Quantifizierung der Protein-Interaktionsnetzwerkdynamik mit Multiplex-Co-Immunopräzipitation

Summary

Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI) verwendet Durchflusszytometrie zum empfindlichen Nachweis von Unterschieden in der Häufigkeit gezielter Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen zwei Proben. QMI kann mit einer kleinen Menge an Biomaterial durchgeführt werden, erfordert keine gentechnisch veränderten Tags und kann für jedes zuvor definierte Protein-Interaktionsnetzwerk angepasst werden.

Abstract

Dynamische Protein-Protein-Wechselwirkungen steuern das zelluläre Verhalten, von der Beweglichkeit über die DNA-Replikation bis hin zur Signaltransduktion. Die Überwachung dynamischer Wechselwirkungen zwischen mehreren Proteinen in einem Protein-Interaktionsnetzwerk ist jedoch technisch schwierig. Hier stellen wir ein Protokoll für quantitative Multiplex-Immunpräzipitation (QMI) vor, das eine quantitative Bewertung von Faltenveränderungen in Protein-Wechselwirkungen auf der Grundlage relativer Fluoreszenzmessungen von Proteinen in Shared Complexes ermöglicht, die von Exposed Oberflächenepitope (PiSCES). In QMI werden Proteinkomplexe aus Zelllysaten auf Mikrosphären immunpräzipiert und dann mit einem markierten Antikörper für ein anderes Protein untersucht, um die Fülle von PiSCES zu quantifizieren. Immunpräzipitationsantikörper werden mit verschiedenen MagBead-Spektralregionen konjugiert, was es einem Durchflusszytometer ermöglicht, mehrere parallele Immunpräzipitationen zu unterscheiden und gleichzeitig die Menge der mit jedem zugeordneten Sondenantikörper zu quantifizieren. QMI erfordert keine genetische Kennzeichnung und kann mit minimalem Biomaterial im Vergleich zu anderen Immunpräzipitationsmethoden durchgeführt werden. QMI kann für jede definierte Gruppe von interagierenden Proteinen angepasst werden und wurde bisher verwendet, um Signalnetzwerke in T-Zellen und neuronalen Glutamatsynapsen zu charakterisieren. Die Ergebnisse haben zu einer neuen Hypothesengenerierung mit potenziellen diagnostischen und therapeutischen Anwendungen geführt. Dieses Protokoll enthält Anweisungen zur Durchführung von QMI, von der ersten Auswahl des Antikörper-Panels bis hin zum Ausführen von Assays und der Analyse von Daten. Die erste Montage eines QMI-Assays umfasst das Screening von Antikörpern zur Erzeugung eines Panels und empirisch die Bestimmung eines geeigneten Lysepuffers. Die anschließende Reagenzpräparation umfasst kovalente Kopplung von Immunpräzipitationsantikörpern an MagBeads und Biotinylatations-Sondenantikörpern, so dass sie durch ein streptavidinkonjugiertes Fluorophor gekennzeichnet werden können. Um den Test durchzuführen, wird Lysat über Nacht mit MagBeads gemischt, und dann werden Perlen geteilt und mit verschiedenen Sondenantikörpern und dann einem Fluorophor-Etikett und durch Durchflusszytometrie gelesen. Zwei statistische Tests werden durchgeführt, um PiSCES zu identifizieren, die sich zwischen den versuchslichen Bedingungen erheblich unterscheiden, und die Ergebnisse werden mithilfe von Heatmaps oder Knotenkantendiagrammen visualisiert.

Introduction

Dynamische Protein-Protein-Wechselwirkungen bilden die molekularen Signalkaskaden und motilen Strukturen, die die funktionelle Basis der meisten zellulären^Physiologie1 sind. Diese Prozesse werden oft als lineare Signalwege dargestellt, die zwischen stationären Zuständen auf der Grundlage einzelner Eingänge wechseln, aber experimentelle und modellierungsdaten zeigen deutlich, dass sie als integrierte Netzwerke funktionieren^{2,3, 4}. Im Falle von G-Proteinen haben verschiedene Rezeptoren oft die Fähigkeit, das gleiche G-Protein zu aktivieren, und ein einz....

Protocol

1. Assay-Design

1. Kandidaten-Antikörper-Vorbereitung
   1. Wählen Sie für jedes Protein von Interesse 3 bis 5 Antikörper zum Abschirmen aus. Verwenden Sie nach Möglichkeit monoklonale Antikörper, die verschiedene Epitope erkennen. Enthalten auch einen unspezifischen Kontrollantikörper.
   2. Um Tris zu entfernen, führen Sie den Pufferaustausch durch, indem Sie den Antikörper zu einem 30 kDa-Spinfilter hinzufügen, sich auf sein minimales Volumen drehen, 500 l Phosphat-gepufferte Salin (PBS) hinzufügen und 3-mal wiederholen. Um Trägerproteine zu entfernen, führen Sie die Antikörperreinigung gemäß dem Herstellerprotokoll durch (siehe Tabelle der Ma....

Results

Antikörper-Screening
Abbildung 2 B zeigt die Ergebnisse eines Bildschirms für das Protein Connexin36. Die meisten IP_probe-Kombinationen erzeugen kein Signal über IgG-Steuerungen. IP mit dem monoklonalen Antikörper 1E5 und Sonde mit entweder 1E5 oder dem polyklonalen Antikörper 6200 erzeugt eine Rechtsverschiebung in der Perlenverteilung im Vergleich zu IgG-Steuerungen. Hier wurden IP 1E5 und Sonde 6200poly ausgewählt, um die Verwendung desselben Antikörp.......

Discussion

Der QMI-Test erfordert erhebliche Investitionen in die Entwicklung von Antikörperplatten, Ausrüstungen und Reagenzien, aber sobald der Assay etabliert ist, kann man hochdimensionale Daten sammeln, die Protein-Interaktionsnetzwerke beobachten, während sie auf experimentell kontrollierte Reize. Technisch gesehen erfordert QMI eine sorgfältige Pipettierung und Verfolgung von Proben- und Antikörperbrunnenstandorten. Die sorgfältige Beschriftung der Assay-Platten ist nützlich, ebenso wie eine detaillierte Vorlage von Brunnenp.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-Well-Platten mit flachem Boden	Bio Rad	171025001
96-Well-PCR-Platten	VWR	82006-704
Bioplex 200 System mit HTF	Bio Rad	171000205	modifiziert, um teilweise gekühlt zu bleiben, siehe Abbildung S1 für Details
Bio-Plex Pro Waschstation	Bio Rad	30034376
BSA	Sigma
CML-Kügelchen	Invitrogen	C37481
EDTA	Sigma	E6758
EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin	Thermo Scientific	A39256
MagPlex Mikrosphären	Luminex	MC12xxx-01	xxx ist das 3-stellige
Melonengel-IgG-Spin-Aufreinigungskit	Thermo Scientific	45206	für die Antikörperaufreinigung
MES	Sigma	M3671
Mikrotiterplattenfilm, unsteril	USA Scientific	2920-0000
Phosphotase Inhibitor Cocktail #2	Sigma	P5726
Proteaseinhibitor Cocktail	Sigma	P8340
Sandwich Prep Kühlschrank	Norlake	SMP 36 15	für die kundenspezifische Kühlung von Bioplex 200
Natrium Fluorid	Sigma	201154
Natriumorthovanadat	Sigma	450243
Streptavidin-PE	BioLegend	405204
Sulfo NHS	Thermo Scientific	A39269
Tris	Fisher Scientific	BP152