-CD19-SCFv auszudrücken, die an CD3- und die 4-1BB-Signal-Domains angehängt sind) und enthalten eine detaillierte Beschreibung der Assays, die Einblicke in car T Bioaktivität und Wirksamkeit vor der Adoptionsübertragung geben.

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Protokoll

Alle Tierstudien werden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Pennsylvania genehmigt.

1. T-Zellaktivierung, Transduktion und Erweiterung

  1. Aktivieren Sie frische oder kryokonservierte primäre menschliche T-Zellen, indem Sie mit Anti-CD3/CD28-Magnetperlen (z. B. Dynabeads) im Verhältnis 3 Perlen pro T-Zelle in 6-Well-Zellkulturschalen mischen. Kultur-T-Zellen in X-VIVO 15 Medium ergänzt mit 5% normalem humanem AB-Serum, 2 mM L-Glutamin, 20 mM HEPES und IL2 (100 Einheiten/ml). Halten Sie T-Zellen bei einer Konzentration von 106 T-Zellen/ml während der Expansion. Kultur-T-Zellen bei 37 °C, 20%O2und 95% Luftfeuchtigkeit mit 5%CO2.
  2. Nach der nächtlichen Stimulation lentiviralen Überstand zu aktivierten T-Zellen hinzufügen. Berechnen Sie das Volumen des Überstandes, der notwendig ist, um eine Vielzahl von Infektionen (MOI) von 3-5 zu erreichen.
    HINWEIS: Das CD19-BB-CAR-Lentivirus-Plasmid besteht aus einem CD8-Scharnier, einer 4-1BB-Costimulatorei und einer CD3-Signalisierungsdomäne21. Cd19-BB-Lentiviralüberstand wurde wie zuvor beschrieben21erzeugt.
  3. Sammeln Sie am 3. Tag ein repräsentatives Aliquot von Zellen zur Kryokonservierung. Entfernen Sie vor der Kryokonservierung die magnetischen Perlen durch sanfte Pipettierung und magnetische Trennung. Gefriermedium mit Phosphatgepufferter Saline (PBS) mit 0,5 % Dimethylsulfoxid (DMSO) zubereiten und bis zur Verwendung in 4 °C lagern.
    1. Zentrifugen-T-Zellen bei 300 x g für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie 5 ml PBS hinzu. Zentrifugenzellen bei 300 x g für 5 min und entsorgen die PBS.
    2. Das Zellpellet in 1 ml kaltem Kryokonservierungsmedium wieder aufhängen. T-Zellen in einem gekühlten Gefrierbehälter einfrieren und bei -80 °C für 48 h lagern. Die gefrorenen Zellen in flüssigen Stickstoff übertragen.
  4. Waschen Sie den Rest der T-Zellen einmal in 5 ml PBS, um den Restvektor zu eliminieren. Zentrifugieren bei 300 x g für 5 min. Dekantieren Sie das PBS und setzen Sie das Zellpellet in T-Zellkulturmedium in einer Konzentration von 0,5 x 106 Zellen/ml wieder auf.
  5. Teilen Sie die T-Zellen in zwei Kulturen auf, die für Tag 5 und Tag 9 bestimmt sind. Zähl-T-Zellen nach Durchflusszytometrie mit Zählperlen (Materialtabelle) und monoklonalen Antikörpern gegen menschliche CD4 und CD8 sowie einem Lebensfähigkeitsfarbstoff (Materialtabelle).
    1. Zur Messung der T-Zellkonzentration können Sie einen Master-Mix mit 500 l PBS, 5 l Zählperlen, 10 l 7-Amino-Actinomycin D-Zelllebensfähigkeitslösung, 4 l CD4-FITC und 4 l CD8-APC, vorbereiten. Fügen Sie dem Master-Mix 40 L T-Zellen hinzu und messen Sie die Zellkonzentration anhand der Durchflusszytometrie basierend auf der Anzahl der lebenden T-Zellen/Perlenzahlen. Refeed, um die Kulturen in einer Konzentration von 0,5 x 106 Zellen/ml jeden zweiten Tag zu erhalten.
  6. Zählen Sie am 5. Tag die Kulturen des 5. Tages, wie in den Schritten 1.3 und 1.5 beschrieben.
  7. Waschen Sie am 7. Tag 0,5 x 106 T-Zellen in PBS und setzen Sie sie in 100 l Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierungspuffer (FACS) wieder auf. Detektieren Sie die EXPRESSION von CAR-Oberflächenproteinen durch Immunfärbung mit einem fluoreszierend konjugierten Anti-CAR19-Idiotyp durch Durchflusszytometrie.
  8. Zählen Sie am 9. Tag die Kulturen und das Kryokonserven, wie in Schritt 1.3 beschrieben.

2. Phänotypische Beurteilung der T-Zell-Differenzierung

  1. Vorbereiten eines Master-Mix mit vortitierten Antikörpern für Anti-CD3-BV605 (Klon OKT3), Anti-CD14-Pacific Blue (PB) (Klon HCD14), Anti-CD19-PB (Klon HIB19), Anti-CD4-BV510 (Klon OKT4), Anti-CD8–H7APC (Klon SK1), Anti-CCR7–FITC (Klon 150503), Anti-CD45RO-PE (Klon UCHL1), Anti-CD27–PE-Cy7 (Klon 1A4CD27), Anti-CD95–PerCP-Cy5.5 (Clone DX2) und anti-CAR19-APC.
  2. Bereiten Sie individuelle Fluoreszenz-Minus-Eins-Steuerungen (FMO) für Anti-CD45RO-PE, Anti-CCR7-FITC, Anti-CD27-PE-Cy7 und Anti-CD95-PerCP-Cy5.5 vor, um positiv gefärbte Zellen vom Hintergrund zu unterscheiden.
  3. Bereiten Sie tote Zell-Färbung Lösung durch Verdünnen leben / tote Lager Reagenz (Tabelle der Materialien) 1:10,000 in PBS.
  4. Tauen Tag 3, Tag 5, und Tag 9 T-Zellen, die zuvor kryokonserviert waren. Zentrifuge 1 x 106 T Zellen aus jeder Gruppe bei 300 x g für 3 min. Entsorgen Sie den Überstand. Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS. Zentrifugieren Sie bei 300 x g für 3 min und entsorgen Sie die PBS.
  5. Mischen Sie T-Zellen mit abgestorbener Färbelösung für 15 min bei Raumtemperatur (RT), geschützt vor dem Licht.
  6. Fügen Sie 1 ml FACS-Puffer hinzu, um den Färber farbstoff für tote Zellen zu löschen. Zentrifugieren Sie bei 300 x g für 3 min den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in 100 l FACS-Puffer mit dem in Schritt 2.1 und 2.2 beschriebenen Antikörpercocktail wieder auf. 1 h bei 4 °C inkubieren.
  7. Fügen Sie 1 ml FACS-Puffer und Zentrifuge bei 300 x g für 3 min hinzu, um ungebundenen Antikörper abzuwaschen. Wiederholen Sie dies dreimal mit dem FACS-Puffer.
  8. Zellen in 1% Paraformaldehyd (PFA) aussetzen und bei 4 °C lagern.
  9. Wenn die CD45RO-Expression nach der Fixierung abnimmt, analysieren Sie die Proben nach der Immunfärbung durch Durchflusszytometrie. Zur Beurteilung der Differenzierung, Gate in der folgenden Reihenfolge: Singlets (FSC-H vs FSC-A), Live CD3+ T Zellen (Dump [live-dead violet, CD14-PB und CD19-PB vs CD3-BV605], CD4-BV510 vs CD8-APC-H7). In CD4+ und CD8+ Teilmengen, Gate auf CD45RO-PE vs CCR7-FITC naiv-ähnliche T-Zellen zu definieren (CD45RO-CCR7+), Tcm (CD45RO+CCR7+), Tem (CD45RO+CCR7-), und Tte (CD45RO-CCR7-). Um Tscm zu identifizieren, Gate auf CD27+ T-Zellen in naiven T-Zellen Population. In diesem Fach sind Tscm CD95+ und Tn cd95-.

3. In-Vitro-Funktionsanalyse

  1. CAR T Zellproliferation und Zytokinsekretion
    1. Überprüfen Sie die CAR-Expression sowie die Zelllebensfähigkeit, wie in den Schritten 1.5 und 1.7 beschrieben, durch Durchflusszytometrie.
    2. 5 x 106 T-Zellen aus jeder Gruppe (Tag 3, Tag 5 und Tag 9) mit PBS waschen und in einer 1-M-Lösung von Carboxyfluorescein-Diacetat-Präparaten (CFSE) in PBS für 3,5 min bei RT resuspendieren.
    3. Fügen Sie sofort 10 ml PBS mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) hinzu, um die Reaktion zu löschen.
    4. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 300 x g für 3 min. Entsorgen Sie den Überstand und wiederholen Sie diesen Waschschritt dreimal. Zählen Sie die Zellen am Ende der CFSE-Färbung mit einem Coulter-Zähler (Materialtabelle).
    5. CFSE-gefärbte Zellen (unstimuliert) ernten, in 1% PFA wieder aussetzen und bei 4 °C zur Analyse durch Durchflusszytometrie lagern.
    6. Inkubieren Sie die gewünschte Anzahl von CFSE-gebeizten CAR-T-Zellen mit bestrahltem K562-CD19 (Ziel) sowie K562-Wild-Typ (Kontroll)-Zellen im Verhältnis 1:1 für 120 h in zytokinfreien Medien- und Kulturbedingungen, wie in Schritt 1.1 beschrieben.
    7. Nach 24 h zentrieren Sie das Kulturgefäß bei 300 x g für 5 min. Sammeln Sie 120 l zellulären Überstand. Bewerten Sie die aktivierungsabhängige Produktion von IL2- und IFN-, TNF-, GM-CSF- und anderen entzündlichen Zytokinen (IL1, IL4, IL5, IL6, IL8 und IL10) durch Luminex-Analysen gemäß den Empfehlungen des Herstellers.
    8. Ersetzen Sie das in Schritt 3.1.7 gesammelte Überstandvolumen durch ein entsprechendes Volumen (120 l) frisches Medium.
    9. An Tag 3 (d.h. nach 96 h) zählen und re-feed in einer Konzentration von 0,5 x 106 Zellen/ml mit Perlen-basierter Durchflusszytometrie wie zuvor in Schritt 1.5.
    10. Zählen Sie am 5. Tag die Live-CD3+ Zellen und berechnen Sie die Faltenänderung der lebenden T-Zellen relativ zur Anzahl der lebenden T-Zellen an Tag 0.
    11. Führen Sie eine umfassende Analyse der CFSE-Verdünnung durch, indem Sie CAR T-Zellen mithilfe der FlowJo-Software teilen, um aufeinanderfolgende Runden der Zellteilung hervorzuheben.
      HINWEIS: Proliferationstests sind im FlowJo-Handbuch gut beschrieben.
  2. Zytotoxizitätstest
    HINWEIS: Die Fähigkeit von CART19-Zellen, Zielzellen zu töten, die CD19 exdrücken, wird mit einem 51Cr-Release-Assay ausgewertet.
    1. Beschriften Sie die Zielzellen durch Mischen von 5 x 105 K562-CD19, K562-Wild-Typ-Kontrollzellen oder NALM6-Leukämiezellen mit 50 l Na251CrO4 und 0,5 ml RPMI, ergänzt mit 10% FBS für 90 min im Inkubator bei 37 °C.
    2. Zentrifugenzellen bei 300 x g für 2,5 min. Entsorgen Sie den radioaktiven Überstand in geeigneten Entsorgungsbehältern und waschen Sie die Zielzellen in 5 ml PBS. Wiederholen Sie die Waschschritte zweimal.
    3. Setzen Sie die Zielzellen in phenolrot-freiem Medium mit 5% FBS aus. Verwenden Sie dieses Medium für den Rest der Prozedur, um den Hintergrund zu reduzieren.
    4. Nach Auswertung der CAR-Expression und Zelllebensfähigkeit durch Durchflusszytometrie (wie in Abschnitt 5.1 beschrieben) mischen SIE CAR-T-Zellen mit beschrifteten Zielzellen bei Effektor:Target(E:T)-Verhältnissen von 10:1, 3:1 und 1:1 in Dreifachform. Transfer auf eine 96-Well U Bodenplatte.
    5. Parallel dazu umfassen Sie Zielzellen allein und Zielzellen mit 1% Natriumdodecylsulfat (SDS), um die spontane (S) und maximale (M) 51Cr-Freisetzung zu bestimmen.
    6. Zentrifugenzellen bei 300 x g für 5 min und inkubieren für 4 h oder 20 h in einem 37 °C Inkubator mit 5%CO2.
    7. Zentrifugieren Sie nach der vorgesehenen Zeit das Kulturgefäß bei 300 x g für 5 min. Sammeln Sie 35 L Zellüberstand und übertragen Sie es auf eine Leseplatte. Vermeiden Sie Blasen. Lassen Sie die Platte über Nacht trocknen.
    8. Versiegeln Sie die Platte mit einer Standardplattendichtung und zählen Sie mit einem flüssigen Szintillationszähler. Chromüberfluss im Überstand bietet einen Proxy für die Tötung von Zielzellen. Berechnen Sie den Prozentsatz der spezifischen Lyse wie folgt: 100 x (Zählungen pro Minute [cpm] experimentelle Veröffentlichung – cpm S Release)/ (cpm M release – cpm S release).

4. In Vivo Funktionsanalyse

  1. Erhalten Sie 6-10 Wochen alte NOD-SCID-Mäuse , die kein adaptives Immunsystem haben, und weisen Sie sie nach dem Zufallsprinzip der Behandlungs-/Kontrollgruppe zu.
  2. Injizieren Sie Tiere intravenös über Schwanzvene mit 1 x 106 NALM6 Zellen in 0,1 ml sterile PBS.
  3. Nach 5 bis 7 Tagen die Tumorengraftment durch Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) bestätigen. Injizieren Sie 150 mg/kg D-Luziferin an Mäuse, die mit Isofluran anbesstattet wurden (Das Volumen ist abhängig von der Körpermasse).
  4. Messen Sie Biolumineszenzwerte mit einem Bildgebungssystem. Quantifizieren Sie den Gesamtfluss mit der entsprechenden Software, indem Sie Rechtecke mit identischer Fläche um Mäuse zeichnen, die vom Kopf bis zu 50 % der Schwanzlänge reichen. Subtrahieren Sie den Hintergrund für jedes Bild einzeln.
  5. Nach der Leukämie-Infektion 3 x 106 Tag 9 CART19-Zellen, 0,5 x 106 Tage 3 CAR-T-Zellen oder entsprechende nicht transducierte (NTD) menschliche T-Zellen über Schwanzvene in einem Volumen von 100 l sterilen PBS/Ca2+injizieren.
    HINWEIS: Da die Bioaktivität der Zellen, die in verschiedenen Intervallen während des Kulturprozesses geerntet werden, unterschiedlich ist, ist die gewählte Konzentration von Tag-3-Zellen niedriger als Tag 9.
  6. Um das Fortschreiten der Krankheit zu bestimmen, messen Sie die Biolumineszenzwerte zweimal pro Woche, wie oben in Schritt 4.3 beschrieben.
  7. Um die CAR-T-Zellengraftierung zu bestimmen, sammeln Sie 75 L Blut durch retroorbitale Blutungen in einem EDTA-beschichteten Röhrchen. Übertragen Sie 50 l Blut in absolute Zählröhrchen.
  8. Blut mit Antikörpern gegen CD45, CD4, CD8 und CAR 30 min bei RT färben. Fügen Sie den Röhrchen und Wirbeln 400 l 1x FACS-Lysinglösung gründlich hinzu. Analysieren Sie nach der Färbung den Oberflächenmarkerausdruck durch Durchflusszytometrie.
    HINWEIS: Andere Oberflächenmarker können verwendet werden, um den Differenzierungs- und Erschöpfungsstatus der T-Zellen im Blut zu bewerten.
  9. Um den Zytokinspiegel im Blut zu messen, zentrifugieren Sie das Blut bei 1.200 x g für 30 min bei 4 °C, um Serum von der oberen Blutschicht zu trennen.
  10. Serum sammeln und die Zytokine mit einer bestimmten Leseplatte gemäß den Anweisungen des Herstellers messen.

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Ergebnisse

Mit den oben beschriebenen Methoden stimulierten und erweiterten wir T-Zellen für 3 oder 9 Tage(Abbildung 1A,B). Wir analysierten auch ihr Differenzierungsprofil, wie in der in Abbildung 1Cbeschriebenen Gating-Strategie angegeben, indem wir die Häufigkeit von verschiedenen Glykoproteinen, die auf der Zelloberfläche exprimiert werden, gemessen haben. Wir zeigen eine fortschreitende Verschiebung hin zur Effektordifferenzierung im ...

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Diskussion

Hier beschreiben wir Ansätze zur Messung der Funktion und Wirksamkeit von CAR-T-Zellen, die in unterschiedlichen Intervallen in der Ex-vivo-Kultur geerntet werden. Unsere Methoden bieten umfassende Einblicke in Assays zur Beurteilung der Proliferativen Kapazität sowie der Effektorfunktion in vitro. Wir beschreiben, wie man die AKTIVITÄT von CAR T-Zellen nach Stimulation durch die CAR misst und Xenograft-Modelle von Leukämie mit CAR-T-Zellen detailliert beschreibt, die am Tag 3 gegen Tag 9 ihrer logarithmischen Expansions...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde teilweise durch die Finanzierung durch Novartis Pharmaceuticals durch eine Forschungsallianz mit der University of Pennsylvania (Michael C. Milone) sowie den St. Baldrick es Foundation Scholar Award (Saba Ghassemi) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Anti-CD3/CD28-DynabeadsThermo Fisher40203D
APC Maus Anti-Human CD8BD Biosciences555369RRID:AB_398595
APC-H7 Maus Anti-Human-CD8-AntikörperBD Biosciences560179RRID:AB_1645481
BD FACS Lysing Solution 10X KonzentratBD Biosciences349202
BD Trucount Absolute ZählröhrchenBD Biosciences340334
Brilliant Violet 510 Anti-Human-CD4-AntikörperBioLegend317444RRID:AB_2561866
Brilliant Violet 605 Anti-Human-CD3-AntikörperBioLegend 317322RRID:AB_2561911
CellTrace CFSE Cell Proliferation KitLife TechnolohgiesC34554
CountBright Absolute Counting Beads,InvitrogenC36950
FITC Anti-Human CD197 (CCR7) AntikörperBD Pharmingen561271RRID:AB_10561679
FITC Maus Anti-Human CD4BD Biosciences555346RRID:AB_395751
HEPESGibco15630-080
Human AB SerumValley BiomedicalHP1022
Human IL-2 IS, Premium-QualitätMiltenyi130-097-744
L-GlutaminGibco28030-081
Flüssiger Szintillationszähler, MicroBeta triluxPerkin Elmer
LIVE/DEAD Fixierbareviolette MolekularsondenL34964
Multisizer ScharzählerBeckman Schar
Na251CrO4Perkin ElmerNEZ030S001MC
Pacific Blauer Anti-Human-CD14-AntikörperBioLegend325616RRID:AB_830689
Pacific Blue Anti-Human-CD19-AntikörperBioLegend302223
PE Anti-Human-CD45RO-AntikörperBD Biosciences555493RRID:AB_395884
PE/Cy5 Anti-Human-CD95 (Fas)-AntikörperBioLegend305610RRID:AB_493652
PE/Cy7 Anti-Human-CD27-AntikörperBeckman CoulterA54823
Phenolrotfreies MediumGibco10373-017
UltraPure SDS-Lösung, 10%Invitrogen15553027
Via-ProbeBD Biosciences555815
X-VIVO 15Gibco04-418Q
XenoLight D-Luciferin - K+ SalzPerkin Elmer122799

Referenzen

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