Hier stellen wir ein Protokoll zum Nachweis von 5-Hydroxymethylcytosin in Zellen und Hirngeweben vor, wobei Immunfluoreszenzfärbungundungen und DNA-Dot-Blot-Methoden verwendet werden.
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Methodenartikel
Der Nachweis von 5-Hydroxymethylcytosin in neuralen Stammzellen und Gehirnen von Mäusen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Im Säugetiergenom wurden mehrere DNA-Modifikationen identifiziert. Davon wurden 5-Methylcytosin und 5-Hydroxymethylcytosin-vermittelte epigenetische Mechanismen intensiv untersucht. 5-Hydroxymethylcytosin zeigt dynamische Merkmale während der embryonalen und postnatalen Entwicklung des Gehirns, spielt eine regulierende Funktion in der Genexpression und ist an mehreren neurologischen Störungen beteiligt. Hier beschreiben wir die detaillierten Methoden einschließlich Immunfluoreszenzfärbung und DNA-Dot-Blot zum Nachweis von 5-Hydroxymethylcytosin in kultivierten Zellen und Gehirngeweben der Maus.
Einleitung
Epigenetische Modifikationen, einschließlich DNA-Modifikation, Histonmodifikation und RNA-Modifikation, haben gezeigt, dass sie wesentliche Funktionen in verschiedenen biologischen Prozessen und Krankheiten spielen1,2,3, 4 , 5 , 6 , 7. Lange Zeit wurde die DNA-Methylierung (d.h. 5-Methylcytosin (5-mC)) als hochstabiler epigenetischer Marker angesehen und kann im Genom nicht weiter modifiziert werden. Kürzlich wurde festgestellt, dass 5-mC....
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Protokoll
Alle Tierverfahren wurden von der Tierethikkommission der Universität Zhejiang genehmigt.
1. Die Kultur der adulten neuronalen Stammzellen und Neuronen
- Isolieren Sie adulte neuronale Stammzellen aus dem Vorderhirn einer Erwachsenen (8-10 Wochen alt) C57/BL6 männliche Maus wie zuvor beschrieben31,32.
- Kultur adulte neuronale Stammzellen in DMEM/F-12 Medium mit 20 ng/mL FGF-2, 20 ng/mL EGF, 2% B27-Ergänzung, 1% Antimykotik und 2 mM L-Glutamin in einem 5%CO2-Inkubator bei 37 °C. Induzieren Sie die Differenzierung von adulten neuronalen Stammzellen mit 1 M ....
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Ergebnisse
Um die Verteilung von 5-hmC im Hippocampus von erwachsenen Mäusen zu zeigen, führten wir Immunfluoreszenz mit Antikörpern gegen neuronale Zellen (NeuN) und 5-hmC durch. Im Hippocampus, 5-hmC ko-lokalisiert gut mit neuronalen Zellmarker NeuN (Abbildung 1A-H), was auf eine Anreicherung von 5-hmC in Neuronen.
Um die Dynamik von 5-hmC während der neuronalen Entwicklung zu bestimmen, wurde zuerst ein Punktblot mit DNA-Proben durchgeführt, die aus verme.......
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Diskussion
Epigenetische Modifikationen spielen eine wesentliche Rolle bei der Entwicklung, Reifung und Funktion des Gehirns. Als stabiler Marker für die DNA-Modifikation reagiert dynamisches 5-hmC auf Verhaltensanpassung, neuronale Aktivität und ist positiv mit der Genexpression korreliert; somit ist es an der normalen Funktion des Gehirns und der neurologischen Störungbeteiligt 4. Um seine Funktion in Zellen und Geweben zu erforschen, ist es notwendig, die Existenz von 5-hmC zu erkennen und den Pegel vor u.......
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Offenlegungen
Es gibt keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Danksagungen
XL wurde teilweise vom National Key R&D Program of China (2017YFE0196600) und der National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 31771395, 31571518) unterstützt. Q.S. wurde vom National Key Research and Development Program of China (2017YFC1001703) und dem Key Research and Development Program der Provinz Zhejiang (2017C03009) unterstützt. W.X. wurde von der Natural Science Foundation der Provinz Zhejiang (LY18H020002) und der Abteilung für Wissenschaftstechnologie der Provinz Zhejiang (2017C37057) unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 4'-6-diamidino-2-phenylindol (DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | |
| Adobe Photoshop Software | Adobe Inc. | / | |
| Alexa Fluor 488 Anti-Kaninchen-IgG | Thermo Fisher | A11008 | |
| Alexa Fluor 568 Anti-Maus-IgG | Thermo Fisher | A11001 | |
| Anti-5-Hydroxymethylcytosin | Active Motif | 39769 | |
| Anti-NeuN | Millipore | MAB377 | |
| B27 Supplement | Gibco | 12587-010 | |
| B27 Supplement | Gibco | 12580-010 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Kryostat Mikrotom | Leica | CM1950 | |
| DMEM/F-12 medium | OmegaScientific | DM25 | |
| Epidermaler Wachstumsfaktor | PeproTech | 100-15 | |
| Fibroblasten-Wachstumsfaktor-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886 | |
| GlutaMax | Thermo | 35050061 | |
| L-Glutamin | Gibco | 25030-149 | |
| Neurobasales Medium | Gibco | 21103-049 | |
| Normales Ziegenserum | Vector Laboratories | Z0325 | |
| Nylonmembran (Hybond™-N+ ) | Amersham Biosciences | ||
| OCT | Leica | 14020108926 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol (25: 24:1 ) | Sigma-Aldrich | 516726 | |
| Poly-D-Lysin | Sigma | P0899-10 | |
| Proteinase K | VVR | 39450-01-6 | |
| Retinsäure | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| Triton X-100 | Solarbio | T8210 |
Referenzen
- Tan, L., Shi, Y. G. Tet family proteins and 5-hydroxymethylcytosine in development and disease. Development. 139 (11), 1895-1902 (2012).
- Yao, B., et al. Epigenetic mechanisms in neurogenesis. Nature Reviews Neuroscience. 17 (9), 537-549 (2016).
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Nachdrucke und Genehmigungen
