A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice

Zusammenfassung

Wir präsentieren eine robuste, kostengünstige und flexible Methode zur Messung von Veränderungen der Hepatozytenzahl und der Kernploidie in festen/kryokonservierten Gewebeproben, die keine Durchflusszytometrie erfordern. Unser Ansatz bietet eine leistungsstarke probenweite Signatur der Leberzytologie, ideal für die Verfolgung des Fortschreitens von Leberverletzungen und Krankheiten.

Zusammenfassung

Wenn die Leber verletzt ist, hepatozyten Zahlen abnehmen, während Zellgröße, Kerngröße und Ploidy zu erhöhen. Die Ausdehnung von nicht-parenchymalen Zellen wie Cholangiozyten, Myofibroblasten, Vorläufern und Entzündungszellen weist auch auf chronische Leberschäden, Gewebeumbau und Krankheitsprogression hin. In diesem Protokoll beschreiben wir einen einfachen Ansatz mit hohem Durchsatz zur Berechnung von Veränderungen in der zellulären Zusammensetzung der Leber, die mit Verletzungen, chronischen Krankheiten und Krebs verbunden sind. Wir zeigen, wie Informationen aus zweidimensionalen (2D) Gewebeabschnitten verwendet werden können, um hepatozyte Kernploidie innerhalb einer Probe zu quantifizieren und zu kalibrieren und es dem Benutzer zu ermöglichen, bestimmte Ploidie-Teilmengen innerhalb der Leber in situ zu lokalisieren. Unsere Methode erfordert Zugang zu festem/gefrorenem Lebermaterial, grundlegenden immunzytochemischen Reagenzien und jeder Standardplattform für bildende Bildgebungsmittel mit hohem Inhalt. Es dient als leistungsstarke Alternative zu Standard-Flow-Zytometrie-Techniken, die Eine Unterbrechung des frisch gesammelten Gewebes, Verlust räumlicher Informationen und potenzielle Disaggregationsverzerrung erfordern.

Einleitung

Hepatozyten in der Säugetierleber können einer stockenden Zytokinese unterzogen werden, um binukleare Zellen zu produzieren, und DNA-Endoreplikation, um polyploide Kerne zu produzieren, die bis zu 16N DNA-Gehalt enthalten. Insgesamt zelluläre und nukleare Ploidie erhöhen während der postnatalen Entwicklung, Alterung und als Reaktion auf verschiedene zelluläre Belastungen¹. Der Prozess der Polyploidisierung ist dynamisch und reversibel², obwohl seine genaue biologische Funktion unklar bleibt³. Erhöhte Ploidie ist verbunden mit reduzierter Proliferativfähigkeit⁴, genetische V....

Protokoll

Alle Tierversuche wurden zuvor von der CIPF-Ethikkommission genehmigt. Mäuse wurden in einer pathogenfreien Anlage im Centro de Investigacion Principe Felipe (Valencia, Spanien) untergebracht, registriert als Versuchstierzüchter, Anwender und Versorgungszentrum (reg. ES 46 250 0001 002) nach den geltenden europäischen und spanischen Tierschutzvorschriften (FU 53/2013).

1. Gewebeernte und Probenvorbereitung

HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt, wie Gewebe ohne vorherige Fixierung oder Kryokonservierung eingefroren wird. Für zuvor fixierte/kryokonservierte Proben fahren Sie mit Abschnitt 2 fort und lassen Sie Schritt....

Ergebnisse

Diese Methode wurde verwendet, um die Auswirkungen von cholestatischen Verletzungen auf die erwachsene Mausleber zu messen, indem Tiere für 0-21 Tage mit einer hepatotoxischen Diät gefüttert wurden, die 0,1% 3,5-Diethoxycarbonyl-1,4-Dihydrocollidin (DDC)¹⁷enthält. Chronische DDC-Fütterung führt zu hepatozellulären Verletzungen erhöhte Ploidie und Periportal Expansion von NPCs. Der Benutzer sollte sich bewusst sein, dass Mausstamm und altersabhängige Unterschiede in.......

Diskussion

Ein hochgehaltiger, hochdurchsatzhoher Ansatz für die Analyse der Gewebeumgestaltung und Schätzung der Hepatozyten-Atomploidie in der murinen Leber wird beschrieben. Sobald ein Benutzer mit dem Verfahren vertraut ist, kann er mehrere Proben in einem Zeitraum von 3 bis 5 Tagen verarbeiten, abbilden und analysieren, wodurch große testbare Datasets generiert werden, die eine detaillierte Signatur des Leberzustands bereitstellen. Angesichts der Einfachheit der Probenvorbereitungsmethode, zusammen mit der großen Anzahl der an.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
3,5-Diethoxycarboxynl-1,4-dihydrokollidin-Diät (DDC)	TestDiet	1810704	modifizierte LabDiet Mausdiät 5015 mit 0,1% DDC
Alexa Fluor 488 Esel Anti-Ziege IgG (H+L)	Invitrogen	A11055	Verdünnung 1:500
Rinderserumalbumin	Sigma-Aldrich	A7906
Kryostat Leica CM1850 UV	Leica biosystems	CM1850 UV	Gewebeschnitt
Fluoreszierendes Eindeckmedium	Dako	S3023
GraphPad Prism	GraphPad Software	Prism 8	Statistische Software für die grafische Darstellung von Daten
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	B2261	Endkonzentration 5 & Mikro; g/mL
IN Cell Analyzer 1000	GE Healthcare Bio-Sciences Corp		High-Content Cellular Imaging and Analysis System
MATLAB	MathWorks	R2019a	Datenanalysesoftware für die automatisierte Analyse von nuklearer Ploidie
Objektträger VWR	International	630-2864	Größe von 24 x 60 mm
Microsoft Office Excel	Microsoft		Speadsheet Software
OCT Tissue Tek	Pascual y Furió	4583
Paraformaldehyd	Panreac AppliChem	141451.121
Pen für die Immunfärbung	Sigma-Aldrich	Z377821-1EA	Spitzenbreite
Polysin Mikroskop Objektträger	VWR International	631-0107
Kaninchen polyklonal Anti-HNF4α	Thermo Fisher Scientific	PA5-79380	Verdünnung 1:250 (alternativ)
Rabit polyklonales Anti-HNF4α	Santa Cruz Biotechnology	sc-6556	Verdünnung 1:200 (in der Studie verwendeter Antikörper)
Tween	20 Sigma-Aldrich	P5927

5mm