Herstellung von Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Zellen für die Adoptivimmuntherapie

Zusammenfassung

Wir beschreiben einen Ansatz zur zuverlässigen Generierung von chimeric antigen receptor (CAR) T-Zellen und testen deren Differenzierung und Funktion in vitro und in vivo.

Zusammenfassung

Die Adoptivimmuntherapie verspricht die Behandlung von Krebs und Infektionskrankheiten. Wir beschreiben einen einfachen Ansatz, um primäre menschliche T-Zellen mit chimärem Antigenrezeptor (CAR) zu transduzieren und ihre Nachkommen ex vivo zu erweitern. Wir umfassen Assays zur Messung des CAR-Ausdrucks sowie Differenzierung, Proliferativfähigkeit und zytolytische Aktivität. Wir beschreiben Assays zur Messung der Cytokinproduktion und der entzündlichen Zytokinsekretion in CAR-T-Zellen. Unser Ansatz bietet eine zuverlässige und umfassende Methode zur Kultur von CAR-T-Zellen für präklinische Modelle der Adoptivimmuntherapie.

Einleitung

Chimäre Antigenrezeptoren (CARs) bieten einen vielversprechenden Ansatz, um T-Zellen gegen verschiedene Tumorantigene umzuleiten. CARs sind synthetische Rezeptoren, die ein Antigenziel binden. Obwohl ihre genaue Zusammensetzung variabel ist, enthalten CARs im Allgemeinen 3 verschiedene Domänen. Die extrazelluläre Domäne leitet die Bindung an ein Zielantigen und besteht in der Regel aus einem einkettigen Antikörperfragment, das über ein extrazelluläres Scharnier mit dem CAR verknüpft ist. Die zweite Domäne, die üblicherweise von der CD3-Kette des T-Zell-Rezeptor-Komplexes (TCR) abgeleitet wird, fördert die T-Zellaktivierung nach CAR-Eingriff. Eine dritte Costimulatoris....

Protokoll

Alle Tierstudien werden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Pennsylvania genehmigt.

1. T-Zellaktivierung, Transduktion und Erweiterung

1. Aktivieren Sie frische oder kryokonservierte primäre menschliche T-Zellen, indem Sie mit Anti-CD3/CD28-Magnetperlen (z. B. Dynabeads) im Verhältnis 3 Perlen pro T-Zelle in 6-Well-Zellkulturschalen mischen. Kultur-T-Zellen in X-VIVO 15 Medium ergänzt mit 5% normalem humanem AB-Serum, 2 mM L-Glutamin, 20 mM HEPES und IL2 (100 Einheiten/ml). Halten Sie T-Zellen bei einer Konzentration von 10⁶ T-Zellen/ml während der Expansion. Kultur-T-Zellen bei 37 °C, 20%

Ergebnisse

Mit den oben beschriebenen Methoden stimulierten und erweiterten wir T-Zellen für 3 oder 9 Tage(Abbildung 1A,B). Wir analysierten auch ihr Differenzierungsprofil, wie in der in Abbildung 1Cbeschriebenen Gating-Strategie angegeben, indem wir die Häufigkeit von verschiedenen Glykoproteinen, die auf der Zelloberfläche exprimiert werden, gemessen haben. Wir zeigen eine fortschreitende Verschiebung hin zur Effektordifferenzierung im .......

Diskussion

Hier beschreiben wir Ansätze zur Messung der Funktion und Wirksamkeit von CAR-T-Zellen, die in unterschiedlichen Intervallen in der Ex-vivo-Kultur geerntet werden. Unsere Methoden bieten umfassende Einblicke in Assays zur Beurteilung der Proliferativen Kapazität sowie der Effektorfunktion in vitro. Wir beschreiben, wie man die AKTIVITÄT von CAR T-Zellen nach Stimulation durch die CAR misst und Xenograft-Modelle von Leukämie mit CAR-T-Zellen detailliert beschreibt, die am Tag 3 gegen Tag 9 ihrer logarithmischen Expansions.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Anti-CD3/CD28-Dynabeads	Thermo Fisher	40203D
APC Maus Anti-Human CD8	BD Biosciences	555369	RRID:AB_398595
APC-H7 Maus Anti-Human-CD8-Antikörper	BD Biosciences	560179	RRID:AB_1645481
BD FACS Lysing Solution 10X Konzentrat	BD Biosciences	349202
BD Trucount Absolute Zählröhrchen	BD Biosciences	340334
Brilliant Violet 510 Anti-Human-CD4-Antikörper	BioLegend	317444	RRID:AB_2561866
Brilliant Violet 605 Anti-Human-CD3-Antikörper	BioLegend 317322		RRID:AB_2561911
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit	Life Technolohgies	C34554
CountBright Absolute Counting Beads,Invitrogen		C36950
FITC Anti-Human CD197 (CCR7) Antikörper	BD Pharmingen	561271	RRID:AB_10561679
FITC Maus Anti-Human CD4	BD Biosciences	555346	RRID:AB_395751
HEPES	Gibco	15630-080
Human AB Serum	Valley Biomedical	HP1022
Human IL-2 IS, Premium-Qualität	Miltenyi	130-097-744
L-Glutamin	Gibco	28030-081
Flüssiger Szintillationszähler, MicroBeta trilux	Perkin Elmer
LIVE/DEAD Fixierbare	violette Molekularsonden	L34964
Multisizer Scharzähler	Beckman Schar
Na251CrO4	Perkin Elmer	NEZ030S001MC
Pacific Blauer Anti-Human-CD14-Antikörper	BioLegend	325616	RRID:AB_830689
Pacific Blue Anti-Human-CD19-Antikörper	BioLegend	302223
PE Anti-Human-CD45RO-Antikörper	BD Biosciences	555493	RRID:AB_395884
PE/Cy5 Anti-Human-CD95 (Fas)-Antikörper	BioLegend	305610	RRID:AB_493652
PE/Cy7 Anti-Human-CD27-Antikörper	Beckman Coulter	A54823
Phenolrotfreies Medium	Gibco	10373-017
UltraPure SDS-Lösung, 10%	Invitrogen	15553027
Via-Probe	BD Biosciences	555815
X-VIVO 15	Gibco	04-418Q
XenoLight D-Luciferin - K+ Salz	Perkin Elmer	122799