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Methodenartikel

Hierarchische und programmierbare Ein-Topf-Oligosaccharid-Synthese

6.6K Aufrufe

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DOI:

10.3791/59987

⸱

6. September 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Genomics Research Center, Academia Sinica, 2Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, 3Department of Chemistry, Scripps Research Institute, 4Institute of Information Science, Academia Sinica

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll zeigt, wie die Auto-CHO-Software für die hierarchische und programmierbare Ein-Topf-Synthese von Oligosacchariden verwendet wird. Es beschreibt auch das allgemeine Verfahren für RRV-Bestimmungsexperimente und Ein-Topf-Glykosylierung von SSEA-4.

Zusammenfassung

Dieser Artikel stellt ein allgemeines experimentelles Protokoll für die programmierbare Ein-Topf-Oligosaccharid-Synthese vor und zeigt, wie Auto-CHO-Software zur Generierung potenzieller synthetischer Lösungen verwendet wird. Der programmierbare Ein-Topf-Oligosaccharid-Syntheseansatz wurde entwickelt, um die schnelle Oligosaccharidsynthese großer Mengen mit Thioglykosid-Bausteinen (BBLs) mit der entsprechenden sequenziellen Reihenfolge der relativen Reaktivitätswerte (RRVs) zu ermöglichen. Auto-CHO ist eine plattformübergreifende Software mit einer grafischen Benutzeroberfläche, die mögliche synthetische Lösungen für die programmierbare Ein-Topf-Oligosaccharid-Synthese bietet, indem sie eine BBL-Bibliothek (mit ca. 150 validierten und >50.000 virtuellen BBLs) mit genau vorhergesagte RRVs durch Unterstützung der Vektorregression. Der Algorithmus für die hierarchische Ein-Topf-Synthese wurde in Auto-CHO implementiert und verwendet Fragmente, die von One-Pot-Reaktionen generiert werden, als neue BBLs. Darüber hinaus ermöglicht Auto-CHO Benutzern, Feedback für virtuelle BBLs zu geben, um wertvolle für die weitere Verwendung zu behalten. Die One-Pot-Synthese des stufenspezifischen embryonalen Antigens 4 (SSEA-4), einem pluripotenten menschlichen embryonalen Stammzellmarker, wird in dieser Arbeit nachgewiesen.

Einleitung

Kohlenhydrate sind in der Natur allgegenwärtig1,2, aber ihre Anwesenheit und Wirkungsweise bleiben ein neu erforschtes Gebiet, vor allem aufgrund des schwierigen Zugangs zu dieser Klasse von Molekülen3. Im Gegensatz zur automatisierten Synthese von Oligopeptiden und Oligonukleotiden bleibt die Entwicklung der automatisierten Synthese von Oligosacchariden eine gewaltige Aufgabe, und der Fortschritt ist relativ langsam.

Um dieses Problem anzugehen, entwickelten Wong et al. die erste automatisierte Methode zur Synthese von Oligosacchariden mit einem programmierbaren Softwareprogramm namens Optimer4, das die Auswahl von BBLs aus einer Bibliothek von 50 BBLs für sequenzielle Ein-Topf-Werte leitet. Reaktionen. Jede BBL wurde mit einer genau definierten Reaktivität entworfen und synthetisiert, die von verschiedenen Schutzgruppen abgestimmt wurde. Mit diesem Ansatz können die Komplexitäten des Schutzes von Manipulation und Zwischenreinigung während der Synthese minimiert werden, die als die schwierigsten Probleme bei der Entwicklung der automatisierten Synthese zu überwinden sind. Trotz dieses Fortschritts ist die Methode immer noch recht eingeschränkt, da die Anzahl der BBLs zu klein ist und das Optimer-Programm nur bestimmte kleine Oligosaccharide verarbeiten kann. Für komplexere Oligosaccharide, die mehr BBLs und mehrere Durchgänge von Ein-Topf-Reaktionen und Fragmentkondensation erfordern, wurde eine aktualisierte Version des Softwareprogramms Auto-CHO5entwickelt.

In Auto-CHO wurden mehr als 50.000 BBLs mit definierter Reaktivität zur BBL-Bibliothek hinzugefügt, darunter 154 synthetische und 50.000 virtuelle. Diese BBLs wurden durch maschinelles Lernen auf der Grundlage grundlegender Eigenschaften, berechneter NMR-Chemieschichten6,7und molekularer Deskriptoren8entwickelt, die die Struktur und Reaktivität der BBLs beeinflussen. Mit diesem aktualisierten Programm und neuen BBLs zur Verfügung, wird die Synthesekapazität erweitert, und wie gezeigt, können mehrere Oligosaccharide von Interesse schnell vorbereitet werden. Es wird angenommen, dass diese neue Entwicklung die Synthese von Oligosacchariden für die Untersuchung ihrer Rolle in verschiedenen biologischen Prozessen und ihre Auswirkungen auf die Strukturen und Funktionen von Glykoproteinen und Glycolipiden erleichtern wird. Es wird auch angenommen, dass diese Arbeit der Glykowissenschaftlichen Gemeinschaft erheblich zugute kommen wird, da diese Methode der Forschungsgemeinschaft kostenlos zur Verfügung steht. Die Synthese des essentiellen menschlichen embryonalen Stammzellmarkers SSEA-45wird in dieser Arbeit demonstriert.

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Protokoll

1. Auto-CHO-Software-Manipulation

  1. Installation der Java Runtime-Umgebung: Stellen Sie sicher, dass die Java Runtime Environment (JRE) im Gerät installiert ist. Wenn JRE installiert wurde, fahren Sie mit dem nächsten Schritt "Softwareinitialisierung" fort. Andernfalls laden Sie JRE gemäß dem Betriebssystem des Benutzers herunter und installieren Sie es unter: .
  2. Software-Initialisierung: Gehen Sie auf die Auto-CHO-Website unter und laden Sie die Software entsprechend dem Betriebssystem herunter. Derzeit unterstützt Auto-CHO Windows, macOS und Ubuntu. Das neueste PDF-Benutzerhandbuch finden Sie auf der Auto-CHO-Website.
    1. Entpacken Sie für Windows-Benutzer die Automatische-CHO_Windows.zip und doppelklicken Sie im Ordner Auto-CHO_Windows auf Auto-CHO.jar, um das Programm zu starten.
      HINWEIS: Der Benutzer muss Entpacksoftware installieren, z. B. 7-Zip, die unter zum Entpacken der ZIP-Datei zu finden ist. Der Benutzer kann auch den Befehl java -jar Auto-CHO.jar verwenden, um das Programm über die Windows-Eingabeaufforderung zu starten.
    2. Für macOS-Benutzer klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Auto-CHO.jar und wählen Sie Öffnen, um das Programm zu starten.
    3. Für Ubuntu-Benutzer:
      1. Installieren Sie libcanberra-gtk mit dem folgenden Befehl:
        sudo apt-get install libcanberra-gtk*
      2. Ändern der Zugriffsberechtigung von Auto-CHO_Ubuntu.sh:
        chmod 755 Auto-CHO_Ubuntu.sh
      3. Führen Sie das Auto-CHO-Programm aus:
        ./Auto-CHO_Ubuntu.sh
  3. Geben Sie die gewünschte Glykanstruktur ein. Wählen Sie aus, ob Sie eine Glykanstruktur zeichnen oder eine vorhandene Strukturdatei lesen möchten.
    1. Eingabe durch Zeichnung:
      1. Klicken Sie auf Glycan bearbeiten von GlycanBuilder 9,10 (Abbildung 1, btn1; Abbildung 2A) oder den Bereich von Klicken Sie hier, um das synthetische Ziel zu bearbeiten, um die Abfragestruktur durch GlycanBuilder zu zeichnen und zu bearbeiten. Verknüpfungs- und Chiralitätsinformationen sollten nicht ignoriert werden. Klicken Sie auf die Schaltflächen Globo-H, SSEA-4oder OligoLacNAc (Abbildung 1, Beispiele), um die Beispiele anzuzeigen.
      2. Datei auswählen | Export in Sequenzformate | Exportieren Sie nach GlycoCT kondensiert, um die bearbeitete Struktur zu speichern (optional).
      3. Schließen Sie das GlycanBuilder-Dialogfeld, um die Bearbeitung abzuschließen.
    2. Eingabe durch Lesen einer Datei:
      1. Klicken Sie auf Glycan bearbeiten von GlycanBuilder (Abbildung 1, btn1; Abbildung 2A) oder den Bereich von Klicken Sie hier, um das synthetische Ziel zu bearbeiten, um die Abfragestruktur zu bearbeiten.
      2. Datei auswählen | Importieren Sie aus Sequenzformaten, um die Abfragestrukturdatei mit dem entsprechenden Format auszuwählen.
  4. Suchparametereinstellungen (optional).
    1. Definieren Sie die Suchparameter auf der Registerkarte "Parametereinstellungen" (Abbildung 1, Tab2), um vernünftige Suchergebnisse zu erhalten.
      notiz:
      Der Schwellenwert für High-Class RRV muss eine reelle Zahl und 0 .
      Der Schwellenwert der Mittelklasse RRV muss eine reelle Zahl und 0 .
      Schwellenwert für High-Class RRV sollte >Schwellenwert der mittleren Klasse RRVsein.
      Die maximale Fragmentzahl sollte eine ganze Zahl und eine Nummer 1 sein.
      Min BBL-Nummer in einem Fragment muss eine ganze Zahl und zwischen 1 und 3 sein.
      Max. BBL-Nummer in einem Fragment muss eine ganze Zahl und zwischen 1 und 3 sein.
      Die max. BBL-Nummer in einem Fragment muss dieBBL-Nummer min in einem Fragmentsein.
      Min Spender/Akzeptor RRV Differenz muss eine positive reelle Zahl sein.
      Min Spender/Akzeptor RRV Ratio muss eine positive reelle Zahl sein.
      Max Spender/Akzeptor RRV-Verhältnis muss eine positive reelle Zahl sein.
      Das maximale RRV-Verhältnis von Spendern/Akzeptormuss >Min Donor/Acceptor RRV Ratiosein.
    2. Klicken Sie auf die Schaltfläche OK, um die neuen Einstellungen zu aktivieren.
  5. Wählen Sie die Bausteinbibliothek aus (Abbildung 1, Tab5). Die Standardeinstellung ist, nur die experimentelle Bibliothek zu durchsuchen. Wenn es gewünscht ist, sowohl die experimentelle als auch die virtuelle Bibliothek zu durchsuchen, überprüfen Sie die folgenden Schritte.
    1. Wählen Sie die Registerkarte Virtuelle Bausteinbibliothek aus (Abbildung 2C, Tab5). Experimentelle und virtuelle Bausteine können zusammenarbeiten, um die Suchfähigkeit von Auto-CHO zu verbessern. Derzeit stellt Auto-CHO mehr als 50.000 virtuelle Bausteine mit vorhergesagten RRVs in der Bibliothek bereit.
    2. Wählen Sie Experimentelle und virtuelle Bibliotheken verwenden aus, und wenden Sie Filter ungegnet an, um virtuelle Bausteine mit bestimmten Kriterien anzuzeigen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausgewählte virtuelle BBL(s anzeigen) (Abbildung 2C, btn5), um nur die ausgewählten virtuellen Bausteinen anzuzeigen.
    3. Klicken Sie auf die Schaltfläche Gefilterte virtuelle BBL(s anzeigen) (Abbildung 2C, btn6), um nur virtuelle Bausteine mit bestimmten vom Benutzer definierten Kriterien anzuzeigen.
    4. Klicken Sie auf die Schaltfläche Alle virtuellen BBL(s anzeigen) (Abbildung 2C, btn7), um alle verfügbaren virtuellen Bausteine anzuzeigen und den Filter zurückzusetzen.
    5. Überprüfen Sie einen oder mehrere gewünschte virtuelle Bausteine, die der Benutzer für die Suche verwenden möchte.
  6. Wählen Sie die Registerkarte Abfragestruktur (Abbildung 1, Tab1) und klicken Sie auf die Schaltfläche Bausteinbibliothek suchen (Abbildung 1, btn2), um die synthetischen One-Pot-Lösungen für die Abfragestruktur zu finden. Bestätigen Sie dann die Parametereinstellungen.
  7. Suchen Sie den Ergebnisbetrachter.
    HINWEIS: Das Suchergebnis wird auf der Registerkarte Ergebnisvisualisierung angezeigt (Abbildung 1, Tab6). Die reduzierenden Endaktoren unterschiedlicher Rückstandszahlen werden in der Spalte Reduzieren des Endakzeptors angezeigt (Abbildung 1, Viewer1).
    1. Wählen Sie einen Reduktions-End-Akzeptor aus, und Lösungen werden in der Liste der synthetischen Lösungslösungen angezeigt (Abbildung 1, Viewer2). Fragmente werden in der Fragmentliste (Abbildung 1, Viewer3) angezeigt, um vorzuschlagen, wie viele Fragmente in der Synthese verwendet werden sollen.
      ANMERKUNG: Das System liefert detaillierte Informationen zu jedem Fragment, einschließlich des RRV des Fragments, der Rechenausbeute sowie der Schutzgruppe, die für die spätere Verwendung des Fragments in der Ein-Topf-Reaktion degeschützt werden sollte. Die Bausteine, die zum Zusammenbau des ausgewählten Fragments verwendet werden, sind im Viewer4 von Abbildung 1dargestellt. Der Viewer5 von Abbildung 1 zeigt auch die Fragmentverbindungsinformationen an.
    2. Anzeigen und Überprüfen chemischer Strukturen und detaillierte Informationen zu den ausgewählten Bausteinen in den Bereichen Chemische Struktur des Bausteins bzw. Bausteinbrowserfür experimentelle Bausteine(Abbildung 1, tab4).
  8. Geben Sie das Suchergebnis in Text aus (optional).
    1. Wählen Sie die Registerkarte Ergebnistext aus (Abbildung 1, Tab7).
    2. Klicken Sie auf Ergebnistext speichern (Abbildung 2B, btn4) und wählen Sie das Textdateiziel aus.
  9. Feedback für virtuelle Bausteine (optional).
    HINWEIS: Feedback zu virtuellen Bausteinen kann über den Online-Fragebogen gegeben werden. Feedback kann der Community helfen, nützliche virtuelle Bausteine zu behalten und ineffektive zu entfernen.
    1. Wählen Sie die Registerkarte Virtueller Baustein aus (Abbildung 1, Tab5).
    2. Klicken Sie auf den Link "Zur Bewertung" des virtuellen Bausteins, von dem es in der Spalte Feedback bewertet oder kommentiert werden soll.
    3. Füllen Sie das Feedback-Formular aus, nachdem das System eine Webseite geöffnet hat, und senden Sie es ab.
      HINWEIS: Ändern Sie die virtuelle BBL-ID nicht.

2. RRV-Bestimmungsexperimente

  1. Kombinieren Sie in einem 10 ml Rundbodenkolben die beiden Thioglykosidspender (jeweils 0,02 mmol: Dr4 ist der Referenzspender mit bekanntem RRV; Dx1 ist das Spendermolekül unbekannter RRV), absolutem Methanol (0,10 mmol) und Driedrit in Dichlormethan (DCM, 1,0 ml), dann bei Raumtemperatur (RT) 1 h rühren.
  2. Nehmen Sie ein Aliquot dieses Gemischs (30 l) und injizieren Sie das Gemisch in die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) in drei separate Injektionen (10 l für jede Injektion). Messen Sie den Koeffizienten (a) zwischen der Absorption (A) und der Konzentration des Spendermoleküls [D] unter den Basistrennbedingungen (Etheracetat/ n-Hexan = 20/80).
  3. Fügen Sie dem Reaktionsgemisch eine Lösung von 0,5 M N-Iodosuccinimid (NIS) in Acetonitril (40 l, 0,02 mmol) hinzu, gefolgt von der Zugabe einer 0,1 M Trifluormetschmethansulfonsäure (TfOH) (20 l, 0,002 mmol), und rühren Sie das Gemisch bei RT für 2 h.
  4. Das Reaktionsgemisch mit DCM (4,0 ml) verdünnen, filtern und mit gesättigtem wässrigem Natriumthiosulfat waschen, das 10 % Natriumhydrogencarbonat (2x mit je 5 ml Volumen) enthält. Extrahieren Sie die wässrige Schicht mit DCM (3x mit 5 ml). Kombinieren Sie alle organischen Schichten, waschen Sie sie mit 5 ml Sole und trocknen Sie sie mit ca. 200 mg wasserfreiem Magnesiumsulfat.
  5. Schütteln Sie die Mischung leicht für 30 s, filtern Sie es durch einen Trichter mit einem geriffelten Filterpapier, um das Magnesiumsulfat zu entfernen, und sammeln Sie dann das Filtrat in einem 25 ml Rundbodenkolben. Entfernen Sie das Lösungsmittel mit einem Rotationsverdampfer.
  6. Lösen Sie den Rückstand in DCM (1,0 ml). Nehmen Sie ein Aliquot dieses Gemischs (30 l) und injizieren Sie es in HPLC in drei separate Injektionen (10 l für jede Injektion). Messen Sie die Konzentrationen der verbleibenden Spender ([Dx] und [Dref]) durch HPLC unter den gleichen Trennbedingungen (Etheracetat/n-Hexan = 20/80) (Aref)t = 24417.0, (Ax)t = 23546.3.
  7. Messen Sie die relative Reaktivität zwischen Dx1 vs. Dr4, kx1/kr4 = 0.0932. Basierend auf dem relativen Reaktivitätswert von Dr4beträgt der relative Reaktivitätswert von Dx1 3.
    ANMERKUNG: a = A/[D], (Aref)0 = 74530.1, (Ax)0 = 26143.0. k x/kref = (ln[Dx]t - ln[Dx]0)/(ln[Dref]t - ln[Dref]0) = (ln[A x]t - ln[Ax]0)/(ln[Aref]t - ln[Aref]0) = 0.0932.

3. Ein-Topf-Glykosylierung von SSEA-4

  1. Legen Sie einen 10 ml Rundbodenkolben unter Vakuum, trocknen Sie ihn, und lassen Sie den Kolben auf RT abkühlen, während er noch unter Vakuum ist. Entfernen Sie das Gummiseptum, um eine Mischung aus Disaccharid 1 Spender (38 mg, 1,1 eq., 0,057 mmol), dem ersten Akzeptor 2 (40 mg, 1,0 eq., 0,053 mmol) und einem Teflon-beschichteten magnetischen Rührstab in den Kolben hinzuzufügen.
  2. Übertragen Sie 100 mg pulverisierte Molekularsiebe 4 in einen 5 ml Rundbodenkolben. Halten Sie diesen Kolben unter Vakuum, flammtrocknen sie, und lassen Sie den Kolben zu RT abkühlen, während noch unter Vakuum. Übertragen Sie die frisch getrockneten 4-B-Molekularsiebe in den ersten Kolben, der das Ausgangsmaterial enthält.
  3. 1 ml frisch getrockneten DCM in den Kolben übertragen. Rühren Sie das Reaktionsgemisch 1 h bei RT und legen Sie es dann unter eine Temperatur von -40 °C. Das NIS (13 mg, 1,1 Äq., 0,057 mmol) in den Kolben geben.
  4. TfOH (34 l, 0,3 eq., 0,017 mmol, 0,5 m in Ether) mit einer Mikrovolumenspritze bei -40 °C durch das Septum in den Kolben einspritzen. Bei -40 °C 3 h rühren.
  5. Nachdem der erste Akzeptor 2 fast verbraucht ist, injizieren Sie die Lösung des Akzeptors 3 in DCM durch das Septum in den Kolben.
  6. Das Reaktionsgemisch auf -20 °C erwärmen und NIS (19 mg, 1,6 äq., 0,083 mmol) in den Kolben geben. TfOH (34 l, 0,3 eq., 0,017 mmol, 0,5 m in Ether) durch das Septum bei -20 °C in den Kolben einspritzen. Bei -20 °C 3 h rühren.
  7. Nachdem das Produkt der ersten Schrittreaktion verbraucht wurde, löschen Sie die Reaktion, indem Sie zwei Äquivalente von Triethylamin injizieren. Entfernen Sie die Molekularsiebe durch einen mit Celite verpackten Filtertrichter, sammeln Sie das Filtrat in einen 25 ml Rundbodenkolben und waschen Sie den Filter mit 10 ml DCM weiter.
  8. Das Filtrat in einen Trenntrichter überführen und mit gesättigtem wässrigem Natriumthiosulfat mit 10% NaHCO3 (2x mit je 10 ml) waschen. Extrahieren Sie die wässrige Schicht mit DCM (3x mit 10 ml). Kombinieren Sie die organischen Schichten und waschen Sie die Mischung mit Salzlake (10 ml) und trocknen Sie sie durch Zugabe von wasserfreiem MgSO4. Filtern Sie es und sammeln Sie das Filtrat in einem 100 ml Rundbodenkolben.
  9. Entfernen Sie das Lösungsmittel mit einem Rotationsverdampfer. Lösen Sie die Rohmischung mit ca. 1 ml DCM auf und laden Sie sie auf das Kieselsäurebett. Das Produkt mit einer Mischung aus Ethylacetat und Toluin (EtOAc/Toluin, 1/4 bis 1/2) zu vereitten und die Fraktionen zu sammeln.
  10. Entfernen Sie das Lösungsmittel mit einem Rotationsverdampfer. Trocknen Sie den Rückstand unter reduziertem Druck, um vollständig geschützten SSEA-4-Derivat 4 (74 mg, 50% basierend auf Akzeptor 2) als weißen Schaum zu geben.

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Ergebnisse

Das Auto-CHO-Suchergebnis basierend auf den Standardparametereinstellungen gibt an, dass SSEA-4 durch eine [2 + 1 + 3] One-Pot-Reaktion synthetisiert werden kann. Abbildung 3 zeigt den Software-Screenshot des SSEA-4-Suchergebnisses. Wenn ein Trisaccharid-reduzierender Endakzeptor ausgewählt ist(Abbildung 3, Etikett 1), zeigt das Programm vier mögliche Lösungen für die Abfrage an. Die erste Lösung hat ein Fragment

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Diskussion

Die Auto-CHO-Software wurde entwickelt, um Chemikern dabei zu unterstützen, hierarchische und programmierbare Ein-Topf-Synthese von Oligosacchariden5zu betreiben. Auto-CHO wurde von der Programmiersprache Java erstellt. Es ist eine GUI-Software und Plattform, die derzeit Windows, macOS und Ubuntu unterstützt. Die Software kann kostenlos für die Auto-CHO-Website unter heruntergeladen werden, und der Quellcode mit MIT-Lizenz kann über den GitHub unter

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der Academia Sinica unterstützt, einschließlich des Summit-Programms, des Ministeriums für Wissenschaft und Technologie [MOST 104-0210-01-09-02, MOST 105-0210-01-13-01, MOST 106-0210-01-15-02] und NSF (1664283).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AcetonitrilSigma-Aldrich75-05-8
Wasserfreies MagnesiumsulfatSigma-Aldrich7487-88-9
CerammoniummolybdatTCIC1794
DichlormethanSigma-Aldrich75-09-2
DrieritSigma-Aldrich7778-18-9
EthylacetatSigma-Aldrich141-78-6
MethanolSigma-Aldrich67-56-1
Molekularsiebe 4 & Aring;Sigma-Aldrich
n-HexanSigma-Aldrich110-54-3
N-IodosuccinimidSigma-Aldrich516-12-1
NatriumbicarbonatSigma-Aldrich144-55-8
NatriumthiosulfatSigma-Aldrich10102-17-7
ToluolSigma-Aldrich108-88-3
TrifluormethansulfonsäureSigma-Aldrich1493-13-6

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

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