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Methodenartikel

Hybrid Microdrive System mit wiederherstellbarer Opto-Silikon-Sonde und Tetrode für Dual-Site High Density Recording in frei beweglichen Mäusen

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DOI:

10.3791/60028

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10. August 2019

 ,  , 
1Department of Psychiatry, University of Texas Southwestern Medical Center, 2Department of Neuroscience, University of Texas Southwestern Medical Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Konstruktion eines Hybrid-Mikroantriebs-Arrays, das die Implantation von neun unabhängig einstellbaren Tetroden und einer einstellbaren Opto-Silizium-Sonde in zwei Hirnregionen in frei beweglichen Mäusen ermöglicht. Ebenfalls demonstriert ist eine Methode zur sicheren Wiederherstellung und Wiederverwendung der Opto-Silizium-Sonde für mehrere Zwecke.

Zusammenfassung

Multiregionale neuronale Aufnahmen können wichtige Informationen liefern, um Interaktionen zwischen mehreren Hirnregionen zu verstehen. Herkömmliche Microdrive-Designs erlauben jedoch oft nur die Verwendung einer Elektrode, um aus einzelnen oder mehreren Regionen aufzunehmen, wodurch die Ausbeute von Einzel- oder Tiefenprofilaufzeichnungen begrenzt wird. Es schränkt auch oft die Fähigkeit ein, Elektrodenaufnahmen mit optogenetischen Werkzeugen zu kombinieren, um Wege und/oder zelltypspezifische Aktivität zu zielen. Hier wird ein Hybrid-Mikrodrive-Array für frei bewegliche Mäuse zur Optimierung der Ausbeute und eine Beschreibung ihrer Herstellung und Wiederverwendung des Microdrive-Arrays vorgestellt. Das aktuelle Design verwendet neun Tetrodes und eine Opto-Silizium-Sonde, die in zwei verschiedenen Gehirnbereichen gleichzeitig in frei bewegliche Mäuse implantiert werden. Die Tetroden und die Opto-Silizium-Sonde sind unabhängig entlang der dorsoventralen Achse im Gehirn einstellbar, um die Ausbeute von Einheiten- und Oszillatoraktivitäten zu maximieren. Dieses Microdrive-Array enthält auch eine Einrichtung für Licht, die optogenetische Manipulation vermittelt, um die regional- oder zelltypspezifischen Reaktionen und Funktionen von langräumigen neuronalen Schaltkreisen zu untersuchen. Darüber hinaus kann die Opto-Silizium-Sonde nach jedem Experiment sicher zurückgewonnen und wiederverwendet werden. Da das Microdrive-Array aus 3D-gedruckten Teilen besteht, kann das Design von Microdrives einfach an verschiedene Einstellungen angepasst werden. Zuerst wird das Design des Microdrive-Arrays beschrieben und wie die optische Faser an eine Siliziumsonde für Optogenetik-Experimente befestigt wird, gefolgt von der Herstellung des Tetro-Bündels und der Implantation des Arrays in ein Maushirn. Die Erfassung lokaler Feldpotentiale und Unit Spiking in Kombination mit optogenetischer Stimulation zeigen auch die Machbarkeit des Microdrive-Array-Systems bei frei beweglichen Mäusen.

Einleitung

Es ist wichtig zu verstehen, wie neuronale Aktivität kognitive Prozesse unterstützt, wie Lernen und Gedächtnis, indem sie untersuchen, wie verschiedene Gehirnregionen dynamisch miteinander interagieren. Um die Dynamik der neuronalen Aktivität, die kognitiven Aufgaben zugrunde liegt, zu klären, wurde eine groß angelegte extrazelluläre Elektrophysiologie bei frei beweglichen Tieren mit Hilfe von Microdrive-Arrays1,2,3, 4. In den letzten zwei Jahrzehnten wurden verschiedene Arten von Mikroantriebs-Arrays entwickelt,um Elektroden in mehrere Hirnregionen für Ratten 5,6,7,8 und Mäuse9zu implantieren. 10 , 11 , 12. Dennoch erlauben aktuelle Microdrive-Designs in der Regel nicht die Verwendung mehrerer Sondentypen, was die Forscher zwingt, einen einzelnen Elektrodentyp mit spezifischen Vorteilen und Einschränkungen zu wählen. Z. B. funktionieren Tetrode-Arrays gut für dicht besiedelte Hirnregionen wie den dorsalen Hippocampus CA11,13, während Siliziumsonden ein besseres geometrisches Profil für die Untersuchung anatomischer Verbindungen bieten14 , 15.

Tetrodes und Siliziumsonden werden häufig für die in vivo chronische Aufzeichnung verwendet, und jede hat ihre eigenen Vor- und Nachteile. Tetrodes haben nachweislich erhebliche Vorteile in einer besseren Einzeleinheitsisolierung als Einzelelektroden16,17, zusätzlich zu Wirtschaftlichkeit und mechanischer Steifigkeit. Sie bieten auch höhere Erträge von Einzeleinheiten-Aktivitäten in Kombination mit Mikroantrieben8,18,19,20. Es ist wichtig, die Anzahl der gleichzeitig aufgezeichneten Neuronen für das Verständnis der Funktion der neuronalen Schaltkreise zu erhöhen21. Beispielsweise wird eine große Anzahl von Zellen benötigt, um kleine Populationen funktionell heterogener Zelltypen zu untersuchen, wie z. B. zeitbezogene22 oder Belohnungscodierung23 Zellen. Viel höhere Zellzahlen sind erforderlich, um die Dekodierungsqualität von Spike-Sequenzen13,24,25zu verbessern.

Tetrodes haben jedoch einen Nachteil bei der Aufzeichnung räumlich verteilter Zellen, z. B. im Kortex oder Thalamus. Im Gegensatz zu Tetroden können Siliziumsonden räumliche Verteilung und Interaktion von lokalen Feldpotentialen (LFPs) und Spiking-Aktivitäten innerhalb einer lokalen Struktur14,26ermöglichen. Mehrschaftige Siliziumsonden erhöhen die Anzahl der Aufnahmestellen weiter und ermöglichen die Aufzeichnung über einzelne oder benachbarte Strukturen27. Solche Arrays sind jedoch weniger flexibel in der Positionierung von Elektrodenstellen im Vergleich zu Tetroden. Darüber hinaus sind komplexe Spike-Sortieralgorithmen in Sonden mit hoher Dichte erforderlich, um Informationen über Aktionspotenziale benachbarter Kanäle zu extrahieren, um die von tetrodes28,29,30erfassten Daten zu spiegeln. Daher ist die Gesamtausbeute einzelner Einheiten oft geringer als tetrodes. Darüber hinaus sind Siliziumsonden aufgrund ihrer Fragilität und hohen Kosten nachteilig. Die Wahl von Tetroden vs. Siliziumsonden hängt also vom Ziel der Aufzeichnung ab, bei der es darum geht, ob die Erzielung einer hohen Ausbeute an Einzeleinheiten oder räumlicheprofilierung an den Aufnahmestellen priorisiert wird.

Neben der Aufzeichnung neuronaler Aktivität ist die optogenetische Manipulation zu einem der leistungsstärkeren Werkzeuge in der Neurowissenschaft geworden, um zu untersuchen, wie bestimmte Zelltypen und/oder -wege zu den neuronalen Schaltkreisfunktionen beitragen13,31, 32,33. Optogenetische Experimente erfordern jedoch zusätzliche Berücksichtigung im Mikroantriebs-Array-Design, um den Faserstecker an Stimulationslichtquellen34,35,36zu befestigen. Oft erfordert die Verbindung von Fiberoptik eine relativ große Kraft, was zu einer mechanischen Verschiebung der Sonde im Gehirn führen kann. Daher ist es keine triviale Aufgabe, eine implantierbare Glasfaser mit herkömmlichen Microdrive-Arrays zu kombinieren.

Aus den oben genannten Gründen sind die Forscher verpflichtet, die Auswahl der Art der Elektrode zu optimieren oder eine optische Faser je nach Ziel der Aufzeichnung zu implantieren. Zum Beispiel werden Tetroden verwendet, um eine höhere Einheitsausbeute im Hippocampus1,13zu erreichen, während Siliziumsonden verwendet werden, um das laminare Tiefenprofil von kortikalen Bereichen zu untersuchen, wie z. B. dem medialen entorhinalen Kortex (MEC)37. Derzeit wurden Mikroantriebe zur gleichzeitigen Implantation von Tetroden und Siliziumsonden für Ratten5,11berichtet. Aufgrund des Gewichts der Mikroantriebe, des begrenzten Platzes auf dem Mauskopf und der räumlichen Anforderungen für die Konstruktion des Mikroantriebs für den Einsatz verschiedener Sonden ist es jedoch äußerst schwierig, mehrere Tetrodes und Siliziumsonden in Mäuse zu implantieren. Obwohl es möglich ist, Siliziumsonden ohne Mikroantrieb zu implantieren, erlaubt dieses Verfahren keine Einstellung der Sonde und senkt die Erfolgsrate der Silizium-Sonde-Rückgewinnung12,38. Darüber hinaus erfordern optogenetische Experimente zusätzliche Überlegungen im Microdrive-Array-Design. Dieses Protokoll zeigt, wie man ein Mikroantriebs-Array für die chronische Aufzeichnung in frei beweglichen Mäusen konstruiert und implantt, das die Implantation von neun unabhängig einstellbaren Tetroden und einer einstellbaren Opto-Silizium-Sonde ermöglicht. Dieses Microdrive-Array erleichtert auch optogenetische Experimente und die Wiederherstellung der Siliziumsonde.

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Protokoll

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des University of Texas Southwestern Medical Center genehmigt.

1. Vorbereitung von Microdrive-Array-Teilen

  1. Drucken Sie die Microdrive-Arrayteile mit einem 3D-Drucker mit Zahnmodellharz (Abbildung 1A,B). Stellen Sie sicher, dass die Dicke der einzelnen 3D-gedruckten Schichten weniger als 50 m beträgt, um die kleinen Löcher auf den bedruckten Teilen klar und lebensfähig zu halten.
    HINWEIS: Das Microdrive-Array besteht aus fünf Teilen (Abbildung1C): (1) der Hauptkörper des Microdrive-Arrays, das neun Mikroantriebsschrauben für Tetrodes und eine Schraube für eine Siliziumsonde enthält (Abbildung 1Ca-d). Die Koordination des Tetrodenbündels und des Lochs für die Opto-Silizium-Sonde unten hängt von den Koordinaten des Zielhirnbereichs ab (Abbildung 1Cd); (2) ein Shuttle zur Befestigung einer Siliziumsonde oder Optrode (Abbildung 1Ce); (3) eine elektrische Sondenanschlusshalterung für den Silizium-Sondenanschluss (Abbildung 1Cf); (4) ein Faserferrule-Halter, der an den mittleren Teil des Körpers klemmt, um unerwünschte Bewegungen der implantierten Opto-Silizium-Sonde beim Stecken/Trennen eines optischen Fasersteckers zu verhindern (Abbildung 1Cg); und (5) ein Abschirmkegel, der dem Microdrive-Array physische und elektrische Abschirmung für eine stabile Aufzeichnung bietet (Abbildung 1Ch). Das Gesamtgewicht des Microdrive-Arrays beträgt 5,9 g, einschließlich des Abschirmkegels (Tabelle 1). Wenn Löcher in den bedruckten Teilen verstopft sind, bohren Sie die Löcher mit Bohrern aus: #76 für die innenlöcher und #68 für die äußeren Löcher für Tetrode-Mikroantriebsschrauben, #71 für tetrode Microdrive-Schrauben-Unterstützerloch und #77 für die Löcher für die Führungspfosten an der Unterseite der Körper.
  2. Einfügen von Führungspfosten in den Microdrive-Array-Körper.
    1. Schneiden Sie zwei 16 mm Längen von 26-Ga Edelstahldraht. Schärfen Sie die Drahtspitzen vorsichtig mit einem Drehschleifer.
    2. Setzen Sie die Drähte in die unteren Löcher des Körpers ein (Abbildung 2A). Tragen Sie eine kleine Menge Cyanoacrylatkleber an der Unterseite des Körpers auf, um die Führungspfosten zu sichern.

2. Opto-Silizium-Sondenvorbereitung

  1. Bereiten Sie die Microdrive-Schraube für eine Siliziumsonde vor.
    HINWEIS: Die Mikroantriebsschraube für die Siliziumsonde besteht aus einer benutzerdefinierten Schraube (300 m Steigung), die ein Stützrohr unterstützt, und einem L-förmigen Rohr (Abbildung 2B).
    1. Bereiten Sie die Form für den Mikroantriebskopf vor (Abbildung 2C). Um die Form zu konstruieren, bereiten Sie das 3D-gedruckte Kunststoffmuster des Mikroantriebs vor (Abbildung 2Ca). Dann gießen Sie flüssiges Silikon-Gel nach der Herstellung einer zeitlichen Wand, indem Sie Bänder um das Muster. Entfernen Sie Luftblasen durch sanftes Schütteln, warten Sie, bis sie ausgehärtet ist, und entfernen Sie dann die Silikon-Gel-Form aus dem Muster (Abbildung 2Cb).
    2. Schneiden Sie 18 mm und 9,5 mm Längen von 23 G Edelstahldraht mit einem Drehschleifer. Rauen Sie die oberen 2–3 mm der Drähte mit einem Drehschleifer, um die Haftung des Zahnacryls zu verbessern.
    3. Nehmen Sie eine benutzerdefinierte Schraube und wenden Sie eine kleine Menge Siliziumöl, um die Reibung mit dem Dental-Acryl zu reduzieren. Stellen Sie die Drähte und eine kundenspezifische Schraube auf die Form.
    4. Gießen Sie Dental-Acryl in die Form mit einer Spritze, um Luftblasen um die Drähte und die Schrauben zu beseitigen. Luftblasenkontamination macht den Microdrive zerbrechlich. Warten Sie, bis das Zahnacryl vollständig ausgehärtet ist, und nehmen Sie dann die Mikroantriebsschrauben aus der Form. Biegen Sie 6 mm der längeren Drahtspitze mit einer Zange in einen 60°-Winkel.
    5. Überprüfen Sie die Qualität der Mikroantriebsschrauben (z. B. Risse, Luftblasen und Reibung), um die Schraube zu drehen. Bei hoher Reibung drehen Sie die Schraube, bis sie mit einem elektrischen Schraubendreher mit einer kundenspezifischen Treiberspitze, die sich mit der Microdrive-Schraube koppelt, glatt werden.
    6. Installieren Sie die Microdrive-Schraube in den Microdrive-Array-Körper, um zu überprüfen, ob sie sich durch Drehen der Schraube sanft nach oben und unten bewegt. Gewinde für die Schraube werden automatisch erstellt, wenn die Schraube in die Bohrung des Körpers eingesetzt wird.
  2. Bereiten Sie den Shuttle vor (Abbildung 3Aa).
    1. Schneiden Sie zwei 5 mm Längen von Polyetheretherketon (PEEK) Schläuchen mit einer scharfen Schere. Richten Sie die Rohre auf beiden Seiten des Shuttles aus. Kleben Sie die Rohre und Shuttle mit Epoxid.
    2. Tragen Sie eine kleine Menge Siliziumöl auf die Leitpfosten auf. Überprüfen Sie die Qualität des Shuttles, indem Sie auf die Leitpfosten des Microdrive-Array-Körpers einstecken. Stellen Sie sicher, dass sich der Shuttle reibungslos ohne übermäßige Reibung bewegt.
  3. Vorbereiten einer Optorode (Abbildung 3Ab). Dieser Schritt kann übersprungen werden, wenn kein optogenetisches Experiment erforderlich ist.
    1. Mit einem Rubinschneider lassen Sie die Glasfaser auf 21 mm Länge. Schleifen Sie die Faserspitze, um die Spitze flach und glänzend zu machen.
    2. Legen Sie die Glasfaser vorsichtig auf die Vorderseite der Siliziumsonde. Die Faserspitze befindet sich 200–300 m über der Oberseite der Elektrodenstellen. Halten Sie die Faser vorübergehend mit transparentem Klebeband.
    3. Kleben Sie die optische Faser mit einer geringen Menge Epoxid an die Basis der Siliziumsonde. Warten Sie mindestens 5 h, bis das Epoxid vollständig ausgehärtet ist.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, die Glasfaser auf der gleichen Seite wie die Elektrodenstellen zu befestigen. Das Anbringen der Faser an der Rückseite kann verhindern, dass Licht die Aufnahmestellen richtig beleuchtet.
  4. Befestigen Sie den Shuttle an der Siliziumsonde (Abbildung 3Ac): Tragen Sie eine kleine Menge Epoxid auf der Rückseite der Basis der Siliziumsonde auf. Befestigen Sie den unteren Teil des Shuttles an der Basis der Siliziumsonde und halten Sie sich vorsichtig für 2–3 min in Position, um die Bildung eines Spalts zwischen Shuttle- und Siliziumsondenbasis während der Erstaushärtung des Epoxids zu vermeiden. Warten Sie mindestens 5 h, bis das Epoxid vollständig ausgehärtet ist.
  5. Setzen Sie die Shuttle-Röhren vorsichtig auf die Führungspfosten des Hauptkörpers unter dem Mikroskop (Abbildung 3B). Halten Sie dabei die Nut des Shuttles mit feiner Pinzette.
  6. Stecken Sie die Microdrive-Schraube in das Schraubloch, indem Sie die Schraube drehen. Betätigen Sie die Siliziumsonde und die Mikroantriebsschraube, indem Sie die Spitze des L-förmigen Drahtes in die Nut des Pendelkopfes einsetzen (Abbildung 3C).
  7. Befestigen Sie den elektrischen Anschlusshalter der Sonde am Microdrive-Array-Körper (Abbildung 3D).
    1. Schneiden Sie zwei #0 Schrauben auf 3,5 mm Gewindelänge. Schleifen Sie die Spitzen, um Grate zu entfernen.
    2. Legen Sie den Sondenanschlusshalter auf den Körper. Legen Sie den elektrischen Silizium-Sonden-Stecker in den Halter.
    3. Sichern Sie den Silizium-Sondenstecker im Halter mit Epoxid, und kleben Sie ihn nicht an den Microdrive-Array-Körper, um den Wiederherstellungsvorgang der Siliziumsonde zu ermöglichen. Setzen Sie die Schrauben ein, um den Sondenanschlusshalter zu halten.
  8. Befestigen Sie den Ferrule-Halter an der Opto-Silizium-Sonde und dem Microdrive-Array-Körper (Abbildung 3D).
    1. Schneiden Sie zwei #0 Schrauben auf 6 mm Gewindelänge. Schleifen Sie die Spitzen, um Grate zu entfernen.
    2. Schleifen Sie die Außenseite von zwei #0 Maschine Schraubenmuttern, um kleine Sechskantmuttern mit 2,5–3,0 mm Außendurchmesser zu machen, um das Gewicht und den Platz zu reduzieren.
    3. Setzen Sie die Schrauben in Komponente A des Halters ein. Kleben Sie die Schraubenköpfe mit Epoxid.
    4. Tragen Sie eine kleine Menge Siliziumfett auf Komponente A und B auf, um die Reibung mit dem Körper zu reduzieren. Fügen Sie Komponente A in den Körper ein, dann halten Sie sie zeitlich mit einer inversen Pinzette.
    5. Setzen Sie Komponente B auf die Schrauben von Komponente A. Die kundenspezifischen Muttern in die Schrauben einfädeln. Verwenden Sie zangen, um die Muttern zu straffen, um den Ferrule-Halter am Körper zu sichern.
    6. Setzen Sie die Faserferrule in die Nut des Faserferrulehalters (Komponente B). Stellen Sie sicher, dass die Faserferrule 4–5 mm vom Halter herausklebt.
    7. Tragen Sie eine kleine Menge Epoxid zwischen der Ferrule und der Halternut auf. Warten Sie, bis das Epoxid vollständig ausgehärtet ist, und überprüfen Sie, ob sich die Ferrule nicht bewegt. Überprüfen Sie den Shuttle- und Ferrule-Halter auf reibungslose Bewegung, indem Sie die Muttern vor dem Drehen der Microdrive-Schraube lösen.
    8. Überprüfen Sie den Arbeitsabstand der Sonde. Stellen Sie sicher, dass sich die Sondenspitze vollständig in den Körper zurückzieht, wenn sich der Ferrule-Halter an der obersten Position befindet, während die Shuttle-Rohre noch mit den Führungspfosten verbunden sind. Der maximale Arbeitsabstand wird durch die Länge der Silikonsonde und die Zielhirnregion bestimmt.
    9. Wenn die Microdrive-Schraube lose ist, tragen Sie eine kleine Menge zahnärztliches Acryl um die Schraube auf, um mehr Fäden für die Unterstützung hinzuzufügen. Wenn es ausgehärtet ist, drehen Sie die Schraube, um die Dichtheit und Stabilität zu überprüfen.

3. Tetrode Vorbereitung

HINWEIS: Dieses Verfahren ähnelt den zuvor veröffentlichten Artikeln8,19,20,39.

  1. Bereiten Sie die Microdrive-Schrauben für die Tetrode vor. Der Mikroantrieb für eine Tetrode besteht aus einer kundenspezifisch bearbeiteten Schraube und einem 23 G Schlauch (Abbildung 2B). Dieses Verfahren ähnelt Abschnitt 2.1.
  2. Machen Sie ein Bündel von 30 G Edelstahlrohre, die einen 5,5 mil Draht innen hat. In diesem Fall wurden insgesamt neun 30 G-Schläuche (acht Aufnahme-Tetroden und eine Referenzelektrode) verwendet.
  3. Verfädeln Sie das 30 G-Bündel von der Unterseite des Antriebskörpers und sichern Sie es mit 20 G dünnwandigen Schläuchen am Hauptkörper. Schneiden Sie den Boden des Bündels mit einem Drehschleifer, um die Spitze gleichmäßig und bündig zu machen. Oberen Teil der 30 G Rohre mit einem Drehschleifer beschneiden, so dass das 30 G Rohr etwa 0,5 mm vom Hauptkörper entfernt ist.
  4. 5,5-Mil-Polyimid-Isolierrohre in die 30 G Rohre eintragen. Bereiten Sie Tetrode-Drähte vor und laden Sie sie in eine 32-Kanal-Stromschnittstellenplatine (EIB). Überprüfen Sie den elektrischen Anschluss mit dem Impedanzprüfer vor dem abschließenden Präzisionsschnitt.
  5. Niedrigere Elektrodenspitzenimpedanz bis 250–350 k' mit Vergoldungslösung. Fix alle Tetrodes mit Superkleber.
  6. Füllen Sie übermäßigen Spalt zwischen Polyimidrohr und Tetrode mit Mineralöl zum Abdichten und Schmieren. Den Erddraht an die EIB weiterleiten.
    HINWEIS: Bei Bedarf kann die Glasfaser entlang derTetroden12 integriert werden.

4. Anbringen des Abschirmkegels

  1. Lackieren Sie silberne leitfähige Abschirmfarbe auf der Innenseite des bedruckten Kegels. Platzieren Sie das Microdrive-Array innerhalb des Kegels (Abbildung 3E).
  2. Schneiden Sie zwei #0 Schrauben auf 3,5 mm Gewindelänge. Befestigen Sie die Schrauben von der Außenseite des Kegels, um das Microdrive-Array an Ort und Stelle zu halten.
  3. Tragen Sie silberne Farbe um den Schraubenkopf auf, um den Abschirmkegel elektrisch mit elektrischem Boden zu verbinden. Überprüfen Sie die elektrische Verbindung zwischen Erddraht und Kegel. Tragen Sie eine kleine Menge Epoxid zwischen dem Microdrive-Array-Körper und dem Abschirmkegel auf, um den Körper sicher zu befestigen.
    HINWEIS: Eine weitere Möglichkeit, den Abschirmkegel vorzubereiten, ist die Verwendung von Aluminiumband40 (Abbildung 3F). Bereiten Sie zunächst das Musterpapier für den Abschirmkegel vor, nachdem Sie Aluminiumfolie auf das Papier geklebt haben (Abbildung 3Fa). Dann rollen Sie das Papier und befestigen Sie es mit einer kleinen Menge Cyanoacrylatkleber (Abbildung3Fb). Das Gewicht dieses Kegels beträgt 0,72 g und das Gesamtgewicht des Microdrive-Arrays wird auf 4,7 g reduziert (Tabelle 1).

5. Implantatchirurgie

HINWEIS: Dieses Verfahren wird von den zuvor veröffentlichten Artikeln18,39,41 für die Implantation an zwei Stellen geändert. Stellen Sie sicher, dass das Gewicht des Tieres über 25 g für das Mikroantriebsimplantat für eine schnellere Genesung nach der Operation ist.

  1. vorbereitung
    1. Um eine Masseschraube vorzubereiten, befestigen Sie den Silberdraht an einer Schädelschraube und tragen Sie Silberfarbe auf. Befestigen Sie dann einen goldenen Stift mit silberfarbener Farbe an der gegenüberliegenden Seite des Drahtes.
    2. Bereiten Sie den Laufwerkhalteadapter vor, um das Microdrive-Array an einem stereotaktischen Gerät zu halten. Befestigen Sie einen männlichen Connecter mit Epoxid an einem Rostgriff. Stellen Sie sicher, dass die Ausrichtung des Verbindungs- und Edelstahlgriffs gerade ist.
    3. Für den Fall, dass nach der Aufnahme eine histologische Bestätigung erforderlich ist, wenden Sie Di-I auf die Tetrodes oder die Rückseite der Siliziumsonde38an.
    4. Senken Sie die Siliziumsonde nach unten, um die gewünschte Tiefe zu erhalten. Lösen Sie die Muttern des Ferrule-Halters mit einer Zange, senken Sie die Siliziumsonde (Opto-Silizium-Sonde), indem Sie die Mikroantriebsschraube der Siliziumsonde drehen, und befestigen Sie dann die Muttern, um den Ferrule-Halter zu sichern. Bei der Implantation von Tetroden im Hippocampusbereich CA1 und einer Siliziumsonde in MEC beträgt der Abstand zwischen der Tetrode-Kanüle und der Spitze der Siliziumsonde 3–4 mm.
  2. Stellen Sie die anästhesierte Maus (0,8 % –1,5 % Isofluran) in einem stereotaxic-Gerät ein. Der anästhetische Zustand der Maus wird durch das Fehlen des Zehen-Pinch-Reflexes bestätigt. Tragen Sie eine klare Salbe auf die Augen auf, um ein Trocknen zu verhindern. Bedecken Sie die Augen mit einem Stück Folie, um vor starker chirurgischer Lichteinwirkung zu schützen.
  3. Desinfizieren Sie die Kopfhaut der Maus mit Jod und Isopropanol nach der Rasur des Fells. Machen Sie einen 1,5–2,0 cm Schnitt an der Kopfhaut mit einer Standard-Chirurgischen Schere, und entfernen Sie das Gewebe über dem Schädel mit Wattestäbchen nach subkutaner Anwendung von Lidocain.
  4. Richten Sie den Mauskopf mit dem stereotaxic Werkzeug aus. Stellen Sie sicher, dass der Höhenunterschied zwischen Bregma und Lambda kleiner als 100 m ist. Bestimmen Sie die Kraniotomie-Position mit einem Atlas und markieren Sie diese Standorte mit einem sterilisierten Bleistift.
  5. Verankern Sie die Schädelschrauben (0,8 mm Durchmesser, 0,200 mm Gewindeabstand), indem Sie sie mit 0,5 mm Bohrer mit 0,5 mm Bohrer auf den Schädel drehen.
    HINWEIS: 2–4 Löcher im frontalen Schädel, 2–3 Löcher in jeder Seite des Parietalschädels und 1–2 Löcher im interparietalen Schädel werden vorgeschlagen.
  6. Befestigen Sie die Bodenschraube an der Bohrung, indem Sie sie eine Drehung (0,2 mm) drehen, nachdem Sie ein Loch in den interparietalen Knochen gebohrt haben. Stellen Sie sicher, dass dieses Loch nicht durch den Knochen in das Gehirn Fall eindringen; Andernfalls verunreinigen Kleinhirnsignale die Aufnahme. Stellen Sie mit einem Impedanzmesser vor, dass die Impedanz zwischen der Masseschraube und den Schädelschrauben weniger als 20 k' bei 1 kHz beträgt.
    HINWEIS: Größere Impedanz führt zur Einführung von Bewegungsartefakten während der Aufnahme.
  7. Führen Sie die Kraniotomie an den markierten Stellen durch. Die Dura kann bei Mäusen intakt gelassen werden.
  8. Schließen Sie den Stecker der Masseschraube und den Massestecker des Microdrive-Arrays an. Überprüfen Sie die Konnektivität mit dem Impedanzmesser, indem Sie zwischen der Masseschraube und der Abschirmung messen.
  9. Stellen Sie das Microdrive-Array auf den Adapter ein, stellen Sie es auf das stereotaxic-Gerät ein, und senken Sie die Siliziumsonde langsam bis zur gewünschten Tiefe. Stellen Sie sicher, dass die Tetrode-Bündel über der Gehirnoberfläche platziert werden, aber immer noch innerhalb des Microdrive-Arrays, wenn die Siliziumsonde in das Gehirn eingeführt wird (Abbildung 4A).
  10. Tragen Sie das Siliziumfett vorsichtig auf, um den Bereich der Siliziumsonde und des Tetrodenbündels zu versiegeln (Abbildung 4B). Legen Sie eine kleine Menge des Siliziumfetts an die Spitze einer 20 G Nadel und tragen Sie das Fett mit der Nadel um die Sonden auf. Wiederholen Sie dies, bis Siliziumfett den Bereich um die Sonde vollständig bedeckt, so dass Zahnacryl nicht auf oder unter die Elektroden/Sonden fließt. Achten Sie darauf, dass das Fett die Elektrodenstellen nicht berührt, sonst erhöht es die Impedanz der Aufnahmestellen dramatisch.
  11. Tragen Sie Zahnacryl auf, um das Microdrive-Array an den Verankerungsschrauben im Schädel zu fixieren.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, Zahnacryl in drei Schichten aufzutragen, um die übermäßige Hitze zu vermeiden, die während der Aushärtung des Acryls entsteht.
  12. Entfernen Sie den Adapter vorsichtig aus dem Microdrive-Array. 1 ml PBS subkutan injizieren, um Austrocknung zu verhindern. Injizieren Sie 5 mg/kg Meloxicam subkutan als schmerzlindernde Behandlung.
  13. Bedecken Sie den Silizium-Sonden-Stecker mit einem Stück Klebeband, um zu verhindern, dass Schmutz in die elektrischen Anschlüsse gelangt. Bedecken Sie das Microdrive-Array mit einer Kunststoff-Paraffinfolie und kleben Sie es an Ort und Stelle.
  14. Verabreichen Sie eine geeignete schmerzstillende Behandlung für 3 Tage (z. B. subkutane Injektionen von 2 mg/kg Meloxicam einmal pro Tag). Erlauben Sie 3–5 Tage für die Wiederherstellung, bevor Sie mit der Tetrode-Anpassung beginnen. Die implantierte Maus nach der Erholungsphase ist in Abbildung 4Cdargestellt.

6. Wiederherstellung der Siliziumsonde (Abbildung 4D)

  1. Injektion von Ketamin (75 mg/kg) und Dexmedetomidin (1 mg/kg) Anästhetika intraperitoneal und bestätigtes Fehlen des Zehen-Pinch-Reflexes. Befestigen Sie die anästhesierte Maus, indem Sie 4% Paraformaldehyd direkt mit einer Kapuze durch das Herz durchdringen. Chirurgische Methoden für Nagetiere werden zuvor beschrieben42.
  2. Lösen Sie die Muttern des Ferrule-Halters mit einer Zange. Bewegen Sie es dann vorsichtig an die Oberseite des Körpers, indem Sie die Einstellschraube drehen, um die Siliziumsonde vollständig in Richtung innerhalb des Microdrive-Arraykörpers zurückzuziehen. Befestigen Sie die Muttern, um die Sonde an der oberen Position zu halten.
  3. Nehmen Sie das Maushirn von unten heraus, indem Sie den Schädel von der Seite knacken. Das Microdrive-Array ist nun vom Tier getrennt.
  4. Entfernen Sie die L-förmige Mikroantriebsschraube, die die Siliziumsonde antreibt, vollständig. Lösen und nehmen Sie die Nüsse des Ferrule-Halters mit einer Zange heraus. Nehmen Sie die Komponente A des Ferrule-Halters heraus.
  5. Lösen Sie die Sondensteckerhalterung und lösen Sie sie vom Laufwerksgehäuse. Überprüfen Sie, ob die Sondensteckerhalterung vom Microdrive-Array-Körper ausausgelöst werden kann.
  6. Halten Sie den oberen Teil des Shuttles mit einer Pinzette und schieben Sie die Silizium-Sonden-Baugruppe vorsichtig aus dem Microdrive-Array.
  7. Reinigen Sie die Sondenspitze mit Kontaktlinsenreiniger (erst mit Enzym, dann 3% Wasserstoffperoxid) für mindestens 1 Tag. Wischen Sie die Elektrodenspitze vorsichtig mit Isopropanol-Pads unter dem Mikroskop ab. Bewahren Sie die Sonde in einer statisch freien Aufbewahrungsbox auf.
    HINWEIS: Die Shuttle- und Sondensteckerhalterung bleibt an der Siliziumsonde befestigt und kann bei der nächsten Implantation wiederverwendet werden.
    HINWEIS: Einige Siliziumsonden sind mit Wasserstoffperoxid nicht tolerierbar. Verwenden Sie in diesem Fall nur die Kontaktlinsenlösung, die proteolytisches Enzym enthält.
  8. Um den Microdrive-Array-Körper für die nächste Operation wiederzuverwenden, entfernen Sie das Zahnacryl mit einer Kombination aus Feinspitzenbohrern und Nippern. Dann erholen Sie die Schädelschrauben, indem Sie das entfernte Zahnacryl in Aceton eintauchen. Beachten Sie, dass das Aceton Kunststoffteile des Microdrive-Arrays auflöst.
  9. Entfernen Sie das Epoxid zwischen dem Microdrive-Körper und abschirmen Kegel mit einem Skalpell.
    HINWEIS: Für die nächste Operation müssen keine zusätzlichen Teile mehr gedruckt werden, wenn der Microdrive nicht defekt ist.

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Ergebnisse

Das Microdrive-Array wurde innerhalb von 5 Tagen erstellt. Der Zeitplan der Mikroantriebsvorbereitung ist in Tabelle 2beschrieben. Mit diesem Mikroantrieb wurden neun Tetroden und eine Siliziumsonde in das Hippocampus CA1 bzw. MEC der Maus implantiert [21 Wochen alt/29 g Körpergewicht männlich pOxr1-Cre (C57BL/6 Hintergrund)]. Diese transgene Maus drückt Cre in MEC-Schicht III Pyramidenneuronen aus. Die Maus wurde 10 Wochen vor dem Elektrodenimplantat mit 200 nL AAV5-DIO-ChR2-YFP (Titer: 7,7 x 1012<...

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Diskussion

Das Protokoll zeigt, wie ein hybrides Mikroantriebs-Array zu konstruieren und zu implantieren, das die Aufzeichnung neuronaler Aktivitäten aus zwei Gehirnbereichen mit unabhängigen einstellbaren Tetroden und einer Siliziumsonde in frei verhaltenden Mäusen ermöglicht. Es zeigt auch optogenetische Experimente und die Wiederherstellung der Siliziumsonde nach Experimenten. Während die verstellbare Siliziumsonde33 oder die Opto-Silizium-Sonde 36-Implantation zuvor bei Mäusen nachgewiesen wurde, hat die...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde teilweise von der Japan Society for the Promotion of Science Overseas Research Fellowships (HO), Endowed Scholar Program (TK), Human Frontier Science Program (TK), Brain Research Foundation (TK), Faculty Science and Technology Acquisition und Retention Program (TK), Brain & Behavior Research Foundation (TK) und von The Sumitomo Foundation Research Grant (JY), NARSAD Young Investigator Research Grant (JY). Wir danken W. Marks für wertvolle Kommentare und Anregungen bei der Erstellung des Manuskripts.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
#00-90 SchraubeJ.I. Morris#00-90-1/8EIB-Schrauben
#0-80 MutterKleinteileB00DGB7CT2Messingmutter zum Halten des Faserklemmenhalters
#0-80 SchraubeKleinteileB000FMZ57GMessingmaschinenschraube für Sondensteckerhalterung, Faserhülsenhalter und Abschirmkegel
22 Ga PolyetheretherketonrohreKleinteileSLPT-22-24zur Befestigung am Shuttle, 0,025 Zoll Innendurchmesser
23 Ga EdelstahlschlauchKleinteileHTX-23Rfür Tetrode
23 Ga EdelstahlKleinteileHTX-23R-24-10für L-Form/Stützdraht
26 Ga EdelstahlDraht KleinteileGWX-0200für Führungspfosten
30 Ga EdelstahlDraht KleinteileHTX-30Rfür Tetrode
3D-CAD-SoftwarepaketDassault Systè mesSolidWorks 2003
3D-DruckerFormLabForm2
5,5 mil Polyimid-IsolierrohreHPC Medical72113900001-012
AluminiumfolienbandTycoTyco Adhesives 617022 Aluminiumfolienbandfür die alternative Abschirmkegel
leitfähige PasteYSHIELDHSF54für Abschirmkegel
kundenspezifische Schrauben für Silizium-Sonde microdriveAMTUNM1.25-HalfMoonhalbmond Edelstahlschraube, 1,5 mm Durchmesser, 300 & micro; m Gewindesteigung
Sonderschrauben für tetrode microdriveAMTYamamoto_0000-160_9mmEdelstahl-Schlitzschraube, 0,5 mm Durchmesser, 160 & micro; m Gewindesteigung, Sonderanfertigung auf Bestellung für unser Design
DentalacrylStoelting51459
Dentalmodell HarzFormLabRS-F2-DMBE-02
Dremel RotationswerkzeugDremelModell 800ein
Schleifer BohrerFine Science Tool19007-05
elektrische SchnittstellenplatineNeuralynxEIB-36-Narrow
EpoxyDevconGLU-735.905 Minuten Epoxid-Augensalbe
DechraPuralube Ophthalmic Salbe, um das Austrocknen von Mäuseaugen während der Operation zu verhindern
FaserpolierblattThorlabsLFG5Pzum Polieren der optischen Faser
FeinpinzetteProtech International15-368zum Laden/Bergen der Silikonsonde
gold StifteNeuralynxEIB Pins Kleiner
ErdungsdrahtA-M Systems7815000,010 Zoll blanker Silberdraht
KopfbühnenvorverstärkerNeuralynxHS-36
ImpedanzmessgerätBAK ElektronikModell IMP-21 kHz Prüffrequenz
MineralölZONA36-105zur Schmierung von Schrauben und Drähten
LichtwellenleiterDoricMFC_200/260-0.22_50mm_ZF1.25(G)_FLT
AufzeichnungssystemNeuralynxDigital Lynx 4SX
RubinfaserritzerThorlabsS90Rzum Spalten der optischen Faser
SilikonfettFine Science Tool29051-45
SilikonsondeNeuronexusA1x32-Edge-5mm-20-177Abb. 3, 4A, 4B, 5
SilikonsondeNeuronexusA1x32-6mm-50-177Abb. 4C
Silikonsonde WaschlösungAlconAL10078844Kontaktlinsenreiniger
SilikonschmiererSmooth-On DragonSkin 10 FASTzur Vorbereitung von Mikroantriebsform
SilberfarbeGC electronic22-023Silberdruck II Beschichtung, verwendet für Erdungsdrähte
SchädelschraubeOtto Frei2647-10AC0,8 mm Durchmesser, 0,200 mm Gewindesteigung
Standard-OP-SchereROBOZRS-5880
stereotaktisches GerätKopfModell 942
SekundenkleberLoctiteLOC230992zum Auftragen auf Führungspfosten
chirurgische PinzetteROBOZRS-5135
Tetrode TwisterJun YamamotoTT-01
Tetroden-DrähteSandvikPX000004

Referenzen

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