Verarbeitung von Embryo-, Eierschalen- und Pilzkultur für die Rasterelektronenmikroskopie

Zusammenfassung

Hier stellen wir detaillierte Verarbeitungsprotokolle für die Abbildung empfindlicher Gewebeproben mittels Rasterelektronenmikroskopie (SEM) vor. Drei verschiedene Verarbeitungsmethoden, nämlich Hexamethyl disilazana (HMDS) chemische Trocknung, einfache Lufttrocknung und kritische Punkttrocknung werden für die Herstellung von starren Eierschalen, Embryonen in frühen Entwicklungsstadien und Pilzkulturen beschrieben.

Zusammenfassung

Obwohl die Rasterelektronenmikroskopie (SEM) häufig für die ultrastrukturelle Analyse verschiedener biologischer und nichtbiologischer Proben eingesetzt wird, sind Methoden, die an der Verarbeitung verschiedener biologischer Proben beteiligt sind, mit einzigartigen Praktiken verbunden. Alle in der Literatur beschriebenen konventionellen Verfahren zur Verarbeitung von Proben finden immer noch nützliche Anwendungen, aber subtile Änderungen in der Probenvorbereitung können die Bildqualität verändern und Artefakte einführen. Daher ist die Verwendung einer einzigartigen Probenvorbereitungstechnik, die speziell auf die Art des analysierten Gewebes zugeschnitten ist, erforderlich, um ein qualitativ hochwertiges Bild mit ultrastruktureller Auflösung zu erhalten. Der Schwerpunkt dieser Studie liegt auf der Bereitstellung optimaler Probenvorbereitungsprotokolle für bildgebende Embryonen, starre Eierschalen und Pilzkulturen mit SEM. Die folgenden Optimierungen wurden empfohlen, um gute Ergebnisse für die drei verschiedenen untersuchten empfindlichen biologischen Proben zu erzielen. Die Verwendung von milderen Fixativen wie 4% Paraformaldehyd oder 3% Glutaraldehyd gefolgt von Dehydrierung mit Ethanol-Serie ist obligatorisch. Pilzmyzel auf Agarblöcken, die durch Gleitkulturen gewonnen werden, ergibt eine bessere ultrastrukturelle Integrität im Vergleich zu Kulturen, die direkt aus Agarplatten stammen. Die chemische Trocknung von Embryonen mit HMDS sorgt für das Trocknen ohne Oberflächenspannung im Vergleich zur kritischen Punkttrocknung. HMDS verhindert Risse durch Schrumpfung, da Proben beim Trocknen weniger spröde sind. Für die Pilzkultur bietet die kritische Punkttrocknung jedoch eine akzeptable Bildqualität im Vergleich zur chemischen Trocknung. Eierschalen können ohne spezielle Vorbereitungsschritte mit Ausnahme einer gründlichen Waschung und Lufttrocknung vor der Montage abgebildet werden. Die Vorbereitungsmethoden wurden auf der Grundlage einer akzeptablen Bildqualität standardisiert, die bei jeder Studie ermittelt wurde.

Einleitung

Rasterelektronenmikroskop (SEM) Ultrastrukturanalyse und intrazelluläre Bildgebung ergänzen die Lichtmikroskopie zur dreidimensionalen Profilierung von Prokaryoten, Pflanzen und Tieren. Die hohe räumliche Auflösung eines SEM macht es zu einer der vielseitigsten und leistungsstärksten Techniken, die für die Untersuchung mikrostruktureller Eigenschaften von Proben im Nanometer-Mikrometer-Skala zur Verfügung stehen. Ausgetrocknete Exemplare werden zu kompositorischen und topographischen Strukturen mit intensiven Details aufgelöst, was die Grundlage für die Entwicklung gültiger Schlussfolgerungen über funktionelle Beziehungen^1,

Protokoll

HINWEIS: Bemalte Schildkröten -Chrysemys picta) Eier, die in dieser Studie verwendet wurden, wurden während der Brutzeit von Mai bis Juni 2015-16 von der Rice Creek Field Station, Oswego New York mit Genehmigung des New York State Department of Environmental gesammelt Konservierung (DEC).

1. Chemische Trocknungsmethode zur Verarbeitung von Embryonen für SEM

1. Sammeln Sie Schildkröteneier von Feldstandorten während der Brutzeit. Bereiten Sie die Inkubationskammern im Voraus vor, aus Kunststoffboxen mit Deckeln (L x B x H) 6,7 cm x 25,4 cm x 10,2 cm gefüllt mit Einstreumedium, das mit einer feuchten Mischung aus Vermiculit un....

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt die rasterelektronenmikrografische Analyse von gemalten Schildkrötenembryonen (Chrysemys picta). Bemalte Schildkröteneier, die auf einem Einstreumedium gesammelt und inkubiert wurden, die nach der chemischen Trocknung auf Aluminiumstummeln montiert waren, wurden für die SEM-Bildgebung verwendet (Abbildung 1A-E). Eine seitliche Ansicht eines Embryos der Stufe 12 zeigt die craniofacial Strukturen; die Oberkieferprominen.......

Diskussion

In unserer Studie wurden verschiedene Fixierungsmittel, Dehydrierungs- und Trocknungsmethoden getestet, um drei verschiedene empfindliche biologische Proben für die SEM-Bildgebung vorzubereiten: Embryonen, Eierschalen und Pilzkulturen. SEM wird häufig für die Oberflächenanalyse verwendet, so dass die fixative Penetration weniger besorgniserregend ist, aber es muss verstanden werden, dass schlecht fixierte interne Strukturen nach innen schrumpfende oder/und kollabierte Oberflächenstrukturen verursachen. Erweiterte Fixieru.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Agar	Fischer Scientific	S25127A	für Objektträgerkulturen
Aluminium-Stiftstummel	Tedpella	16111	12,7 mm x 8 mm
BD Difco Dehydrierte Nährmedien: Kartoffel-Dextrose-Agar	BD 213400	DF0013-17-6	Medien zur Isolierung und Kultivierung von Pilzen, Hefen und Schimmelpilzen
Chloramphenicol	Fischer BioReagents	BP904-100	Antibiotikum für Medien
Grobes	Vermiculit-Gewächshaus Megastore	SO-VER-12	Einstreumedium
Klare 12-Well-Platte	Corning	07-201-589	zum Fixieren
von Embryonen Deckgläser	Fischer Scientific	S17525B	für Objektträgerkultur
Kritischer Punkttrockner	Quorum CPD	EMS850	Trocknung von kritischen Punkten
Kulturschalen	Fischer Scientific	08 747B	SCHALE PETRI 100X10MM 12/PK
Ethanol	Fischer Scientific	A406P 4	Dehydrationsmittel
Pinzette - Aquarius Pinzette	Tedpella	5804	Style 4, Länge 108mm, Breite x Dicke 0,017 x 0,17 mm
Glutaraldehyd	Fischer Scientific	G151-1	Fixiermittel
Goldtarget für Sputter-Coater	DENTON VACUUM	TAR001-0158	Goldziel, 2,375″ D x .002″
Hexamethyldisilazana	Fischer Scientific	C19479-5000	chemisches Trocknungsmittel
Kim Tücher	Kimtech	S-8115	Reinigung
Objektträger	Thermo Scientific	67-762-16	für Objektträgerkultur
Mikroskopieschere	Tedpella	1327	Doppelspitz, Edelstahl, 100 mm L (3-5/8").
Mikroschere	Tedpella	1346	Vannas-Typ, gerade, 80mm L
Moria Perforierter Embryo	Löffel Fine Science Tools	10370-17	Länge 14,5 cm, Spitzendurchmesser 20 mm, Löffeltiefe 5 mm
Netwell Einsätze	Corning	0330B09	15 mm Einsätze mit 74 & Mikro; m Maschenweite Polyestermembranen dienen als praktische Träger bei der Verarbeitung von Proben in verschiedene Lösungsmittel
Paraformaldehyd	Fischer Scientific	T353 500	Fixiermittel
Torfmoos	Walmart- Miracle Gro	551705263	Einstreumedium
PELCO Tabs Double Stick Carbon Leitfähiges Klebeband	Tedpella	5000	12 mm OD
Sputter Coater	DENTON	VACUUM DESK V	dünne Metallbeschichtung
SEM	JEOL USA	JEOL JSM 6610LV Rasterelektronenmikroskopie