Dieses Protokoll beschreibt mehrere Verfahren zur Herstellung hochwertiger gefrorener Gewebeproben zum Zeitpunkt der Nekropsie zur Verwendung im Kometentest zur Beurteilung von DNA-Schäden: 1) Hackfleisch, 2) abgekratzte Epithelzellen aus dem Magen-Darm-Trakt und 3) gewürfeltes Gewebe Eine Homogenisierung mit einem Gewebeminincing-Gerät erforderlich.
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Methodenartikel
Verwendung von gefrorenem Gewebe im Kometentest zur Bewertung von DNA-Schäden
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Der Kometentest gewinnt an Popularität als Mittel zur Bewertung von DNA-Schäden in kultivierten Zellen und Geweben, insbesondere nach der Exposition gegenüber Chemikalien oder anderen Umweltstressoren. Die Verwendung des Kometentests bei regulatorischen Tests auf genotoxisches Potenzial bei Nagetieren wurde durch die Annahme einer Testrichtlinie der Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung (OECD) im Jahr 2014 vorangetrieben. Kometen-Assay-Dias werden in der Regel aus frischem Gewebe zum Zeitpunkt der Nekropsie zubereitet; Das Einfrieren von Gewebeproben kann jedoch logistische Herausforderungen vermeiden, die mit der gleichzeitigen Vorbereitung von Dias aus mehreren Organen pro Tier und von vielen Tieren pro Studie verbunden sind. Das Einfrieren ermöglicht auch den Versand von Proben aus der Expositionseinrichtung an ein anderes Labor zur Analyse, und die Lagerung von gefrorenem Gewebe erleichtert das Aufschieben einer Entscheidung über die Generierung von DNA-Schadensdaten für ein bestimmtes Organ. Der alkalische Kometentest ist nützlich, um expositionsbedingte DNA-Doppel- und Einstrangbrüche, alkali-labile Läsionen und Strangbrüche im Zusammenhang mit unvollständiger DNA-Exzisionsreparatur zu erkennen. DNA-Schäden können jedoch auch durch mechanischescheren oder unsachgemäße Probenverarbeitungsverfahren entstehen, was die Ergebnisse des Tests verwirrt. Die Reproduzierbarkeit bei der Entnahme und Verarbeitung von Gewebeproben während der Nekropsien kann aufgrund schwankender Labormitarbeiter mit unterschiedlicher Erfahrung bei der Ernte von Geweben für den Kometentest schwer zu kontrollieren sein. Die Verbesserung der Konsistenz durch Auffrischungsschulungen oder den Einsatz mobiler Einheiten, die mit erfahrenem Laborpersonal besetzt sind, ist kostspielig und möglicherweise nicht immer machbar. Um die konsistente Erzeugung hochwertiger Proben für die Kometen-Assay-Analyse zu optimieren, wurde eine Methode zur Homogenisierung von flashgefrorenen Gewebewürfeln mit einem kundenspezifischen Gewebeminziergerät evaluiert. Proben, die nach dieser Methode für den Kometentest hergestellt wurden, verglichen in der Qualität günstig in der Qualität mit frischen und gefrorenen Gewebeproben, die durch Hacken während der Nekropsie hergestellt wurden. Darüber hinaus wurden niedrige Basis-DNA-Schäden in Zellen aus gefrorenen Gewebewürfeln nach längerer Lagerung gemessen.
Einleitung
Der Kometentest wird zunehmend als Mittel zur Bewertung von DNA-Schäden in kultivierten Zellen und Geweben verwendet, die Chemikalien oder anderen Umweltstressoren ausgesetzt sind1. Der Test kann DNA-Doppel- und Einstrangbrüche, alkali-labile Läsionen und einsträngige Brüche im Zusammenhang mit unvollständiger DNA-Reparatur erkennen. Der International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (ICH) empfiehlt einen DNA-Strangbruchtest wie den Kometentest als zweiten Test zur Ergänzung des Nagetier-Erythrozyten-Mikrokern-Assays zur Beurteilung der In-vivo-Genotoxizität und als Folgetest zur Beurteilung ....
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Protokoll
Gewebe wurden während der Durchführung von Studien in AAALAC-akkreditierten Einrichtungen in NTP-Vertragslaboratorien gemäß den Vorschriften für gute Laborpraxis (21 CFR Part 58) und den von der Institutionellen Tierhaltung genehmigten Tierverwendungsprotokollen geerntet. Care and Use Committee (IACUC) in jedem Labor.
1. Gewebeernte und -verarbeitung
HINWEIS: Es ist sinnvoll, doppelte Probenröhrchen (z. B. Leber) zuzubereiten oder etwa die Hälfte einer Probe in ein anderes Speicherröhrchen (z. B. Zwölffingerdarm, Magen) zu übertragen, um bei Bedarf eine erneute Analyse zu ermöglichen. Um die potenz....
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Ergebnisse
Studie 1
Leber wurde aus zwei Kohorten von männlichen Sprague Dawley Ratten geerntet, die 4 Tage lang Maisöl verabreichten, gestaffelt um eine Woche. Die Dias wurden aus frisch gehacktem Gewebe, gefrorenem Hackfleisch und gefrorenem Würfelgewebe hergestellt, das in Merchants Medium oder Der Hacklösung mit dem Gewebezerkleinerungsgerät verarbeitet wurde. Gefrorenegewebe, die von Tieren aus der ersten Kohorte gewonnen wurden, wurden nach der Tiefkühllagerung für 3,5 Monate bewertet. Gefrorenegewebe, die.......
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Diskussion
Wie bereits gezeigt7,12,13, richtig behandelt Flash gefrorenes Hackfleisch liefert gute Ergebnisse in der Kometen-Assay. Tatsächlich liegen die in unserem Labor hergestellten Basiswerte für gefrorene gehackte Ratten- und Mausleber in der Regel bei 6 %, wie in der OECD-Testrichtlinie9 für frisch gehackte Leberproben von Ratten empfohlen. Gute Ergebnisse wurden von mehreren Laboratorien mit einer Vielzahl v.......
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Offenlegungen
Diese Arbeit wurde durch das Intramural Research Program des NIH, National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) im Auftrag HHSN273201300009C; Die darin enthaltenen Erklärungen, Stellungnahmen oder Schlussfolgerungen stellen jedoch nicht notwendigerweise die Aussagen, Meinungen oder Schlussfolgerungen von NIEHS, NIH oder der Regierung der Vereinigten Staaten dar.
Danksagungen
Die Autoren sind Lincoln Martin und Kelley Owens für die fachkundige technische Hilfe bei der Vorbereitung und Bewertung von Kometenrutschen und Dr. Carol Swartz für die Durchführung statistischer Analysen dankbar. Die Autoren würdigen auch die unterstützenden Beiträge von Mitgliedern der Programme Genetic Toxicology, Investigative Toxicology, and Necropsy an der ILS.
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Materialien
2
Agarose Lonza 50081 Na
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Kryofläschchen | Corning Costar | 430488 | |
| Zahnwachsblätter | Elektronenmikroskopie Sciences | 72670 | |
| Präparieren (Zerkleinern) Mikroschere | Fisher Scientific | 08-953-1B | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14175-079 | |
| KCl | Teknova | P0315-10 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Mikrofuge-Röhrchen mit niedrigem Schmelzpunkt (1,7 ml) | Corning | 3207 | |
| Na2EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| Neutral gepuffertes Formalin | Leica | 600 | |
| Skalpellklingen | Miltex | 4-110 | |
| Spritzenkolben (1 mL) | Fisher Scientific oder Vitality Medical | 14-826-88; 8881901014 | Becton Dickinson oder Monoject Tuberkulinspritze |
| Gewebezerkleinerungsgerät | NorGenoTech (Oslo, Norwegen) | Keine | Geringe Variabilität im Durchmesser beobachtet, die die Sudigkeit des Kolbens beeinträchtigen kann. |
| Pinzette, Kunststoff | Passatwinde Direkt | DF8088N | Verstärktes Nylon, unsteril, stumpfe Spitze, autoklavierbar; tradewindsdirect.com |
| Waage | Krackler Scientific/Heathrow Scientific | 6290-14251B |
Referenzen
- van der Leede, B. J., et al. Performance and data interpretation of the in vivo comet assay in pharmaceutical industry: EFPIA survey results. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 775-776, 81-88 (2014).
- ICH.
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Nachdrucke und Genehmigungen
