Methodenartikel

Charakterisierung von immunzellulären Vesikeln und Untersuchung der funktionellen Auswirkungen auf die Zellumgebung

DOI:

10.3791/60118

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2. Juni 2020

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1U1192-Laboratoire Protéomique, Réponse Inflammatoire et Spectrométrie de Masse (PRISM), Univ. Lille, INSERM

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Der vorliegende Bericht hebt die chronologischen Anforderungen an die extrazelluläre Vesikel-Isolierung (EV) von Mikroglia oder Blutmakrophagen hervor. Mikroglia-abgeleitete Elektrofahrzeuge wurden als Regulatoren des Neuritenwachstums evaluiert, während von Blutmakrophagen abgeleitete Elektrofahrzeuge bei der Kontrolle der C6-Gliomzellinvasion in In-vitro-Assays untersucht wurden. Ziel ist es, diese EV-Funktionen als Immunvermittler in bestimmten Mikroumgebungen besser zu verstehen.

Zusammenfassung

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Der neuroinflammatorische Zustand des Zentralnervensystems (ZNS) spielt bei physiologischen und pathologischen Erkrankungen eine Schlüsselrolle. Mikroglia, die ansässigen Immunzellen im Gehirn und manchmal die infiltrierenden Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen (BMDMs), regulieren das entzündungshemmende Profil ihrer Mikroumgebung im ZNS. Es wird nun akzeptiert, dass die extrazellulären Vesikelpopulationen (EV) aus Immunzellen als Immunmediatoren fungieren. Daher sind ihre Sammlung und Isolierung wichtig, um ihren Inhalt zu identifizieren, aber auch ihre biologischen Auswirkungen auf Empfängerzellen zu bewerten. Die vorliegenden Daten heben die chronologischen Anforderungen an die EV-Isolierung von Mikrogliazellen oder Blutmakrophagen hervor, einschließlich der Schritte zur Ultrazentrifugation und Größenausschlusschromatographie (SEC). Eine nicht zielgerichtete proteomische Analyse ermöglichte die Validierung von Proteinsignaturen als EV-Marker und charakterisierte den biologisch aktiven EV-Gehalt. Mikroglia-abgeleitete Elektrofahrzeuge wurden auch funktionell auf der Primärkultur von Neuronen verwendet, um ihre Bedeutung als Immunmediatoren im Neuritenwachstum zu bewerten. Die Ergebnisse zeigten, dass mikroglia-abgeleitete Elektrofahrzeuge dazu beitragen, das Neuritenwachstum in vitro zu erleichtern. Parallel dazu wurden von Blutmakrophagen abgeleitete Elektrofahrzeuge funktionell als Immunmediatoren in Sphäroidkulturen von C6-Gliomzellen eingesetzt, die Ergebnisse zeigten, dass diese EVs die Gliomzellinvasion in vitro kontrollieren. Dieser Bericht hebt die Möglichkeit hervor, die EV-vermittelten Immunzellfunktionen zu bewerten, aber auch die molekularen Grundlagen einer solchen Kommunikation zu verstehen. Diese Entschlüsselung könnte die Verwendung natürlicher Vesikel und/oder die In-vitro-Vorbereitung von therapeutischen Vesikeln fördern, um Immuneigenschaften in der Mikroumgebung von ZNS-Pathologien nachzuahmen.

Einleitung

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Viele Neuropathologien stehen im Zusammenhang mit dem neuro-inflammatorischen Zustand, der ein komplexer Mechanismus ist, der zunehmend in Betracht gezogen wird, aber immer noch schlecht verstanden wird, weil die Immunprozesse vielfältig sind und von der Zellumgebung abhängen. Tatsächlich beinhalten die ZNS-Erkrankungen nicht systematisch die gleichen Aktivierungssignale und Immunzellpopulationen, so dass die pro- oder entzündungshemmenden Reaktionen als Ursachen oder Folgen von Pathologien schwer zu bewerten sind. Die hirnresidenten Makrophagen, die als "Mikroglia" bezeichnet werden, scheinen an der Schnittstelle zwischen Nerven- und Immunsystem zu sein1. Mikroglia haben einen myeloischen Ursprung und werden aus dem Dottersack während der primitiven Hämatopoese abgeleitet, um das Gehirn zu kolonisieren, während periphere Makrophagen von der fetalen Leber während der definitiven Hämatopoese abgeleitet werden, um periphere Makrophagen zu werden2. Die Mikrogliazellen kommunizieren mit Neuronen und neuronabgeleiteten Gliazellen wie Astrozyten und Oligodendrozyten3. Mehrere neuere Studien haben gezeigt, dass Mikroglia an neuronaler Plastizität während der ZNS-Entwicklung und der Homöostase von Erwachsenengewebe beteiligt ist, und auch im entzündlichen Zustand, der mit neurodegenerativen Erkrankungen assoziiert ist4,5. Andernfalls kann die Integrität der Blut-Hirn-Schranke in anderen ZNS-Pathologien beeinträchtigt werden. Die Immunantworten, insbesondere bei Glioblastom-Multiforme-Krebs, werden nicht nur von Mikroglia-Zellen unterstützt, da die Blut-Hirn-Schranke durch angiogene Prozesse und das Vorhandensein von Lymphgefäßen6,7reorganisiert wird. Daher tritt eine große Knochenmark-abgeleitete Makrophagen (BMDMs) Infiltration im Hirntumor durch tumorabhängige Angiogenesemechanismen8auf. Die Krebszellen üben einen signifikanten Einfluss auf infiltrierte BMDMs aus, was zu immunsuppressiven Eigenschaften und Tumorwachstum9führt. So ist die Kommunikation zwischen den Immunzellen und ihrer Gehirnmikroumgebung schwer zu verstehen, da der Zellursprung und die Aktivierungssignale unterschiedlich sind10,11. Es ist daher interessant, die Funktionen immunzellassoziierter molekularer Signaturen unter physiologischen Bedingungen zu erfassen. In diesem Zusammenhang kann die Zell-Zell-Kommunikation zwischen Immunzellen und Zellmikroumgebung durch die Freisetzung von extrazellulären Vesikeln (EVs) untersucht werden.

Die Elektrofahrzeuge werden mehr und mehr in der Regulierung von Immunfunktionen unter gesunden sowie pathologischen Bedingungen untersucht12,13. Zwei Populationen, Exosomen und Mikrovesiken, können berücksichtigt werden. Sie präsentieren unterschiedliche Biogenese und Größenbereiche. Die Exosomen sind Vesikel von 30 bis 150 nm Durchmesser und werden aus dem endosomalen System erzeugt und bei der Fusion von multivesicularen Körpern (MVBs) mit der Plasmamembran abgesondert. Die Mikrovesiken haben einen Durchmesser von etwa 100–1.000 nm und werden durch einen nach außen gerichteten Aufblühen aus der Zellplasmamembran14erzeugt. Da die Exosome n.A.-Mikrovesik-Diskriminierung je nach Größe und molekularen Mustern immer noch schwer zu realisieren ist, werden wir im vorliegenden Bericht nur den Begriff Elektrofahrzeuge verwenden. Die EV-assoziierte Kommunikation im ZNS stellt einen Ahnenmechanismus dar, da Studien ihre Beteiligung an wirbellosen Arten wie Nematoden, Insekten oder Anneliden15,16zeigten. Darüber hinaus zeigen die Ergebnisse, die zeigen, dass Elektrofahrzeuge mit Zellen verschiedener Arten kommunizieren können, diesen Mechanismus als Schlüsselschlosssystem, das zunächst auf der Oberflächenmolekülerkennung zwischen Vesikeln und Empfängerzellen basiert und dann die Aufnahme von Mediatoren16,17ermöglicht. Tatsächlich enthalten die Elektrofahrzeuge viele Moleküle wie Proteine (z. B. Enzyme, Signaltransduktion, Biogenesefaktor), Lipide (z. B. Ceramid, Cholesterin) oder Nukleinsäuren (z. B. DNA, mRNA oder miRNAs), die als direkte oder indirekte Regulatoren der Empfängerzellaktivitäten14wirken. Deshalb wurden auch methodische Studien an Immunzellen durchgeführt, um Elektrofahrzeuge zu isolieren und ihre Proteinsignaturen vollständig zu charakterisieren18,19.

Die frühesten Studien zeigten die Freisetzung von Exosomen aus primär kultivierter Rattenmikroglia als induzierbaren Mechanismus nach einer Wnt3a- oder Serotonin-abhängigen Aktivierung20,21. Funktionell im ZNS regulieren mikroglia-abgeleitete Elektrofahrzeuge die synaptische Vesikelfreisetzung durch präsynaptische Terminals in Neuronen, die zur Kontrolle der neuronalen Erregbarkeit beitragen22,23. Mikroglia-abgeleitete Elektrofahrzeuge könnten auch Zytokine-vermittelte Entzündungsreaktionen in großen Hirnregionen24,25vermehren. Wichtig ist, dass die verschiedenen Liganden für die gebührenähnliche Rezeptorfamilie bestimmte Produktionen von Elektrofahrzeugen in der Mikroglia26aktivieren könnten. Beispielsweise zeigen In-vitro-Studien, dass LPS-aktivierte Mikroglia BV2-Zelllinien differenzielle EV-Gehalte einschließlich pro-inflammatorische Zytokineproduzieren 27. Daher könnte die funktionelle Vielfalt von Immunzellsubpopulationen in den ZNS-, Mikroglia- und infiltrierenden BMDMs durch ihre eigenen EV-Populationen bewertet werden, einschließlich der Auswirkungen von Elektrofahrzeugen auf Empfängerzellen und der Identifizierung von EV-Inhalten.

Wir haben zuvor Methoden beschrieben, um die funktionellen Eigenschaften von Mikroglia- und BMDM-abgeleiteten Elektrofahrzeugen nach deren Isolierung zu bewerten16,19. Im vorliegenden Bericht schlagen wir vor, die Wirkung von mikroglia-abgeleiteten Elektrofahrzeugen auf das Neuritenwachstum und die Wirkung von makrophageabgeleiteten Elektrofahrzeugen auf die Kontrolle von Gliomzellaggregaten unabhängig zu bewerten. Diese Studie schlägt auch eine breit angelegte proteomische Analyse der EV-Fraktionen vor, um das EV-Isolationsverfahren zu validieren und die biologisch aktiven Proteinsignaturen zu identifizieren. Die wohltuende Wirkung und die molekulare Entschlüsselung von EEV-Inhalten könnten ihnen helfen, sie zu manipulieren und als therapeutische Mittel bei Hirnerkrankungen zu verwenden.

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Protokoll

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1. Primärkultur von Mikroglia/Makrophagen

  1. Primärkultur der Mikroglia
    1. Kultur kommerzielle Ratte primäre Mikroglia (2 x 106 Zellen) (siehe Tabelle der Materialien) in Dulbecco modifizierte Eagle Medium (DMEM) ergänzt mit 10% exosomenfreies Serum, 100 U/ml Penicillin, 100 g/ml Streptomycin und 9,0 g/L Glukose bei 37 °C und 5% CO2.
    2. Sammeln Sie das konditionierte Medium nach einer 48-Stunden-Kultur und gehen Sie zur Isolierung von Elektrofahrzeugen.
  2. Primärkultur von Makrophagen
    1. Kultur kommerzielle Rattenprimärmakrophagen (1 x 106 Zellen) im vom Hersteller zur Verfügung gestellten Medium (siehe Materialtabelle) bei 37 °C und 5%CO2mit exosomenfreiem Serum.
    2. Sammeln Sie das konditionierte Medium nach einer 24-Stunden-Kultur und gehen Sie zur Isolierung von Elektrofahrzeugen.

2. Isolierung von Elektrofahrzeugen

  1. Vorisolation von Elektrofahrzeugen von konditioniertem Medium
    1. Übertragen Sie das konditionierte Kulturmedium aus Mikroglia- oder Makrophagenkulturen (Schritte 1.1.2 oder 1.2.2) in ein konisches Rohr.
    2. Zentrifuge bei 1.200 x g für 10 min bei Raumtemperatur (RT), um die Zellen zu pellet.
    3. Übertragen Sie den Überstand in eine neue konische Röhre. Zentrifuge bei 1.200 x g für 20 min bei RT, um apoptotische Körper zu eliminieren.
    4. Übertragen Sie den Überstand in ein 10,4 ml Polycarbonatrohr und übertragen Sie das Rohr in einen 70,1 Ti Rotor. Ultrazentrifuge bei 100.000 x g für 90 min bei 4 °C, um die EVs zu pellet.
    5. Entsorgen Sie den Überstand, und setzen Sie das Pellet, das EVs enthält, in 200 l mit gefilterter Phosphatpuffer-Saline (PBS) um 200 l von 0,20 m aus.
  2. Isolierung von Elektrofahrzeugen
    1. Erstellung der hausgemachten Kolumne für Größenausschlusschromatographie (SEC)
      1. Entleeren Sie eine Glaschromatographiesäule (Länge: 26 cm; Durchmesser: 0,6 cm) (siehe Materialtisch),waschen und sterilisieren.
      2. Platzieren Sie einen 60-mm-Filter am unteren Rand der Säule.
      3. Stapeln Sie die Säule mit vernetzter Agarose-Gel-Filtrationsbasismatrix, um eine stationäre Phase mit einem Durchmesser von 0,6 cm und einer Höhe von 20 cm zu schaffen.
      4. Spülen Sie die Phase mit 50 ml von 0,20 m gefilterten PBS. Bei 4 °C aufbewahren, falls erforderlich, später verwendet werden.
    2. Legen Sie das resuspendierte EV-Pellet auf die stationäre Phase der SEC-Säule.
    3. Sammeln Sie 20 sequentielle Brüche von 250 l, während Sie weiterhin 0,20 m gefilterte PBS oben in der stationären Phase hinzufügen, um eine Trocknung der Säule zu verhindern. Bewahren Sie die Fraktionen bei Bedarf bei -20 °C auf.
      HINWEIS: Eine längere Lagerung als eine Woche kann bei -80 °C durchgeführt werden, um die EV-Integrität für die molekulare Analyse zu erhalten.
  3. Matrixunterstützte Laser-Desorptionsionisierung (MALDI) Massenspektrometrie-Analyse der SEC-Fraktionen
    1. Fahren Sie mit der EV-Isolierung fort, wie in Abschnitt 2.2 beschrieben.
    2. Setzen Sie das EV-Pellet mit einer Peptid-Kalibriermischlösung mit 200 l aus (siehe Tabelle der Materialien).
    3. Fahren Sie mit der EV-Sammlung fort, wie in den Abschnitten 2.2.1 bis 2.2.3 beschrieben.
    4. Die Fraktion mit einem Vakuumkonzentrator vollständig trocknen.
    5. Rekonstituieren Sie die Fraktionen mit 10 l 0,1% Trifluoressigsäure (TFA).
    6. Mischen Sie 1 l rekonstituierte Fraktion mit 1 l der Matrix von '-cyano-4-hydroxycinnamic acid (HCCA) auf einer MALDI polierten Stahl-Zielplatte.
    7. Analysieren Sie alle Fraktionen mit einem MALDI-Massenspektrometer.
    8. Analysieren Sie generierte Spektren mit dedizierter Software (siehe Tabelle der Materialien).

3. Charakterisierung von Elektrofahrzeugen

  1. Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA)
    HINWEIS:     Die NTA-Analyse wird mit einem Nanopartikel-Tracking-Analyseinstrument (siehe Materialtabelle)und einer automatisierten Spritzenpumpe durchgeführt.
    1. Machen Sie eine Verdünnung (Bereich von 1:50 bis 1:500) von jedem SEC-Anteil ab Schritt 2.2.3 mit 0,20 m gefilterten PBS.
    2. Vortex die Lösung, um EV-Aggregate zu eliminieren.
    3. Die verdünnte Lösung in eine 1 ml Spritze geben und in die automatische Spritzenpumpe geben.
    4. Passen Sie die Kameraeinstellung auf Bildschirmverstärkungsstufe (3) und Kameraebene (13) an.
    5. Klicken Sie auf Ausführen und starten Sie das folgende Skript.
      1. Laden Sie die Probe in die Analysekammer (Infusionsrate: 1.000 für 15 s).
      2. Verringern und stabilisieren Sie den Geschwindigkeitsfluss für Videoaufnahmen (Infusionsrate: 25 für 15 s). Erfassen Sie drei aufeinander folgende 60 s Videos des Partikelflusses.
      3. Passen Sie den Kamerapegel (13) und den Erkennungsschwellenwert (3) vor der Videoanalyse an. Klicken Sie auf Einstellungen| Ok, um die Analyse zu starten und klicken Sie auf Exportieren, wenn die Analyse abgeschlossen ist.
    6. Zwischen jeder Bruchanalyse mit 1 ml 0,20 m gefiltertem PBS waschen.
  2. Elektronenmikroskopische (EM) Analyse
    1. Isolieren Sie Elektrofahrzeuge, wie in Abschnitt 2 beschrieben.
      HINWEIS: Sterile Bedingungen sind nicht erforderlich.
    2. Wiederholen Sie Abschnitt 3.1, um Elektrofahrzeuge zu quantifizieren.
      HINWEIS: Für die EM-Analyse werden nur positive Fraktionen verwendet.
    3. Verwenden Sie einen 50 kDa Zentrifugalfilter (siehe Materialtabelle), um EV-haltige SEC-Fraktionen zu konzentrieren.
    4. Resuspend konzentrierte Elektrofahrzeuge in 30 l mit 2% Paraformaldehyd (PFA).
    5. Laden Sie 10 l der Probe auf ein kohlenstoffbeschichtetes Kupfergitter.
    6. Inkubieren Sie für 20 min in einer nassen Umgebung.
    7. Wiederholen Sie die Schritte 3.2.5 und 3.2.6 für eine gute Absorption der Probe auf dem Raster.
    8. Übertragen Sie das Netz in einen Tropfen von 1% Glutaraldehyd in PBS für 5 min bei RT.
    9. Waschen Sie die Probe mehrmals mit Reinstwasser.
    10. Die Probe 10 min auf Eis mit einer Mischung aus 4% Uranylacetat und 2% Methylcellulose (1:9, v/v) kontrastieren. Entfernen Sie die überschüssige Mischung mit einem Filterpapier.
    11. Trocknen Sie die Probe und beobachten Sie sie unter einem Transmissionselektronenmikroskop bei 200 kV (siehe Materialtabelle).
  3. Western Blot-Analyse
    1. Proteinextraktion
      1. Wiederholen Sie die Schritte 3.2.1 bis 3.2.3, um Elektrofahrzeuge zu isolieren und zu konzentrieren.
      2. Mischen Sie 50 l RIPA-Puffer (150 mM Natriumchlorid [NaCl], 50 mM Tris, 5 mM Ethylenglykol-bis(2-Aminoethylether)-N,N,N,N-Tetraessigsäure [EGTA], 2 mM Ethylendiamin-Tetraessigsäure [EDTA], 100 mM Natriumfluorid [NaF], 10 mM Natriumpyrophosphat, 1% Nonidet P-40, 1 mM Phenylmethansulfonylfluorid [PMSF], 1x Protease-Inhibitor) mit der EV-Probe (25 l aus der EV-Konzentration auf Filter) für 5 min auf Eis, um Proteine zu extrahieren.
      3. Beschallung für 5 s (Amplitude: 500 W; Frequenz: 20 kHz), 3 mal auf Eis.
      4. Entfernen Sie vesikuläre Ablagerungen durch Zentrifugation bei 20.000 x g für 10 min bei 4 °C.
      5. Sammeln Sie den Überstand und messen Sie die Proteinkonzentration mit der Bradford Protein-Assay-Methode.
    2. Natriumdodecylsulfat Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und Western Blotting
      1. Mischen Sie Proteinextrakte (30 g) mit 5c Laemmli Probenpuffer (v/v).
      2. Die Proteinmischung auf ein 12% Polyacrylamid-Gel auftragen.
      3. Migrieren Sie die Proteine im Gel mit TGS-Puffer (25 mM Tris pH 8,5, 192 mM Glycin und 0,1% SDS), bei 70 V für 15 min und 120 V für 45 min.
      4. Übertragen Sie die Proteine 30 min mit halbtrockenem System auf die Nitrozellulosemembran.
      5. Sättigen Sie die Membran für 1 h bei RT mit Sperrpuffer (0,05% Tween 20 w/v, 5% Milchpulver w/v in 0,1 M PBS, pH 7,4).
      6. Inkubieren Sie die Membran über Nacht bei 4 °C mit monoklonalen Anti-Human-Wärmeschockprotein 90 (HSP90) Antikörper, der im Blockierpuffer (1:100) verdünnt wird.
      7. Waschen Sie die Membran dreimal mit PBS-Tween (PBS, 0,05% Tween 20 w/v) für 15 min.
      8. Inkubieren Sie die Membran für 1 h bei RT mit Ziegenmeerrettich peroxidase-konjugierte Anti-Maus-IgG-Sekundärantikörper, der im Sperrpuffer verdünnt wird (1:10.000).
        HINWEIS: Eine negative Kontrolle wird allein mit sekundärem Antikörper durchgeführt.
      9. Wiederholen Sie den Waschschritt (Schritt 3.3.2.7).
      10. Enthüllen Sie die Membran mit verbessertem Chemilumineszenz (ECL) Western Blotting Substrat Kit (siehe Tabelle der Materialien).
  4. Proteomische Analyse
    1. Proteinextraktion und In-Gel-Verdauung
      1. Wiederholen Sie die Schritte 3.2.1 bis 3.2.3, um die Elektrofahrzeuge zu isolieren und zu konzentrieren. Wiederholen Sie Schritt 3.3.1 für die Extraktion von EV-Proteinen.
      2. Führen Sie die Proteinmigration im Stapelgel eines 12% Polyacrylamid-Gels durch.
      3. Fixieren Sie die Proteine im Gel mit Coomassie blau für 20 min bei RT.
      4. Verbrauchen Sie jedes farbige Gelstück und schneiden Sie es in kleine Stücke von 1 mm3.
      5. Waschen Sie die Gelstücke sukzessive mit 300 l jeder Lösung: Reinstwasser für 15 min, 100% Acetonitril (ACN) für 15 min, 100 mM Ammoniumbicarbonat (NH4HCO3) für 15 min, ACN:100 mM NH4HCO3 (1:1, v/v) für 15 min und 100% ACN für 5 min mit kontinuierlichem Rühren.
      6. Vollständig gelen mit Vakuumkonzentrator trocknen.
      7. Führen Sie eine Proteinreduktion mit 100 l von 100 mM NH4HCO3 mit 10 mM Dithiothreitol für 1 h bei 56°C durch.
      8. Führen Sie eine Proteinalkylieation mit 100 l von 100 mM NH4HCO3 mit 50 mM Iodoacetamid für 45 min im Dunkeln bei RT durch.
      9. Waschen Sie die Gelstücke sukzessive mit 300 l jeder Lösung: 100 mM NH4HCO3 für 15 min, ACN:20 mM NH4HCO3 (1:1, v/v) für 15 min und 100% ACN für 5 min mit einem kontinuierlichen Rühren.
      10. Die Gelstücke vollständig mit einem Vakuumkonzentrator trocknen.
      11. Führen Sie die Proteinverdauung mit 50 l Trypsin (12,5 g/ml) in 20 mM NH4HCO3 über Nacht bei 37 °C durch.
      12. Extrahieren Sie die verdauten Proteine aus dem Gel mit 50 l 100% ACN für 30 min bei 37 °C und dann 15 min bei RT mit kontinuierlichem Rühren.
      13. Wiederholen Sie die folgenden Extraktionsverfahren zweimal: 50 l von 5% TFA in 20 mM NH4HCO3 Lösung für 20 min mit kontinuierlichem Rühren.
      14. Fügen Sie 100 l von 100% ACN für 10 min mit kontinuierlichem Rühren hinzu.
      15. Trockene verdaute Proteine mit einem Vakuumkonzentrator und resuspendieren in 20 l von 0,1% TFA.
      16. Die Probe mit einer 10-L-Pipettenspitze mit C18-Reverse-Phasen-Medien zur Entsalzung und Konzentration von Peptiden (siehe Materialtabelle)und Elutepeptiden mit ACN:0,1% Ameisensäure (FA) (80:20, v/v) entsalzen.
      17. Die Probe mit einem Vakuumkonzentrator vollständig trocknen und in 20 l ACN:0,1% FA (2:98, v/v) für die flüssige Chromatographie-Tandemmassenspektrometrie (LC-MS/MS) wieder aufsetzen.
    2. LC-MS/MS-Analyse
      1. Laden Sie das verdautes Peptid in das LC-MS/MS-Instrument und führen Sie eine Proben- und Datenanalyse gemäß den an anderer Stelle beschriebenen Parametern durch42.
    3. Rohdatenanalyse
      1. Verarbeiten Sie Massenspektrometriedaten, um Proteine zu identifizieren und identifizierte Proteine jeder Probe mit einem quantitativen Proteomik-Softwarepaket unter Verwendung von Standardparametern zu vergleichen.
      2. Exportieren Sie mit Hilfe von Standardparametern die Liste der exklusiven und überrepräsentierten Proteine aus EV-positiven Proben in einer Software, die Proteinnetzwerke und biologische Prozesse vorhersagt.
      3. Vergleichen Sie die Liste der identifizierten Proteine in den Fraktionen mit den Top 100 EV-Markern aus der Exocarta Open Access Datenbank (siehe Materialtabelle).

4. Funktionelle EVs Effekte Assay

  1. Neuriten-Auswuchs-Assay auf PC-12-Zelllinie
    1. Kultur PC12 Zelllinie in komplettem DMEM-Medium (2 mM L-Glutamin, 10% fetales Pferdeserum (FHS), 5% fetales Rinderserum (FBS), 100 UI/ml Penicillin, 100 g/ml Streptomycin).
      HINWEIS: Die Seren sind im gesamten Verfahren exosomefrei.
    2. Fügen Sie ein Deckglas (alle Brunnen) zu einer 24-Well-Platte; beschichten Sie die Platte mit Poly-D-Lysin (0,1 mg/ml) und Samen 260.000 Zellen/well.
    3. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C unter 5%CO2.
    4. Nach 24 h Inkubation das Medium in DMEM-Differenzierungsmedium (DMEM mit 2 mM L-Glutamin, 0,1% FHS, 100 UI/ml Penicillin, 100 g/ml Streptomycin) mit 1 x 106 Mikroglia-EVs (ab Schritt 1.1.2) ändern.
      HINWEIS: Die Kontrollbedingung wird ohne Mikroglia-Elektrofahrzeuge im Differenzierungsmedium durchgeführt.
    5. Laden Sie an Tag 4 nach der Aussaat alle Brunnen mit 100 l komplettem DMEM-Medium.
    6. Fixieren Sie die Zellen an Tag 7 nach der Aussaat mit 4% PFA für 20 min bei RT und spülen Sie dreimal (jeweils 10 min) mit PBS.
    7. Die Zellen mit rhodeminkonjugiertem Phalloidin 30 min bei 4 °C beflecken und 3 Mal (jeweils 10 min) mit PBS abspülen.
    8. Die Zellen mit verdünntem Hoechst 33342 (1:10,000) 30 min bei RT färben und 3 mal (jeweils 10 min) mit PBS ausspülen.
    9. Montieren Sie das Deckglas auf einem Dia mit fluoreszierendem Montagemedium (siehe Materialtabelle).
    10. Analysieren Sie das Dia mit einem konfokalen Mikroskop, nehmen Sie 5 zufällige Bilder von jedem Dia.
    11. Messen Sie das Neuritenwachstum mit einer automatisierten Quantifizierungssoftware (Gesamtneuritenlänge), wie an anderer Stelle ausführlich beschrieben43.
  2. Neuritenwachstum auf Rattenprimärneuronen
    1. Beschichten Sie ein 8-Well-Glasschlitten mit Poly-D-Lysin (0,1 mg/ml) und Laminin (20 g/ml).
    2. Kultur ratten kommerzielle Primärneuronen in einem geeigneten Kulturmedium (siehe Tabelle der Materialien), indem sie 50.000 Zellen pro Brunnen plattieren und die Zellen bei 37 °C unter 5%CO2 für 48 h inkubieren.
      HINWEIS: Die seren sind im gesamten Verfahren exosome-frei.
    3. Fügen Sie 1 x 106 Mikroglia-EVs zu Neuronenkulturmedium hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C unter 5%CO2 für 48 h mehr.
      HINWEIS: Kontrollzustand wird ohne Mikroglia-EVs im Neuronenkulturmedium durchgeführt.
    4. Befolgen Sie die Schritte 4.1.6 bis 4.1.9, um die Zellen zu fixieren und zu färben.
    5. Führen Sie die Schritte 4.1.10 und 4.1.11 aus, um die Folie zu analysieren.
  3. Gliom-Zellinvasion
    1. Resuspend C6 Rattengliomzellen in vollständigem DMEM-Medium (DMEM mit 10% FBS, 2 mM L-Glutamin, 1x Antibiotika) mit 5% Kollagen in einer Endkonzentration von 8.000 Zellen in 20 l.
      HINWEIS: Die seren sind im gesamten Verfahren exosome-frei.
    2. Legen Sie 5 ml PBS AT an den Boden einer 60 mm Gewebekulturschale. Invertieren Sie den Deckel und legen Sie Tropfen von 20 l (8.000 Zellen) der Zellsuspension auf den Boden des Deckels ab.
    3. Invertieren Sie den Deckel auf die PBS-gefüllte Bodenkammer und inkubieren Sie die Platte bei 37 °C und 5%CO2 für 72 h, bis Zellsphäroide gebildet werden.
    4. Fügen Sie 1 x 108 Makrophagen-EVs (ab Schritt 1.2.2) zu einem 2,2 mg/ml Kollagengemisch hinzu (2 ml Rinderkollagen-Lösung Typ I [3 mg/ml] mit 250 l mit 10x minimalem essentiellen Medium (MEM) und 500 l 0,1 m Natriumhydroxid).
      HINWEIS: Die Kontrollbedingung wird ohne Makrophagen-EVs in der Kollagenmischung durchgeführt.
    5. Verteilen Sie die Kollagenmischung mit Elektrofahrzeugen in einer 24-Well-Platte zum Einbetten von Zellsphäroiden.
    6. Implantieren Sie die neu gebildeten Zellsphäroide in der Mitte jedes Brunnens.
    7. Inkubieren Sie die Platte für 30 min bei 37°C und 5%CO2, um das Gel zu erstarren.
    8. Danach überlagern Sie 400 l komplettes DMEM-Medium auf der Kollagenmatrix in jedem Brunnen.
    9. Inkubieren Sie das komplette System für insgesamt 6 Tage bei 37 °C und 5%CO2.
      HINWEIS: Die Zellinvasion aus dem Sphäroid wird durch digitale Fotografie mit einem invertierten Lichtmikroskop mit einem 4x/0.10 N.A.-Objektiv überwacht.
    10. Erfassen Sie jeden Tag Bilder von jedem Brunnen.
    11. Verarbeiten Sie Bilder und quantifizieren Invasion von Zellsphäroid-Bereiche mit der Software, wie zuvor im Detail beschrieben42.
      HINWEIS: Invasionundundsphäride Gebiete wurden für jeden Tag zu den Invasions- und Sphäroidbereichen normalisiert, die am Tag 0 gemessen wurden.

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Ergebnisse

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Eine der größten Herausforderungen bei der Zuordnung von bioulären Vesikeln (EVs) ist die Fähigkeit, die Elektrofahrzeuge vom gesamten Kulturmedium zu isolieren. In diesem Bericht stellen wir eine Methode mit Ultrazentrifugation (UC) und Größenausschlusschromatographie (SEC) vor, die an die groß angelegte Analyse von Proteinsignaturen gekoppelt ist, um EV-Marker zu validieren und bioaktive Verbindungen zu identifizieren. Die makrophagen- oder mikroglia-abgeleiteten Elektrofahrzeuge wurden nach einer 24-h- bzw. 48-h-Kultu...

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Diskussion

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Das zentralnervöse System (ZNS) ist ein komplexes Gewebe, in dem die Zell-zu-Zell-Kommunikation normale neuronale Funktionen reguliert, die für die Homöostase30notwendig sind. Elektrofahrzeuge werden heute weithin untersucht und als wichtige molekulare Ladungen für die Zell-zu-Zell-Kommunikation beschrieben31. Sie liefern speziell einen Cocktail von Mediatoren an Empfängerzellen und beeinflussen so ihre Funktionen unter gesunden und pathologischen Bedingungen

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

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Die vorgestellte Arbeit wurde von der Ministére de L'Education Nationale, de L'Enseignement Supérieur et de la Recherche und INSERM unterstützt. Wir danken der BICeL- Campus Scientific City Facility für den Zugang zu Instrumenten und technischen Ratschlägen. Wir danken Jean-Pascal Gimeno, Soulaimane Aboulouard und Isabelle Fournier für die Unterstützung der Massenspektrometrie. Wir danken Tanina Arab, Christelle van Camp, Francoise le Marrec-Croq, Jacopo Vizioli und Pierre-Eric Sautiére für ihren starken Beitrag zu den wissenschaftlichen und technischen Entwicklungen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
12% Mini-PROTEAN  TGX Vorgefertigte ProteingeleBio-rad4561045EDU 
AcetonitrilFisher ChemicalsA955-1 
Amicon 50 kDa ZentrifugalfilterMerckUFC505024 
AmmoniumbicarbonatSigma-Aldrich9830 
HSP90 α/β Antikörper (RRID: AB_675659)Santa-cruzsc-13119 
B27 Plus BeilageGibcoA3582801 
BenchMixer V2 Vortex MixerBenchmark ScientificBV1003 
Bio-Rad Protein Assay Farbstoff-Reagenzkonzentrat (Bradford)Bio-Rad5000006 
C18 ZipTipsMerck MilliporeZTC18S096 
C6 Gliomzelle für RattenATCCATCC CCL-107 
Kanonische RöhrenSarstedt62.554.002 
ZentrifugeEppendorf5804000010 
CO2 InkubatorThermoFisher  
Konfokales Mikroskop LSM880Carl ZeissLSM880 
DeckglasMarienfeld111580 
Kulturschale (60 mm)Sarstedt82.1473 
DithiothreitolSigma-Aldrich43819 
DMEMGibco41966029 
EASY-nLC 1000 FlüssigkeitschromatographThermoFisher  
Elektronenmikroskop JEM-2100JEOL  
Ethylenglykol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-TetraessigsäureSigma-Aldrich03777-10G 
EthylendiamintetraessigsäureSigma-AldrichED-100G 
Exo-FBSOzymeEXO-FBS-50A-1Exosom depleted FBS
ExoCarta Datenbank (Top 100 Proteine von Evs)  http://www.exocarta.org/
Fötales RinderserumGibco16140071 
Fötales PferdeserumBiowestS0960-500 
Filtropur S 0.2Sarstedt83.1826.001 
Fisherbrand  Q500 Ultraschallgerät mit SondeFisherbrand12893543 
FlexAnalysisBrucker  
Fluoreszenz-EindeckmediumAgilentS3023 
AmeisensäureSigma-Aldrich695076 
Formvar-kohlenstoffbeschichtete KupfergitterAgar scientific LtdAGS162-3 
GlukoseSigma-AldrichG8769 
GlutaraldehydSigma-Aldrich340855 
Hoechst 33342Euromedex17535-AAT 
IdoacetamidSigma-AldrichI1149 
InstantBlue Coomassie Protein StainExpedeonISB1L 
Inverslichtmikroskop CKX53Olympus  
L-GlutaminGibco25030-024 
LabTek II 8 Vertiefungen  Nunc154534 
Laemmli 2xBio-Rad1610737 
LamininCorning354232 
MaxQuant Software (Software zur Identifizierung von Proteinen)  https://maxquant.net/maxquant/
MBT Polnisch stellBrucker8268711 
MEM 10xGibco21090-022 
MethylcelluloseSigma-AldrichM6385-100G 
MiliQ WasserMerck Millipore  
MilchRegilaitREGILAIT300 
Mini PROTEAN Vertikale ElektrophoresezelleBio-Rad1658000FC 
MonoP FPLC-SäuleGE Healthcare nicht mehr lieferbar
Nanosight NS300Malvern PanalyticalNS300 
NanoSight NTA-Software v3.2Malvern Panalytical  
NanoSight SpritzenpumpeMalvern Panalytical 
NeurobasalGibco21103-049 
Nitrozellulose-MembranGE Healthcare10600007 
Nonidet P-40Fluka56741 
Nunc Multidish 24 WellsThermoFisher82.1473 
ParaformaldehydElektromikroskopie Wissenschaft15713 
PC-12 ZelllinieATCCATCC CRL-1721 
Penicillin-StreptomycinGibco15140-122 
Peptid-KalibriermischungLaserBio LabsC101 
Peroxidase AffiniReine Ziege Anti-Maus IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch115-035-003 
Perseus-Software (Verarbeitung identifizierter Proteine)  https://maxquant.net/perseus/
Phalloidin-Tetramethylrhodamin-KonjugatSanta-cruzsc-362065 
PhenylmethansulfonylfluoridSigma-Aldrich78830 
Phosphatpuffer KochsalzlösungInvitrogen14190094kein Calcium, kein Magnesium
pluriStrainer M/ 60 µ mpluriSelect43-50060 
Poly-D-LysinSigma-AldrichP6407 
Zentrifugenröhrchen aus PolycarbonatBeckman Coulter355651 
Protease-InhibitorSigma-AldrichS8830-20TAB 
PureColZellsysteme5005 
Q-Exaktives MassenspektrometerThermoFisher  
rapifleX MassenspektrometerBrucker  
Kortikale Neuronen der RatteZellanwendungenR882N-20Zellherkunft : Abgeleitet aus der Großhirnrinde des embryonalen Tages 18 Sprague Dawley Rattengehirne Rattenmakrophagen
& Mikroglia-KulturmediumZellanwendungenR620K-100Zellherkunft : Normales gesundes Knochenmark
der Ratte Primäre Makrophagen der RatteZellanwendungenR8818-10a 
Primäre Mikroglia der RatteLonzaRG535 
Sepharose CL-2BGE Healthcare17014001 
Modifiziertes TrypsinPromegaV5111
SlideDustsher100204 
NatriumchloridScharlauSO0227 
NatriumdodecylsulfatSigma-AldrichL3771 
NatriumfluoridSigma-AldrichS7920-100G 
NatronlaugeScharlabSO0420005P 
NatriumpyrophosphatSigma-AldrichS6422-100G 
SpeedVac VakuumkonzentratorThermoFisher 
String-Software (funktionelle Protein-Assoziationsnetzwerke)  https://string-db.org/
SuperSignal West Dura Substrat mit verlängerter DauerThermoFisher34075 
Spritze 1,0 mLTerumo8SS01H1 
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer ZelleBio-Rad1703940 
TrifluoressigsäureSigma-AldrichT6508 
TrisInterchimUP031657 
Tris-GlycinEuromedexEU0550 
Tween 20Sigma-AldrichP2287 
UltrazentrifugeBeckman ScharA95765 
Ultrazentrifuge Rotor 70.1 TiBeckman Schar342184 
UranylacetatAgar Scientific LtdAGR1260A 
Whatman FilterpapierSigma-AldrichWHA10347510 
α-Cyano-4-hydroxyzimtsäureSigma-AldrichC2020-25G 
in Sequenzierungsqualität

Referenzen

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  1. Thion, M. S., Ginhoux, F., Garel, S. Microglia and early brain development: An intimate journey. Science. 362 (6411), 185-189 (2018).
  2. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), New York, N.Y. 841-845 (2010).
  3. Sankowski, R., Mader, S., Valdes-Ferrer, S. I. Systemic Inflammation and the Brain: Novel Roles of Genetic, Molecular, and Environmental Cues as Drivers of Neurodegeneration. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
  4. Chakrabarty, S., Kabekkodu, S. P., Singh, R. P., Thangaraj, K., Singh, K. K., Satyamoorthy, K. Microglia in health and disease. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 43 (3), 25-29 (2015).
  5. Sankowski, R., Mader, S., Valdés-Ferrer, S. I. Systemic inflammation and the brain: novel roles of genetic, molecular, and environmental cues as drivers of neurodegeneration. Frontiers in cellular neuroscience. 9, 28(2015).
  6. Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. The movers and shapers in immune privilege of the CNS. Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).
  7. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
  8. Domingues, P., et al. Tumor infiltrating immune cells in gliomas and meningiomas. Brain, Behavior, and Immunity. 53, 1-15 (2016).
  9. Hambardzumyan, D., Gutmann, D. H., Kettenmann, H. The role of microglia and macrophages in glioma maintenance and progression. Nature Neuroscience. 19 (1), 20-27 (2016).
  10. Thion, M. S., et al. Microbiome Influences Prenatal and Adult Microglia in a Sex-Specific Manner. Cell. 172 (3), 500-516 (2018).
  11. Hammond, T. R., et al. Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes. Immunity. 50 (1), 253-271 (2019).
  12. Rajendran, L., et al. Emerging Roles of Extracellular Vesicles in the Nervous System. The Journal of Neuroscience. 34 (46), 15482-15489 (2014).
  13. Gupta, A., Pulliam, L. Exosomes as mediators of neuroinflammation. Journal of Neuroinflammation. 11 (1), 68(2014).
  14. van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
  15. Budnik, V., Ruiz-cañada, C., Wendler, F. Extracellular vesicles round off communication in the nervous system. Nature Reviews Neurosciences. 17, 160-172 (2016).
  16. Raffo-Romero, A., et al. Medicinal Leech CNS as a Model for Exosome Studies in the Crosstalk between Microglia and Neurons. International Journal of Molecular Sciences. 19 (12), 4124(2018).
  17. Zhou, Y., et al. Exosomes Transfer Among Different Species Cells and Mediating miRNAs Delivery. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (12), 4267-4274 (2017).
  18. Arab, T., et al. Proteomic characterisation of leech microglia extracellular vesicles (EVs): comparison between differential ultracentrifugation and OptiprepTM density gradient isolation. Journal of extracellular vesicles. 8 (1), 1603048(2019).
  19. Murgoci, A. -N., et al. Brain-Cortex Microglia-Derived Exosomes: Nanoparticles for Glioma Therapy. ChemPhysChem. 19 (10), 1205-1214 (2018).
  20. Glebov, K., et al. Serotonin stimulates secretion of exosomes from microglia cells. Glia. 63 (4), 626-634 (2015).
  21. Hooper, C., et al. Wnt3a induces exosome secretion from primary cultured rat microglia. BMC Neuroscience. 13 (1), 144(2012).
  22. Gabrielli, M., et al. Active endocannabinoids are secreted on extracellular membrane vesicles. EMBO reports. 16 (2), 213-220 (2015).
  23. Antonucci, F., et al. Microvesicles released from microglia stimulate synaptic activity via enhanced sphingolipid metabolism. The EMBO Journal. 31 (5), 1231-1240 (2012).
  24. Frühbeis, C., Fröhlich, D., Kuo, W. P., Krämer-Albers, E. -M. Extracellular vesicles as mediators of neuron-glia communication. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 182(2013).
  25. Prada, I., et al. Glia-to-neuron transfer of miRNAs via extracellular vesicles: a new mechanism underlying inflammation-induced synaptic alterations. Acta neuropathologica. 135 (4), 529-550 (2018).
  26. Takenouchi, T., et al. Extracellular ATP induces unconventional release of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from microglial cells. Immunology Letters. 167 (2), 116-124 (2015).
  27. Yang, Y., Boza-Serrano, A., Dunning, C. J. R., Clausen, B. H., Lambertsen, K. L., Deierborg, T. Inflammation leads to distinct populations of extracellular vesicles from microglia. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 168(2018).
  28. Duhamel, M., et al. Paclitaxel Treatment and Proprotein Convertase 1/3 (PC1/3) Knockdown in Macrophages is a Promising Antiglioma Strategy as Revealed by Proteomics and Cytotoxicity Studies. Molecular & Cellular Proteomics. 17 (6), 1126-1143 (2018).
  29. Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: A novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. Journal of Neuroscience Methods. 168 (1), 134-139 (2008).
  30. Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B. Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71(2016).
  31. Rashed, M. H., et al. Exosomes: From Garbage Bins to Promising Therapeutic Targets. Int. J. Mol. Sci. Int. J. Mol. Sci. 18 (18), (2017).
  32. Yuana, Y., Sturk, A., Nieuwland, R. Extracellular vesicles in physiological and pathological conditions. Blood Reviews. 27 (1), 31-39 (2013).
  33. Frohlich, D., et al. Multifaceted effects of oligodendroglial exosomes on neurons: impact on neuronal firing rate, signal transduction and gene regulation. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1652), (2014).
  34. Krämer-Albers, E. -M., et al. Oligodendrocytes secrete exosomes containing major myelin and stress-protective proteins: Trophic support for axons. Proteomics. Clinical applications. 1 (11), 1446-1461 (2007).
  35. Verderio, C., et al. Myeloid microvesicles are a marker and therapeutic target for neuroinflammation. Annals of Neurology. 72 (4), 610-624 (2012).
  36. Prada, I., Furlan, R., Matteoli, M., Verderio, C. Classical and Unconventional Pathways of Vesicular Release in Microglia. GLIA. 61, 1003-1017 (2013).
  37. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the CNS in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  38. Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. , (2017).
  39. Kennedy, B. C., et al. Tumor-Associated Macrophages in Glioma: Friend or Foe. Journal of Oncology. 2013, 1-11 (2013).
  40. Potolicchio, I., Carven, G. J., Xu, X., Stipp, C., Riese, R. J., Stern, L. J., Santambroggio, L. Proteomic Analysis of Microglia-Derived Exosomes: Metabolic Role of the Aminopeptidase CD13 in Neuropeptide Catabolism1. The Journal of Immunology. 175, 2237-2243 (2005).
  41. Turola, E., Furlan, R., Bianco, F., Matteoli, M., Verderio, C. Microglial microvesicle secretion and intercellular signaling. Frontiers in Physiology. 3, (2012).
  42. Cocucci, E., Meldolesi, J. Ectosomes and exosomes : shedding the confusion between extracellular vesicles. Trends in Cell Biology. 25 (6), 364-372 (2015).
  43. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  44. de Vrij, J., et al. Glioblastoma-derived extracellular vesicles modify the phenotype of monocytic cells. International Journal of Cancer. 137 (7), 1630-1642 (2015).
  45. van der Vos, K. E., et al. Directly visualized glioblastoma-derived extracellular vesicles transfer RNA to microglia/macrophages in the brain. Neuro-Oncology. 18 (1), 58-69 (2016).

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Extracellular VesiclesImmune CellsUltracentrifugationSize Exclusion ChromatographyNanoparticle Tracking AnalysisWestern BlotProteomics AnalysisNeurite OutgrowthGlioma Cell InvasionMicroglia derived EVs

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