Bewertung der Lymphozytenmigration in einem Ex-Vivo-Transmigrationssystem

Zusammenfassung

In diesem Protokoll werden Lymphozyten in die obere Kammer eines Transmigrationssystems gelegt, die durch eine poröse Membran von der unteren Kammer getrennt sind. Chemokin wird der unteren Kammer hinzugefügt, was eine aktive Migration entlang eines Chemokingradienten induziert. Nach 48 h werden Lymphozyten in beiden Kammern gezählt, um die Transmigration zu quantitieren.

Zusammenfassung

Hierbei präsentieren wir eine effiziente Methode, die mit grundlegenden Laborfertigkeiten und Materialien ausgeführt werden kann, um die lymphozyte chemokine Bewegung in einem Ex-vivo-Transmigrationssystem zu bewerten. Angeborene Lymphzellen der Gruppe 2 (ILC2) und CD4⁺ T-Helferzellen wurden aus Milz und Lunge von Hühnerei-Ovalbumin (OVA)-herausgeforderten BALB/c-Mäusen isoliert. Wir haben die Expression von CCR4 auf CD4⁺ T-Zellen und ILC2, vergleichsweise bestätigt. CCL17 und CCL22 sind die bekannten Liganden für CCR4; Daher haben wir mit dieser Ex-vivo-Transmigration-Methode die CCL17- und CCL22-induzierte Bewegung von CCR4⁺ Lymphozyten untersucht. Um Chemokin-Gradienten zu ermitteln, wurden CCL17 und CCL22 in die untere Kammer des Transmigration-Systems gelegt. Isolierte Lymphozyten wurden dann den oberen Kammern zugesetzt und über einen Zeitraum von 48 h wanderten die Lymphozyten aktiv durch 3 m Poren in Richtung Chemokin in der unteren Kammer. Dies ist ein wirksames System zur Bestimmung der Chemokinetik von Lymphozyten, imitiert aber verständlicherweise nicht die Komplexitäten, die in den in vivo Organmikroumgebungen zu finden sind. Dies ist eine Einschränkung der Methode, die durch die Zugabe von In-situ-Bildgebung des untersuchten Organs und Lymphozyten überwunden werden kann. Im Gegensatz dazu besteht der Vorteil dieser Methode darin, dass ein Einsteigertechniker viel kostengünstiger als Live-Bildgebung durchgeführt werden kann. Da therapeutische Verbindungen zur Verbesserung der Migration verfügbar werden, wie im Falle von Tumor infiltrierenden zytotoxischen Immunzellen, oder um die Migration zu hemmen, vielleicht im Falle von Autoimmunerkrankungen, bei denen die Immunpathologie von Beunruhigung ist, kann diese Methode als Screening-Tool. Im Allgemeinen ist die Methode wirksam, wenn das Chemokin von Interesse konsequent Chemokinetik auf einem statistisch höheren Niveau als die Medienkontrolle erzeugt. In solchen Fällen kann auch der Grad der Hemmung/Verbesserung durch eine bestimmte Verbindung bestimmt werden.

Einleitung

Diese ursprüngliche Transmigration-Methode wurde 1962 von Stephen Boyden im Journal of Experimental Medicine¹vorgestellt. Vieles von dem, was wir über Chemotaxis und Chemokinetik wissen, wäre ohne die Entwicklung der Boydenkammer nicht möglich. Vor der Entdeckung des ersten Chemokins im Jahr 1977 wurden Ex-vivo-Transmigrationssysteme verwendet, um mehr über Serumfaktoren zu erfahren, die zelluläre Bewegungen in Makrophagen festsetzen könnten, während die zelluläre Motilität in Neutrophilen verstärkt wird^1,2. Es wurde ein riesiger Wissensschatz in Bezug auf die Immunzellmigratio....

Protokoll

Alle hier beschriebenen Methoden wurden von den Institutional Animal Care and Use Committees am University of Nebraska Medical Center (UNMC) und der University of Utah überprüft und genehmigt.

1. Aufbau und Herstellung von Reagenzien

1. Bereiten Sie komplette RPMI (Roswell Park Memorial Institute) Medien vor.
   1. Fügen Sie 10 ml hitzeinaktiviertes fetales Rinderserum (FBS) zu 90 ml RPMI hinzu.
   2. 1 ml 100x Penicillin-Streptomycin-Glutamin zu 100 ml von 10% FBS RPMI hinzufügen.
2. Bereiten Sie ILC2-Erweiterungsmedien vor.
   1. Fügen Sie IL-2 und IL-33 (20 ng/ml....

Ergebnisse

CCR4-Expression auf CD4+ T-Zellen und ILC2.

Für den Erfolg des Ex-vivo-Transmigrationsexperiments ist es unerlässlich, zu bestimmen, ob die Lymphozyten auf CCL17 und CCL22 über CCR4 reagieren; Daher haben wir die CCR4-Expression sowohl auf CD4⁺ T-Zellen als auch auf ILC2 durch Durchflusszytometrie bestimmt. Obwohl bekannt ist, dass OVA-spezifische CD4⁺ Helfer-T-Zellen CCR4 exprimieren, ist weniger über die Expression von CCR4 auf ILC2 bekannt.

Diskussion

Hierbei stellen wir eine etablierte Methode zur Beurteilung der chemokininduzierten Migration von Lymphozyten in einem Ex-vivo-Transmigrationssystem vor. Es gibt mehrere kritische Schritte im Protokoll, von denen der erste die Überprüfung der Expression des richtigen Chemokinrezeptors auf die Immunzellen im Experiment ist. In unseren Händen haben wir uns für CCR4 entschieden, weil die Literatur die Bedeutung von CCR4 auf Th2-Helfer-T-Zellen bei allergischen Entzündungen hervorhebt. Ovalbumin-induzierte Entzündung wurde z.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,4% Trypan Blue	Sigma-Aldrich	15250061
1 mL Spritze	BD Bioscience	329424	U-100 Spritzen Micro-Fine 28 G 1/2" 1cc
100x Penicillin-Streptomycin, L-Glutamin	Gibco	10378-016	Verdünnen auf 1x in RPMI Medien
15 mL konische Röhrchen	Olympus Plastics	28-101	Polypropylen Röhrchen
3 μ m Transwell-Einsätze	Genesee Scientific	25-288	24-Well-Platte mit 12 Transwell-Einsätzen 3x
stabilisierendes Fixiermittel	BD Pharmigen	338036	Bereiten Sie 1x Lösung gemäß Herstellerprotokoll
vor 5 mL Polystyrol-Röhrchen	STEM Cell Technologies	38007
50 mL konische Röhrchen	Olympus Plastics	28-106	Polypropylen-Röhrchen
8-Kammer-Magnet mit leichter Trennung	STEM Cell Technologies	18103
ACK Lysing Buffer	Life Technologies Corporation	A1049201
Fortschrittliches Zellsieb, 40 & mu; m	Genesee Scientific	25-375	Nylon-Mesh, 40 μ m Siebe
Aluminiumhydroxid, Reagenzqualität	Sigma-Aldrich	239186-25G	20 mg/mL
Anti-Maus CCR4; APC-konjugiertes	Biolegend	131211	0,5 μ; g/test
Anti-Maus CD11b	BD Pharmigen	557396	0,5 μ g/Test
Anti-Maus CD11c; PE eFluor 610	Thermo-Fischer Scientific	61-0114-82	0,25 μ g/test
Anti-Maus CD16/32, Fc-Block	BD Pharmigen	553141	0,5 μ g/Test
Anti-Maus CD19; APC-eFluor 780 konjugiert	Thermo-Fischer Scientific	47-0193-82	0,5 μ g/Test
Anti-Maus CD3; PE Cy 7-konjugiertes	BD Pharmigen	552774	0,25 μ g/Test
Anti-Maus CD45; PE konjugiert	BD Pharmigen	56087	0,5 μ g/test
Anti-Maus ICOS (CD278)	BD Pharmigen	564070	0.5 μ g/Test
Anti-Maus NK1.1 (CD161); FITC-konjugiertes	BD Pharmigen	553164	0,25 μ g/Test
Anti-Maus ST2 (IL-33R); PerCP Cy5.5 konjugiertes	Biolegend	145311	0,5 μmu; g/test
Automatisierter Zellzähler	BIORAD	1450102
Automatisierter Dissoziator	MACS Miltenyi Biotec	130-093-235
Rinderserumalbumin, lyophilisiertes Pulver	Sigma-Aldrich	A2153-10G	0,5 % serumfrei RPMI
Zellzähler Clide	BIORAD	1450015
Hühnerei Eieralbumin, Grad V	Sigma-Aldrich	A5503-10G	500 μ g/mL
Kollagenase, Typ 1, gefiltert	Worthington Biochemical Corporation	CLSS-1, kaufen als 5 x 50 mg Fläschchen (LS004216)	25 U/mL in RPMI
Kompensationskügelchen	Affymetrix	01-1111-41	1 Tropfen pro Dosenröhrchen
Dissoziationsröhrchen	MACS Miltenyi Biotec	130-096-335
FACS Puffer	BD Pharmigen	554657	1x PBS + 2% FBS, mit Natriumazid; gelagert bei 4 Grad; C
Hitzeinaktiviert-FBS	Genesee Scientific	25-525H	10% bei vollständiger Drehzahl & ILC2 Expansion Media
Mouse CCL17	GenScript	Z02954-20	50 ng/ml
Maus CCL22	GenScript	Z02856-20	50 ng/ml
Maus CD4+ T-Zell-Anreicherungskit	STEM Cell Technologies	19852
Maus IL-2	GenScript	Z02764-20	20 ng/ml
Maus ILC2 Anreicherungskit	STEM Cell Technologies	19842
Maus rekombinant IL-33	STEM Cell Technologies	78044	20 ng/mL
RPMI	Life Technologies Corporation	22400071
Separation Buffer	STEM Cell Technologies	20144	1x PBS + 2% FBS; gelagert bei 4 ° C
Kleintiervernebler und -kammer	Data Sciences International
Sterile Kochsalzlösung	Baxter	2F7124; NDC 0338-0048-04	0,9 % Natriumchlorid