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Methodenartikel

Reinigung des menschlichen S100A12 und seiner Ionen-induzierten Oligomere zur Immunzellstimulation

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DOI:

10.3791/60065

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29. September 2019

 ,  , 
1Department of Pediatric Rheumatology and Immunology, University Children's Hospital

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Reinigungsmethode für rekombinantes tagfreies Calciumbindungsprotein S100A12 und seine ioneninduzierten Oligomere für humane Monozytenstimulationstests.

Zusammenfassung

In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode zur Reinigung des humanen Calcium-bindenden Proteins S100A12 und seiner ioneninduzierten Oligomere aus der Escherichia coli-Kultur für Immunzellstimulationen. Dieses Protokoll basiert auf einer zweistufigen Chromatographiestrategie, die die Proteinvorreinigung auf einer Anionenaustauschchromatographiesäule und einen anschließenden Polierschritt auf einer hydrophoben Wechselwirkungssäule umfasst. Diese Strategie produziert S100A12 Protein von hoher Reinheit und Ausbeute zu überschaubaren Kosten. Für funktionelle Tests an Immunzellen erfordert eine eventuelle Rest-Endotoxin-Kontamination eine sorgfältige Überwachung und weitere Reinigungsschritte, um endotoxinfreies Protein zu erhalten. Die mehralsige Endotoxinkontamination kann durch Anionenaustauschchromatographie ausgeschlossen werden. Um Restkontaminationen zu beseitigen, beschreibt dieses Protokoll einen Entfernungsschritt mit Zentrifugalfiltern. Je nach verfügbarer Ionenstärke kann S100A12 in verschiedene Homomultimere anordnen. Um das Verhältnis zwischen Struktur und Funktion zu untersuchen, beschreibt dieses Protokoll die Ionenbehandlung von S100A12-Protein enden, gefolgt von chemischer Vernetzung zur Stabilisierung von S100A12-Oligomeren und deren anschließender Trennung durch Größenausschluss. Chromatographie. Schließlich beschreiben wir einen zellbasierten Assay, der die biologische Aktivität des gereinigten Proteins bestätigt und die LPS-freie Zubereitung bestätigt.

Einleitung

S100A12 ist ein Kalzium-bindendes Protein, das überwiegend von menschlichen Granulozyten produziert wird. Das Protein wird während (systemischer) Entzündungen überexprimiert und sein Serumspiegel, insbesondere bei (auto)entzündlichen Erkrankungen wie systemischer juveniler idiopathischer Arthritis (sJIA), familiärem Mittelmeerfieber (FMF) oder Kawasaki-Krankheit (KD) Krankheitsaktivität und Reaktion auf die Therapie. Abhängig von Mustererkennungsrezeptoren (PRRs) wie gebührenähnlichen Rezeptoren (TLRs) kann das angeborene Immunsystem durch pathogenassoziierte molekulare Muster (PAMPs) wie Lipopolysaccharide (LPS) oder Schäden an assoziierten molekularen Mustern (DAMPs; auch als "Alarmins" bezeichnet). DAMPs sind endogene Moleküle wie zelluläre Proteine, Lipide oder Nukleinsäuren1. DAMP-Funktionen sind für die Mitglieder der Calgranulin-Proteinfamilie, S100A8/A9 und S100A122, die auch als divalente metallionchelisierende antimikrobielle Peptide 3,4, 5,6. Je nach verfügbarer Ionenstärke kann S100A12, wie andere Mitglieder der S100-Familie, in verschiedene Homomultimere einwirken und bis vor kurzem waren die Auswirkungen der S100A12-Oligomerisierung auf die PRR-Interaktion, insbesondere TLR4, unbekannt.

Die monomere Form des Proteins (92 Aminosäuren, 10,2 kDa) besteht aus zwei EF-Hand-Helix-Loop-Helix-Strukturen, die durch einen flexiblen Linker verbunden sind. Die C-Klemme EF-Hand enthält das klassische Ca2+-Bindungsmotiv, während die N-TerminalEF-Hand eine S100-proteinspezifische erweiterte Schleifenstruktur ('pseudo-EF-hand') aufweist und eine reduzierte Ca2+-Affinitätaufweist. Ca2+-Bindung durch S100A12 kann eine wesentliche konforme Veränderung des C-Terminusder Proteine induzieren, was zu einer Exposition eines hydrophoben Pflasters auf jedem Monomer führt und die Dimerisierungsschnittstelle bildet. So ist die kleinste quaternäre Struktur, die durch S100A12 gebildet wird, unter physiologischen Bedingungen ein nicht-kovalenter Dimer (ca. 21 kDa), in dem einzelne Monomere antiparallel ausgerichtet sind. Als Dimer angeordnet, wird S100A12 als Sequestrierung Zn2+ sowie andere divalente Metallionen, z.B. Cu2+ mit hoher Affinität7gemeldet. Diese Ionen werden an der Dimerschnittstelle S100A12 durch die Aminosäuren H15 und D25 einer Untereinheit und H85 sowie H89 der parallel enzierenden anderen Untereinheit8,9,10koordiniert. Während frühere Studien nahelegten, dass Zn2+-geladene S100A12 die Organisation des Proteins in Homo-Tetramere (44 kDa) induzieren und zu einer erhöhten Ca2+-Affinität11,12führen kann, Studien6 schlagen Ca2+-bindung durch S100A12 vor, um die Affinität des Proteins zu Zn2+zu erhöhen. Sobald die S100A12 EF-Zeiger von Ca2+voll belegt sind, wird angenommen, dass zusätzliche Ca2+ zwischen Dimeren binden und die Hexamerbildung auslösen (ca. 63 kDa). Die Architektur der hexamerischen Viertelstruktur unterscheidet sich deutlich von der des Tetramers. Es wird vorgeschlagen, dass die Tetramer-Schnittstelle unterbrochen wird, um neue Dimer-Dimer-Schnittstellen hervorzurufen, die der Hexamer-Bildung10zugute kommen. S100A12 wird fast ausschließlich von menschlichen Granulozyten ausgedrückt, wo es etwa 5% des gesamten zytosolischen Proteins13ausmacht. In seiner DAMP-Funktion wurde S100A12 historisch als Agonist des Multiligandenrezeptors für fortgeschrittene Glykationsendprodukte (RAGE) beschrieben, das damals als extrazelluläres neu identifiziertes RAGE-bindendes Protein (EN-RAGE)14bezeichnet wurde. Obwohl wir früher über biochemische S100A12-Bindung sowohl an RAGE als auch an TLR415berichtet haben, haben wir kürzlich gezeigt, dass menschliche Monozyten auf S100A12-Stimulation in einer TLR4-abhängigen Weise reagieren16. Dies erfordert die Anordnung von S100A12 in seine Ca2+/Zn2+-induzierte hexamerische Viertelstruktur16.

Hier beschreiben wir ein Reinigungsverfahren für rekombinantes menschliches S100A12 und seine ioneninduzierten Oligomere für Immunzellstimulationen16,17. Diese basiert auf einer zweistufigen Chromatographie-Strategie, die zunächst eine Anionenaustauschsäule umfasst, um das Protein zu isolieren und zu konzentrieren und Massenkontaminationen (z.B. Endotoxine/Lipopolysaccharide) zu entfernen18. Ionenaustauscher-Chromatographieharze trennen Proteine auf der Grundlage unterschiedlicher Netzoberflächenladungen. Bei sauren Proteinen wie S100A12 (isoelektrischer Punkt von 5,81) führt ein Puffersystem mit einem pH-Wert von 8,5 und einem starken Anionenaustauschharz zu einer guten Trennung. Gebundene Proteine wurden mit einem hohen Salzpuffergradienten eluiert. Mit einer Erhöhung der Ionenstärke konkurrieren negative Ionen im Elutionspuffer mit Proteinen um Ladungen auf der Oberfläche des Harzes. Proteine, die je nach Nettoladung einzeln elutieren, und dadurch ermöglichen die hier beschriebenen Puffer, das überexprimierte S100A12-Protein zu isolieren und zu konzentrieren. Aufgrund negativ geladener Gruppen in Lipopolysacchariden binden diese Moleküle auch an Anionenaustauschharze. Ihre höhere Nettoladung führt jedoch zu einer späteren Elution im aufgebrachten Hochsalzgradienten. Der zweite Schritt des Reinigungsverfahrens wurde zu Polierzwecken eingeführt. Dies nutzt die Calciumbindungsfähigkeit von S100A12 und entfernt restliche Verunreinigungen an einer hydrophoben Wechselwirkungssäule. Die Calciumbindung von S100A12 führt zu einer Konformationsänderung und einer Exposition hydrophober Flecken auf der Oberfläche des Proteins. Unter diesem Zustand interagiert S100A12 mit der hydrophoben Oberfläche des Harzes. Bei der Calcium-Chelatierung durch EDTA wird diese Wechselwirkung umgekehrt. In Gegenwart von Ionen, insbesondere Kalzium und Zink, ordnet S100A12 zu homomeren Oligomeren. Um Struktur-Funktions-Beziehungen der verschiedenen Oligomere zu untersuchen, stabilisierten wir dimer, tetramerische und hexamerische Rekombinante S100A12 mit einem chemischen Verklinker und trennten die Komplexe auf einer Farbtonographiesäule mit Größenausschluss. Um die Funktionalität und biologische Aktivität des gereinigten Proteins und seiner ioneninduzierten Oligomere zu analysieren, kann schließlich die Zytokinfreisetzung von S100A12 und LPS stimulierter Monozyten verglichen werden.

Verschiedene Methoden zur Reinigung von S100A12 wurden bisher beschrieben. Jackson et al.19veröffentlichten beispielsweise ein Protokoll mit Reinigung über eine Anionenaustauschsäule und eine anschließende Größenausschlusschromatographie. Das Feinpolieren an einer Größenausschlusssäule führt zu guten Ergebnissen, ist aber aufgrund der z. B. begrenzten Ladevolumina weniger flexibel in der Skalierbarkeit. Ein anderer Ansatz, veröffentlicht von Kiss et al.20, beschreibt die Reinigung des markierten Proteins über Ni2+ Affinitätsspalte als ersten Reinigungsschritt, gefolgt von enzymatischer Spaltung, um das Tag zu entfernen und weitere Reinigungsschritte. Im Gegensatz zu den vorherzitierten Studien19,20wird das in diesem Protokoll beschriebene produzierte Protein für Experimente an Immunzellen bestimmt. Daher ist eine Rest-Endotoxin-Kontamination aus der Bakterienkultur eine Herausforderung. Obwohl bisher unterschiedliche Ansätze zur Endotoxinentfernung beschrieben wurden, gibt es keine einheitliche Methode, die für eine gegebene Proteinlösung gleich gut funktioniert21,22.

Zusammenfassend kombiniert unser Protokoll die Vorteile einer tagfreien Expression in einem bakteriellen System mit einer effizienten Endotoxinentfernung und einer hohen Ausbeute an reinem Protein.

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Protokoll

HINWEIS: Zur Vorbereitung von Puffern und Lagerlösungen finden Sie in der Zusatztabelle 1.

1. Proteinexpression in E. coli

  1. Klonen
    1. Klonen Sie tagfreie menschliche S100A12 (NCBI-Referenzsequenz: NP_005612.1) in bakteriellen Expressionsvektor pET11b. Um das Protein auszudrücken, wandeln Sie das Konstrukt in E. coli BL21(DE3) um.
  2. kultur
    1. Bereiten Sie eine Starterkultur vor, indem Sie eine einzelne Kolonie in 5 ml Wachstumsmedium (LB-Brühe mit 100 g/ml Ampicillin) in einem 14 ml Rundbodenrohr impfen. Über Nacht bei 37 °C mit Schütteln bei 220 Rpm inkubieren. Übertragen Sie 2 x 4 ml Übernachtungskultur in 400 ml Wachstumsmedium in einem 2 L Erlenmayer Kolben und bebrüten die Kultur bei 37 °C mit Schütteln bei 220 U/min.
      HINWEIS: Die Anfangsdichte der Hauptkultur sollte die optische Dichte bei 600 nm (OD600) = 0,1 betragen.
    2. Überwachen Sie die OD600 während des Wachstums. Induzieren Sie die Proteinexpression durch Zugabe von 1 M Isopropyl-ß-D-Thiogalactopyranosid (IPTG) zu einer Endkonzentration von 1 mM bei OD600 = 0,5-0,6. Bei 37 °C und 220 Rpm für weitere 4 h inkubieren.
      HINWEIS: Im Allgemeinen wird ein OD600 von 0,6 nach 1,5 bis 2,5 h bei 37 °C erreicht.
    3. Bereiten Sie 50 ml Beschallungspuffer vor, indem Sie 50 mM Tris, 50 mM NaCl und 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in 40 ml entionisiertem Wasser auflösen. PH mit HCl auf 8,0 einstellen und bis zu 50 ml aufstellen. Proteaseinhibitor (1 Tablette pro 50 ml Lösung) hinzufügen und den Puffer auf 4 °C ausdemieren.
    4. Die Bakterienkultur in geeignete Zentrifugenflaschen übertragen und die Zellen bei 3.200 x g 30 min bei 4 °C ernten. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 25 ml eiskaltem Beschallungspuffer wieder auf. Von nun an halten Sie die Zellen auf Eis.
      HINWEIS: Resuspendierte Zellen können kurzfristig bei -20 °C und langfristig bei -80 °C gelagert werden.
  3. Beschallung/Lyse
    1. Sonicate die Zellen für 6 Zyklen von 30 s auf Eis. Nach jedem Zyklus ruhen Zellen für 30 bis 60 s, um die Zellen vor Überhitzung zu schützen.
    2. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein vorgekühltes 50 ml Hochgeschwindigkeitszentrifugationsrohr und Zentrifuge in einem festwinkeligen Rotor bei 15.000 x g für 30 min bei 4 °C. Dekantieren Sie das gereinigte Lysat, das die löslichen zytosolischen Proteine enthält, in ein frisches 50 ml-Rohr und entsorgen Sie das Pellet.

2. Proteinreinigung

  1. Anionenaustauschchromatographie
    1. dialyse
      1. Vorbereiten von Anionenaustauschchromatographie (AIEX) Puffer A durch Auflösen von 20 mM Tris, 1 mM EDTA und 1 mM Ethylenglykol-bis(2-Aminoethylether)-N,N'N',N'-Tetraessigsäure (EGTA) in entionisiertem Wasser und stellen Sie den pH auf 8,5 mit HCl ein. Für die Dialyse vorbereiten 2 x 5 L und für die Chromatographie 2x 1 L AIEX Puffer A.
        HINWEIS: Das Dialysatvolumen sollte etwa das 100-fache des Probenvolumens betragen. Alle Puffer, die für die Chromatographie verwendet werden, sollten gefiltert (0,45 m oder kleiner) und entgast werden (z. B. durch Ultraschallbad oder Vakuumentgasung).
      2. Dialyseschläuche (Molekulargewichtsabschaltung [MWCO]: 3,5 kDa) in eine geeignete Länge mit zusätzlichem Luftraum schneiden, um den Probenauftrieb über dem rotierenden Rührstab zu gewährleisten.
        HINWEIS: Glycerin bewahrt die Membran und muss vor Gebrauch entfernt werden.
      3. Um die Viskosität der geclearten Proteinlösung ab Schritt 1.3.2 zu reduzieren, verdünnen Sie die Lösung mit 25 ml AIEX-Puffer A, um die nachträgliche Anwendung der Chromatographiesäule zu erleichtern. Befestigen Sie den ersten Verschluss an den Schläuchen, laden Sie die Probe in die Membran und befestigen Sie den zweiten Verschluss mindestens 1 cm vom oberen Ende des Schlauches entfernt.
      4. Legen Sie den 5 L Behälter mit AIEX Puffer A auf eine Rührplatte, fügen Sie einen Rührstab hinzu und die Membran mit Proteinlösung gefüllt. Passen Sie die Geschwindigkeit an, um die Probe zu drehen, indem Sie Interferenzen mit dem rotierenden Rührstab vermeiden. Dialyse für 12 x 24 h bei 4 °C, dann den Dialysatpuffer (AIEX-Puffer A) durch eine frische vorgekühlte Zubereitung ersetzen und mindestens 4 weitere Stunden fortsetzen. Übertragen Sie die dialysierte Proteinlösung in ein 50 ml-Rohr und filtern Sie sie über eine 0,45 m Filtereinheit.
        HINWEIS: Lagerung möglich.
    2. Chromatographie
    3. Starten Sie das Flüssigchromatographiesystem (FPLC) mit allgemeiner Wartung, verbinden Sie die Säulenpuffer AIEX A und AIEX B (AIEX Puffer A mit 1 M NaCl) und die anionenaustauschende Harzenthaltende Säule. Allgemeine chromatographische Parameter finden Sie in Tabelle 1.
      ANMERKUNG: Puffer, Säulen- und FPLC-Geräte sollten vor Beginn des Laufs auf dieselbe Temperatur ausgeglichen werden (siehe chromatographische Parameter in Tabelle 1, Tabelle 2, Tabelle 3, Tabelle 4und Tabelle 5).
    4. Die Säule mit dem AIEX-Puffer A auslagern, anschließend die Probe auf die Säule laden und die Proteine mit einem linearen Gradienten von 0% bis 100% Hochsalzpuffer (AIEX B) auflegen. Ein detailliertes Methodenprotokoll finden Sie in Tabelle 2.
    5. Sammeln Sie 2 ml-Fraktionen während der Elution und analysieren Sie 10 l jeder Fraktion auf einer Coomassie-gefärbten 15% Natriumdodecylsulfat Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE). Bündeln Sie die Fraktionen, die S100A12-Protein für die Dialyse enthalten.
      HINWEIS: Das Molekulargewicht von S100A12 beträgt 10.575 Da.
  2. Calciumabhängige hydrophobe Wechselwirkungschromatographie (HIC)
    1. dialyse
      1. Dialyse die Proteinlösung gegen 20 mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7.5 nach dem in Abschnitt 2.1.1 beschriebenen Verfahren.
    2. Chromatographie
      1. Bereiten Sie 1 L Chromatographiepuffer HIC A vor, indem Sie 20 mM Tris, 140 mM NaCl und 25 mM CaCl2 in entionisiertem Wasser auflösen und den pH-Wert auf 7,5 einstellen. Für HIC Puffer B 20 mM Tris, 140 mM NaCl und 50 mM EDTA auflösen. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,0 ein und filtern und entgasen Sie die Puffer. CaCl2 der Probe zu einer Endkonzentration von 25 mM hinzufügen und durch 0,45 m filtern. HIC-Puffer ausdemieren und auf 4 °C (Säulentemperatur) proben.
      2. Starten Sie das Flüssigchromatographiesystem mit allgemeiner Wartung, verbinden Sie die Säulenpuffer HIC A und B und die Säule. Weitere chromatographische Parameter finden Sie in Tabelle 3.
      3. Stellen Sie die Säule aus, laden Sie die Probe und verlängern Sie den Block "Ungebundene Probe waschen", bis das UV-Signal den Basiswert wieder erreicht. Dann beginnen Sie die Elution mit einem Kalziumchelator, der Puffer (EDTA) enthält. Ein detailliertes Methodenprotokoll finden Sie in Tabelle 4.
        HINWEIS: Frühere Experimente haben gezeigt, dass ein Überschuss an Kalzium für die Bindung von S100A12 an das Chromatographieharz von Vorteil zu sein scheint.
      4. Sammeln Sie Spitzenfraktionen von 2 ml und analysieren Sie 10 l von jedem Anteil auf einem Coomassie-gefärbten 15% SDS-PAGE. S100A12-Fraktionen bündeln und gegen Hepes-gepufferte Saline (HBS; 20 mM Hepes, 140 mM NaCl, pH 7.0) dialysieren, wie in Abschnitt 2.1.1 beschrieben.
        HINWEIS: Der Aussterbekoeffizient des monomeren S100A12 beträgt 2980 M-1 cm-1.

3. Nachweis und Entfernung von Endotoxin

  1. Nachweis von Endotoxin
    1. Zur Bestimmung der Endotoxinkontamination die Konzentrationen des verdünnten Proteins ab Schritt 2.2.2.4 messen. (z. B. 1:10 und 1:100 in HBS) mit einem enzymgebundenen Immunsorbent Assay (ELISA)-basierten, fluoreszierenden Endotoxin-Nachweisassay (Materialtabelle). Führen Sie diesen Test durch Befolgen des Herstellerprotokolls durch.
      HINWEIS: Verwenden Sie frisch zubereitete HBS-Lösungen, die in ultrareinem entionisiertem Wasser gelöst werden, um eine (neue) Endotoxinkontamination durch den Puffer zu vermeiden.
  2. Entfernung von Endotoxin und Proteinkonzentration
    1. 15 ml Probe ca. 10 min auf eine 50 kDa Zentrifugalfiltereinheit und Zentrifuge bei 3.200 x g und 10 °C laden. Durchfluss in ein frisches Gefäß (auf Eis) übertragen und das 50 kDa Filterrohr so oft wie nötig nachfüllen und zentrieren. Waschen Sie die Filtermembran zweimal mit HBS, um nach jedem Schritt so viel Protein wie möglich zurückzugewinnen.
    2. Konzentrieren Sie den S100A12-haltigen Durchfluss mit einem 3 kDa Zentrifugalfilter, bis das Volumen auf ein Fünftel bis zu einem Zehntel des ursprünglichen Ladevolumens reduziert wird (Zentrifugation bei 3.200 x g,10 °C für ca. 30 min). Füllen Sie den Filter so oft wie nötig, spülen Sie die Membran ab und übertragen Sie die konzentrierte Lösung nach jeder Nachfüllung in ein neues Rohr. Entsorgen Sie den Durchfluss. Filtern Sie erneut durch 50 kDa, wie oben beschrieben.
      HINWEIS: Während dieses Verfahrens ist der Proteinverlust bemerkenswert (bis zu 50%), aber die verbleibende Proteinzubereitung ist vollständig aus LPS erschöpft. Diese Methode liefert etwa 10 x 15 mg Protein aus 400 ml Kultur.
    3. Stellen Sie die Proteinlösung mit endotoxinfreiem HBS auf 1 mg/ml ein und messen Sie den LPS-Gehalt wie in Schritt 3.1.1 beschrieben. Falls die Proteinlösung noch nicht als LPS-frei (<0.1 EU/ml) getestet wird, beseitigen Sie Restkontaminationen mit einem Endotoxin-Entfernungsharz.
      HINWEIS: Bei einer Proteinkonzentration von 1 mg/ml entspricht die Kontamination von 0,1 EU/ml LPS etwa 0,01 pg LPS/g Protein.

4. Chemische Vernetzung und Oligomertrennung

  1. Chemische Vernetzung
    1. Bereiten Sie hochreine (endotoxinfreie) Stofflösungen von 1 M CaCl2 und 100 mM ZnCl2 in ultrareinem deionisiertem Wasser(Materialtabelle)vor. Verwenden Sie diesen Puffer, frisch gemacht, für den nächsten Schritt.
    2. 10 ml gereinigtes Endotoxinfreies S100A12 (Konzentration 1 mg/ml in HBS) für 30 min bei Raumtemperatur (RT) mit entweder 25 mM CaCl2 für Dimeric/Tetramer, oder 25 mM CaCl2 und 1 mM ZnCl2 für hexameric/tetramere S100A12 Oligomere.
    3. Bereiten Sie den Vernetzener vor, indem Sie 8 mg BS3 in 500 l Endotoxin-freies Wasser direkt vor gebrauchen auflösen (8 mg Vernetzen für 10 ml ionenspiked Proteinlösung entspricht einer Endkonzentration von 1,4 mM). Vernetzen und Proben durch Pipettieren mischen und für weitere 30 min bei RT brüten. Die Reaktion durch Zugabe von 1 M Tris-HCl, pH 7,5 auf eine Endkonzentration von 50 mM und Filter durch 0,45 m ablöschen.
  2. Größenausschlusschromatographie
    1. Die vernetzte Probe auf 12 bis 15 °C (Säulentemperatur) ausdemieren und das Flüssigchromatographiesystem mit allgemeiner Wartung starten. Verbinden Sie den Spaltenpuffer (HBS) und die Spalte Größenausschluss. Ausführliche Informationen finden Sie in Tabelle 5.
    2. Gleichgewichten Sie die Spalte in HBS, laden Sie die Probe aus und sammeln Sie Spitzenbrüche (1 x 2 ml) während des Laufs. Analysieren Sie diese Brüche auf einem 4-20%igen Gradienten SDS-PAGE und Pool-Fraktionen mit Hauptbändern des gewünschten Proteinkomplexes.
      HINWEIS: Die Hydrolyse von NHS-Ester-Reagenzien wie BS3 in wässrigen Lösungen führt zu einer starken Absorption bei 280 nm. Ungebundener Vernetzender (Molekulargewicht: 572 g/mol) elutiert am Ende des Laufs und führt zu einem starken Peak.
    3. Konzentrieren Sie die Lösungen durch den Einsatz von Zentrifugalfiltereinheiten mit MWCOs von 10 kDa (Dimer), 30 kDa (Tetramer) oder 50 kDa (Hexamer). Bestimmen Sie die Endotoxinkontamination, wie in Abschnitt 3.1 beschrieben. Entfernen Sie ggf. das verbleibende LPS mit einem Endotoxinentfernungsharz nach den Empfehlungen des Herstellers (Materialtabelle).

5. Funktionstests an Monozyten

  1. Zubereitung von Monozyten
    1. Isolieren Sie Monozyten von menschlichen Buffy-Schichten durch Dichtegradientenzentrifugation und anschließende Monozytenanreicherung mit einem magnetischen Perlentrennsatz (Tabelle der Materialien).
      HINWEIS: Dieses Protokoll führt zu ca. 5 x 7 x 107 Monozyten (ein buffy Mantel) mit einer Reinheit von 83 x 95%. Da die Anzahl, aber auch die Reaktionsfähigkeit der Zellen stark vom Spender abhängt, muss das Protokoll möglicherweise skaliert werden (abhängig von der erforderlichen Zellzahl).
    2. Für die Dichtezentrifugation die Trennlösung (Dichte = 1,077 g/ml) auf RT ausdemieren und 20 ml in 50 ml Zentrifugenrohre (2 Tuben pro Buffy-Schicht) übertragen. Blut aus dem menschlichen Buffy-Mantel mit Hanks gepufferter Salzlösung (HBSS) auf ein Gesamtvolumen von 60 ml verdünnen und 30 ml dieser Mischung sorgfältig auf das Trennmedium schichten. Zentrifuge bei 550 x g für 35 min bei RT. Deaktivieren Sie die Zentrifugenbremse.
    3. Nach der Zentrifugation befinden sich die mononukleären peripheren Blutkörperchen (PBMCs) direkt auf dem Trennmedium. Übertragen Sie diese Zellen in ein frisches 50 ml Zentrifugenrohr, machen Sie bis zu 50 ml mit HBSS und Zentrifuge bei 170 x g für 10 min. Den Überstand ansaugen und das Zellpellet in einem kleinen HBSS-Volumen durch Pipettieren wieder aufsetzen.
    4. Füllen Sie das Rohr bis zu 50 ml und Zentrifuge bei 290 x g für 10 min. Aspirieren Sie den Überstand erneut, setzen Sie die Zellen in HBSS (50 ml) und Zentrifuge bei 170 x g für 10 min. Zählen Sie die Zellen und setzen Sie sie im Zelltrennpuffer wieder aus (Tabelle der Materialien /c9>) auf eine Konzentration von 5 x 107 Zellen/ml.
      HINWEIS: Anstelle von HBSS kann phosphatgepufferte Saline (PBS) zum Waschen der Zellen verwendet werden.
    5. Verwenden Sie für die Monozytenisolation von PBMCs ein magnetisches Negativzellisolationskit und folgen Sie dem Herstellerprotokoll. Monozyten zählen und in Monozytenmedium (RPMI 1640, 15% hitzeinaktiviertes fetales Kalbsserum [FCS], 4 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin/Streptomycin) auf eine Konzentration von 2 x 106 Zellen/ml zählen.
    6. Zur Kultur monozyten, Mantel Kulturgerichte (z.B. 100 mm) mit einem hydrophoben, gasdurchlässigen Film, geeignet fürSuspensionszellen( Tisch der Materialien ). Sterilisieren Sie die Platten mit UV-Licht ca. 30 min. Übertragen Sie die Zellen auf diese Kulturplatten und lassen Sie sie über Nacht bei 37 °C und 5%CO2ruhen.
      HINWEIS: Verwenden Sie 15 bis 25 ml Zellsuspension pro beschichteter Schale.
  2. Monozytenstimulation
    1. Stimulation mit S100A12 (Wildtyp)
      HINWEIS: Um unbehandeltes S100A12 (Endprodukt aus Abschnitt 2.2.2) von vernetztem Protein zu unterscheiden, wird S100A12 im Folgenden als "Wildtyp" bezeichnet.
      1. Übertragen Sie die ausgeruhten Zellen in ein 50 ml Zentrifugalrohr und Zentrifuge bei 350 x g für 10 min. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet im Stimulationsmedium (RPMI 1640, 5% hitzeinaktiviertes FCS, 4 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin/ Streptomycin) in einer Konzentration von 2 x 106 Zellen/ml.
      2. Zur Stimulation verwenden Sie 24 Well Suspension Platten und fügen Sie 250 l Zellsuspension pro Bohrkörper (0,5 x 106 Zellen/Well) hinzu. Fügen Sie den vorgesehenen Brunnen 50 g/ml Polymyxin B hinzu, gefolgt von LPS in verschiedenen Konzentrationen (25, 50, 100 und 200 pg/ml) oder dem Wildtyp S100A12 (10, 20, 40, 60 g/ml). Wenden Sie das Protein entweder unbehandelt oder wärmedenaturiert (99 °C, 10 min) in verschiedenen Konzentrationen auf die Zellen an.
        HINWEIS: Eine kurze Wärmebehandlung denaturiert S100A12 Protein, hat aber weniger bis gar keine Auswirkungen auf LPS.
      3. Inkubationsplatten für 4 h bei 37 °C und 5%CO2. Ernte der Zellen durch Übertragung der Zellsuspension jedes Brunnens auf 1,5 ml Reaktionsröhren. Zentrifuge bei 500 x g für 10 min. Überführen Sie die Überräube in frische Schläuche und messen Sie die TNF-Freisetzung in verschiedenen Verdünnungen (z.B. 1:2, 1:5, 1:10) mit einem menschlichen TNF-ELISA-Kit nach den Empfehlungen des Herstellers.
    2. Stimulation mit S100A12 Oligomeren
      1. Bereiten Sie Monozyten in 24 gut aufhängungen Platten wie oben beschrieben vor und säen Sie sie aus. Stimulieren Sie Zellen durch Zugabe von S100A12-Oligomeren aus Schritt 4.2.3. in verschiedenen Molkonzentrationen (125 nM, 250 nM, 500 nM, 1000 nM).
        HINWEIS: Um die Fähigkeiten der verschiedenen Oligomere zur Stimulierung von Monozyten zu vergleichen, wurden Oligomere in vergleichbaren Molkonzentrationen auf die Zellen aufgetragen.
      2. Inkubieren Sie für 4 h bei 37 °C und 5%CO2, ernten Sie die Zellen und messen Sie die TNF-Freisetzung in den Überstand, wie oben beschrieben.

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Ergebnisse

Nach vorerierierweiser AIEX-Säule (Abbildung 1A-C) und anschließender kalziumabhängiger HIC (Abbildung 2A,B) wurde hochreines Protein gewonnen (Abbildung 2C). Darüber hinaus ergaben Messungen von Endotoxin eine erfolgreiche LPS-Entfernung. Der LPS-Gehalt nach AIEX wurde in einer Verdünnung von 1:10 über dem Assay-Nachweisgrenzwert, d. h. über 500 EU/ml, gemessen. Nach der ersten Filtration durch ein...

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Diskussion

In diesem Protokoll beschreiben wir die tagfreie bakterielle Expression des menschlichen S100A12 und seine Reinigung sowie die Trennung in verschiedene Ionen-induzierte Oligomere zur Immunzellstimulation. Im Vergleich zur veröffentlichten Literatur zur S100A12-Proteinreinigung8,23,24ist die Verwendung von hohem CaCl2 (25 mM) in der hydrophoben Wechselwirkungschromatographie unseres Wissens einzigartig. Mehrere Protoko...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Studie wurde durch Stipendien des intramuralen innovativen medizinischen Forschungsprogramms der Medizinischen Fakultät der Universität Münster (KE121201 bis C.K.) und der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG, Fo354/3-1 bis D.F.)unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
pET11b VektorNovagen   
BL21(DE3) kompetent E. coliNew England BiolabsC2527 
       
100x Nicht-essentielle AminosäurenMerckK 0293
25% HClCarl RothX897.1
4− 20% Mini-PROTEAN TGX Protein GeleBioRad4561093
Ampicillin NatriumsalzCarl RothHP62.1
BS3 (Bis(sulfosuccinimid)suberat) - 50 mgThermoFisher Scientific21580
Calciumchlorid DihydratCarl Roth5239.1
Coomassie Briliant Blue R250 EntfärbungslösungBioRad1610438
Coomassie Briliant Blue R250 FärbelösungBioRad1610436
EasySep Humanes MonozytenanreicherungskitStammzelle19059Isoliertes Kit für magnetische negative Zellen
EDTA DinatriumsalzdihydratCarl Roth8043.1
EGTACarl Roth3054.3
EndoLISAHyglos609033Endotoxin-Nachweis Assay
Endotoxinfreies ReinstwasserSigma-AldrichTMS-011-AReinstwasser zur Herstellung von endotoxinfreien Puffern
EndoTrap rotHyglos321063Endotoxinentfernungsharz
FBS (hitzeinaktiviert)Gibco10270
HBSS, kein Kalzium, kein MagnesiumThermoFisher Scientific14175053
HepesCarl Roth9105
Hepes (hohe Qualität, Endotoxin getestet)Sigma-AldrichH4034
hTNF-alpha - OptEia ELISA SetBD555212
IPTG (isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid)Carl RothCN08.1
L-Glutamin (200 mM)MerckK 0282
LB-MediumCarl RothX968.1
Lipopolysaccharide aus E. coli O55:B5MerckL6529
Pancoll, humanPAN BiotechP04-60500Trennlösung (Dichtegradientenzentrifugation)
Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ml)MerckA 2212
Phenylsepharose Hochleistungs-GEHealthcare17-1082-01Harz für hydrophobe Interaktionschromatographie
Polymyxin BInvivogentlrl-pmb
Proteasehemmer TablettenRoche11873580001
Q Sepharose Fast FlowGE Healthcare17-0510-01Harz für die Anionenaustauschchromatographie
RoboSep PufferStemcell20104Zelltrennungspuffer (Abschnitt 5.1.4)
RPMI 1640 MediumMerckF 1215
Natriumchlorid (NaCl)Carl Roth3957.2
NatriumhydroxidCarl RothP031.1
TrisbaseCarl Roth4855.3
ZinkchloridCarl RothT887<
strong>Labware
0,45 &Mikro; m SpritzenfilterMerckSLHA033SS
14 mL RundbodenröhrchenBD352059
2 L Erlenmyer KolbenCarl RothLY98.1
24 Well SuspensionsplattenGreiner662102
5 L MessbecherCarl RothCKN3.1
50 mL konische ZentrifugenröhrchenCorning430829
50 mL Hochgeschwindigkeits-ZentrifugenröhrchenEppendorf3,01,22,178
Amicon Ultra-15 Zentrifugalfiltereinheit MWCO 3 kDaMerckUFC900324
Amicon Ultra-15 Zentrifugalfiltereinheit MWCO 50 kDaMerckUFC905024
Kulturschale (100 mm)Sarstedt83.3902
Verschlüsse für DialyseschläucheSpektrum132738
EasySep Magnet 'The Big Easy'Stammzelle18001
Fraktionssammlerröhrchen 5 mLGreiner115101
Lumox Film, 25 & micro; m, 305 mm x 40 mSarstedt94,60,77,316Folie für Monozyten-Kulturplatten
Spectra/Por Dialysemembran (3,5 kDa)Spectrum132724
Steritop FiltereinheitMerckSCGPT01RE
Equipment
37 ° C Inkubator (mit Schütteln)New Brunswick ScientificInnova 42
Ä KTA Reiniger UPC 10GE HealthcareFPLC System
FraktionssammlerGE HealthcareFrac-920
Zentrifuge (mit Rotor A-4-81)Eppendorf5810R
FestwinkelrotorEppendorfF-34-6-38
Mini Protean Tetra Cell BioRad1658000EDU
NanoPhotometerImplenP330
SonicatorBrandelinUW2070
Fluoreszenz-ReaderTecanunendlich M200PRO pH-Messgerät
Knick765

Referenzen

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S100A12-AufreinigungAnionenaustauschchromatographiehydrophobe InteraktionschromatographieGrößenausschlusschromatographiechemische QuervernetzungEndotoxinentfernungMonozytenisolationTNF-Alpha-Freisetzung
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