Hier stellen wir ein mechanisches Dissoziationsprotokoll vor, um Makrophagen aus dem dorsalen Wurzelganglien für Phänotypisierung und funktionelle Analyse schnell zu isolieren.
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Methodenartikel
Schnelle Isolierung von Dorsalwurzel Ganglion Makrophagen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Es gibt wachsendes Interesse, die molekularen und zellulären Wechselwirkungen zwischen Immunzellen und sensorischen Neuronen in den dorsalen Wurzelganglien nach peripheren Nervenverletzungen zu untersuchen. Periphere monozytäre Zellen, einschließlich Makrophagen, sind dafür bekannt, auf eine Gewebeverletzung durch Phagozytose, Antigen-Präsentation und Zytokinfreisetzung zu reagieren. Neue Beweise haben den Beitrag von dorsalen Wurzelganglien Makrophagen zur neuropathische Schmerzentwicklung und axonale Reparatur im Zusammenhang mit Nervenverletzungen impliziert. Schnell phänotypisieren (oder "schnelle Isolierung von") die Reaktion von dorsalen Wurzelganglien Makrophagen im Zusammenhang mit Nervenverletzungen ist gewünscht, um die unbekannten Neuroimmunfaktoren zu identifizieren. Hier zeigen wir, wie unser Labor Makrophagen aus den dorsalen Wurzelganglien mithilfe eines enzymfreien mechanischen Dissoziationsprotokolls schnell und effektiv isoliert. Die Proben werden durchweg auf Eis gehalten, um den zellulären Stress zu begrenzen. Dieses Protokoll ist im Vergleich zum standardenzymatischen Protokoll weit weniger zeitaufwändig und wurde routinemäßig für unsere fluorescence-aktivierte Zellsortierungsanalyse verwendet.
Einleitung
Es gibt inzwischen erhebliche Hinweise darauf, dass Immunzellen zu den neuropathischen Schmerzen nach der peripheren Nervenverletzung1,2beitragen. Periphere monozytäre Zellen, einschließlich reifer Makrophagen, sind dafür bekannt, auf Gewebeverletzungen und systemische Infektionen durch Phagozytose, Antigen-Präsentation und Zytokinfreisetzung zu reagieren. Parallel zur nervenverletzungsinduzierten Mikroglia-Aktivierung im Spinaldorsalhorn dehnen sich Makrophagen in den Dorsalwurzelganglien (DRG) auch nach einer Nervenverletzung deutlich aus3,4. Insbeso....
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Protokoll
Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of California San Francisco genehmigt und in Übereinstimmung mit dem NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals durchgeführt.
1. Sammeln Lenden wirbeln DRG von experimentellen Mäusen
- Bevor Sie mit dem Experiment beginnen, bereiten Sie die Arbeitslösung des Dichtegradientenmediums (z.B. Percoll) vor, indem Sie 9 Volumen des Mediums mit 1 Volumen ca++/Mg++ -frei10x HBSS mischen. Halten Sie es auf Eis.
- Anästhesisieren Sie die Maus mit 2,5% Avertin. Bestätigen Sie, dass das Tier durch die fehlende Reaktion ....
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Ergebnisse
Um die isolierten Zellen zu validieren, wählten wir zuerst die Macrophage Fas-Induced Apoptosis (MAFIA) transgene Mäuse17. Diese Linie drückt ein medikamentös induzierbares FK506-bindendes Protein (FKBP)-Fas Selbstmordfusionsgen und grünes fluoreszierendes Protein (eGFP) unter der Kontrolle des Promotors des CSF1-Rezeptors (CSF1R) aus, der sich sowohl in Makrophagen als auch in Mikroglia spezifisch äußert. Die systemische Injektion des FK-bindenden Proteindimeris, AP20187 (AP), induziert die Apopt.......
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Diskussion
Hier stellen wir eine neue Methode vor, um isolierte Makrophagen aus Maus-DRG effektiv anzureichern. Der konventionelle Ansatz, DRG-Immunzellen zu isolieren, erfordert eine enzymatische Verdauung15,18, die nun durch mechanische Homogenisierung in unserem Protokoll ersetzt wird, um unerwünschte Zellschäden zu begrenzen und die Ausbeute zu erhöhen. Daher ist das neue Protokoll weit weniger zeitaufwändig. Noch wichtiger ist, dass die Enzymverdauung die Makrophagen s.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen im Zusammenhang mit diesem Manuskript.
Danksagungen
Die Studie wurde unterstützt von: Foundation for Anesthesia Education and Research (XY); die UCSF-Abteilung für Anästhesie und Perioperative Versorgung (XY); und 1R01NS100801-01(GZ). Diese Studie wurde teilweise von der HDFCCC Laboratory for Cell Analysis Shared Resources Facility durch ein Stipendium des NIH (P30CA082103) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| AP20187 | Clontech | 635058 | |
| α-Maus CX3CR1-APC Antikörper | Biolegend | 149007 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Zellsieb (70 mm Nylon) | Falcon | 352350 | |
| Zentrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Dounce Gewebehomogenisator | Wheaton | 357538 ( 1ml) | |
| FACS Röhrchen (5ml) | Falcon | 352052 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | FST | 16121-14 | |
| HBSS (10x, Ca++/Mg++-frei) | Gibco | 14185-052 | |
| Noyes Federschere | FST | 15012-12 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500ml | |
| Propidiumiodid | Sigma | Nr. 4864-10ml |
Referenzen
- Ji, R. R., Chamessian, A., Zhang, Y. Q. Pain regulation by non-neuronal cells and inflammation. Science. 354 (6312), 572-577 (2016).
- Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature....
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Nachdrucke und Genehmigungen
