Generierung definierter genomischer Modifikationen mit CRISPR-CAS9 in humanen pluripotenten Stammzellen

Summary

Dieses Protokoll bietet eine Methode zur Erleichterung der Erzeugung definierter heterozygoter oder homozygoter Nukleotid-Änderungen mit CRISPR-CAS9 in menschlichen pluripotenten Stammzellen.

Abstract

Menschliche pluripotente Stammzellen bieten ein leistungsfähiges System, um die Genfunktion zu untersuchen und modellspezifische Mutationen zu modellieren, die für Krankheiten relevant sind. Die Erzeugung präziser heterozygoter genetischer Modifikationen ist aufgrund der CRISPR-CAS9-vermittelten Indelbildung im zweiten Allel eine Herausforderung. Hier zeigen wir ein Protokoll, um diese Schwierigkeit zu überwinden, indem wir zwei Reparaturvorlagen verwenden, in denen nur eine die gewünschte Sequenzänderung ausdrückt, während beide Vorlagen stille Mutationen enthalten, um Nachschneiden und Indelbildung zu verhindern. Diese Methode ist am vorteilhaftesten für Gen-Editing-Codierungsregionen der DNA, um isogene Kontrolle und mutierte menschliche Stammzelllinien für die Untersuchung menschlicher Krankheiten und Biologie zu generieren. Darüber hinaus wurden Optimierungen von Transfektions- und Screening-Methoden durchgeführt, um Arbeit und Kosten eines Gen-Editing-Experiments zu reduzieren. Insgesamt ist dieses Protokoll weithin auf viele Genom-Editing-Projekte anwendbar, die das menschliche pluripotente Stammzellmodell verwenden.

Introduction

Menschliche embryonale Stammzellen (hESCs) und induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) sind wertvolle Werkzeuge zur Modellierung menschlicher Krankheiten aufgrund ihrer Fähigkeit zur Erneuerung, wobei die Fähigkeit zur Erzeugung von Zelltypen verschiedener Abstammungen beibehalten wird^{1,2 ,3,4}. Diese Modelle eröffnen die Möglichkeit, die Genfunktion zu befragen und zu verstehen, wie spezifische Mutationen und Phänotypen mit verschiedenen Krankheiten zusammenhängen^5,6. Um jedoch ....

Protocol

1. Entwurf und Konstruktion von Guide RNA (gRNA)

HINWEIS: Jede gRNA besteht aus zwei 60 Basenpaar (bp) Oligonukleotiden, die geglüht werden, um ein 100 bp Doppelsträngiges (ds) Oligonukleotid zu erzeugen (Abbildung 1A-C). Der Zeitplan für die Effizienz des gRNA-Designs, der Erzeugung und des Testens beträgt ca. 2 Wochen (Abbildung 2).

1. Wählen Sie den DNA-Bereich aus, der für das Genom von Interesse ist, und identifizieren Sie 3-4 23 bp Sequenzen, die in das Format 5'-G(N₁₉)NGG-3' passen. Diese Sequenzen sollten sich innerhalb von 20 bp der Inter....

Results

Generierung von gRNAs und Screening für Indels

Jede gRNA wird in einen Plasmidvektor geklont und mit dem U6-Promotor exprimiert. Das AflII Restriktionsenzym wird zur Linearisierung des Plasmids (Addgen #41824) verwendet und befindet sich nach dem U6-Promotor. Das nach dem Glühen der beiden 60 bp Oligos erzeugte 100 bp-Band wird mit Hilfe der DNA-Assembly in den gRNA-Expressionsvektor geklont. Sobald die gRNA-Plasmide erzeugt sind, werden sie zusammen mit einem CRISPS-.......

Discussion

In diesem Protokoll wird die Verwendung von CRISPR-CAS9 zusammen mit zwei ssODN-Reparaturvorlagen zur Erzeugung spezifischer heterozygoter oder homozygoter Genomveränderungen in menschlichen pluripotenten Stammzellen nachgewiesen. Diese Methode führte zur erfolgreichen Erzeugung isogener Zelllinien, die heterozygote genomische Veränderungen mit einer Effizienz von fast 10 % exdrücken. Dieses Protokoll wurde sowohl für menschliche ESCs als auch für iPSCs optimiert, die auf bestrahlten MEFs angebaut werden, die das Zellwac.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-ml-Röhrchen aus Polystyrol mit rundem Boden und Kappe für das Zellsieb	Corning	352235
6-Well-Gewebekulturschalen aus Polystyrol	Corning	353046
AflII-Restriktionsendonuklease	New England Biolabs	R0520
Agarose	VWR	N605
DMEM/F12 Medium	ThermoFisher	11320033
dNTPs	Roche	11969064001
Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierer (FACS) Gerät
Gel-Extraktionskit	Macherey-Nagel	740609
Gibson Assembly Kit	New England Biolabs	E2611
gRNA_Cloning Vector	Addgene	41824
LB Agarplatten mit 50 μa; g/ml Kanamycin
Lipofectamine Stem Reagenz	ThermoFisher	(STEM00001)
Matrigel Wachstumsfaktor reduziert (GFR)	Corning	354230
murine embryonale Fibroblasten (MEFs)
Nukleospin Gel-Extraktions- und PCR-Clean-up-Kit	Macherey-Nagel	740609
Orbitalschüttel-Inkubator
pCas9_GFP Vektor	Addgene	44719
PCR-Streifenröhrchen	USA Scientific	1402-2900
Phusion High Fidelity DNA-Polymerase und 5&fach; Phusion Puffer	New England Biolabs	M0530
PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit	Invitrogen	K210011
Proteinase K	Qiagen	Qiagen 19133
StellarTM elektrokompetente Escherichia coli Zellen	Takara	636763
SOC Medium	New England Biolabs	B9020S
TrypLE Express Enzym	ThermoFisher	12605036
Y-27632 Dihydrochlorid/ROCK-Inhibitor (ROCKi)	Tocris	1254