Messung von diurnalen Rhythmen in autophagischen und proteasomalen Flux

Zusammenfassung

Wir beschreiben unser Protokoll zur Messung biologischer Rhythmen im Proteinkatabolismus über Autophagie und das Proteasom in der Mausleber.

Zusammenfassung

Zellen verwenden mehrere Methoden zum Recycling unerwünschter Proteine und anderer Materialien, einschließlich lysosomaler und nicht-lysosomaler Wege. Der Hauptlysosome-abhängige Weg wird Autophagie genannt, während die primäre nicht-lysosomale Methode für Proteinkatabolismus das Ubiquitin-Proteam-System ist. Jüngste Studien an Modellorganismen deuten darauf hin, dass die Aktivität sowohl der Autophagie als auch des Ubiquitin-Proteasom-Systems nicht täglich konstant ist, sondern je nach täglichem (zirkadianem) Rhythmus variiert. Die Fähigkeit, biologische Rhythmen im Proteinumsatz zu messen, ist wichtig, um zu verstehen, wie die zelluläre Qualitätskontrolle erreicht wird, und um die Dynamik bestimmter Proteine von Interesse zu verstehen. Hier präsentieren wir ein standardisiertes Protokoll zur Quantifizierung des autophagischen und proteasomalen Flusses in vivo, das die zirkadiane Komponente des Proteinumsatzes erfasst. Unser Protokoll enthält Details zur Maushandhabung, Gewebeverarbeitung, Fraktionierung und autophagischen Flussquantifizierung mit Mausleber als Ausgangsmaterial.

Einleitung

Zirkadische Rhythmen beziehen sich auf tägliche, vorhersehbare Variationen der biologischen Funktion, die in der ganzen Natur sichtbar sind. Sie existieren auf jeder biologischen Skala, von makroskopischen Verhaltensweisen wie Schlaf-Wach-Zyklen bis hin zu molekularen Phänomenen wie der rhythmischen Fülle von Biomolekülen. In den letzten Jahren hat sich die Erforschung zirkadianer Rhythmen durch die Entdeckung von "Uhrengenen" verändert, die für die zirkadiane Rhythmuserzeugung entscheidend sind. Studien an Clock-Gen-Knockout-Mäusen haben eine zentrale Rolle für zirkadiane Rhythmen bei der zeitlichen Organisation von kernzellulären Prozessen wie Stoffwechsel

Protokoll

Das hier beschriebene Protokoll wurde von der Washington University in St. Louis Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt.

1. Mausgehäuse und experimentelles Design

1. Um tägliche Rhythmen im Proteinumsatz zu erkennen, hause Mäuse (männlich oder weiblich C57BL/6J, 4 x 8 Wochen alt, 20-25 g) unter Standard 12 h Licht/Dunkel-Zyklen mit Lebensmitteln ad libitumzur Verfügung gestellt. Um Stress zu vermeiden, können Sie Mäuse mindestens eine Woche lang in der Anlage vor der Anwendung anklimatisieren und einzelne Unterkünfte vermeiden. Um zu beweisen, dass Rhythmen im Proteinkatabolismus wirklich zirkadianer sind (d.h. ange....

Ergebnisse

Repräsentative Daten sind in Abbildung 2A,Bdargestellt, und die Quantifizierung dieser Daten ist in Abbildung 2C,D enthalten (siehe auch Zusatzdatei "Beispieldaten"). Der Einfachheit halber haben wir die Ladesteuerungen in Abbildung 2 nicht dargestellt, aber diese sollten parallel erhalten werden. Typischerweise werden zu diesem Zweck westliche Flecken gegen das -Actin verwendet, ab.......

Diskussion

Unser Protokoll beschreibt ein technisch unkompliziertes Mittel zur Messung biologischer Rhythmen im Proteinumsatz von Mäusen mit allgemein verfügbaren molekularbiologischen Geräten. Aufgrund der Länge der Zeitreihenexperimente und der Anzahl der beteiligten biologischen Proben ist es wichtig, während des gesamten Experiments konsistent zu sein, wie die Mäuse injiziert werden, den Zeitpunkt der Gewebeaufnahme und die biochemische Verarbeitung von Proben. Die Injektions-, Euthanasie- und Zervixdislokationsschritte können .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
4x SDS PAGE Probenpuffer	Invitrogen	Cat# NP0008
Bortezomib	EMD Millipore	Cat# 5.04314.0001; CAS: 179324-69-7
Image Studio	LICOR	N/A
Immobilon-FL PVDF-Membran 0,45 Mikron	Merck Millipore Ltd	Cat# IPFL00010
K48-Kopplung spezifisches Polyubiquitin (D9D5) Kaninchen mAb	Zellsignaltechnologie	Cat#8081S; RRID:AB_10859893
LC3a	Boston Biochem	Cat# UL-430
LC3b Antikörper	Novus	Cat#NB100-2220; RRID:AB_10003146
LC3b	Antikörper-Zellsignaltechnologie	Kat#2775; RRID:AB_915950
Leupeptin	Sigma	Kat# L2884; CAS: 103476-89-7
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels	Thermo Fisher Scientific	Cat# WG1403BOX
NuPAGE LDS Probenpuffer (4x)	Thermo Fisher Scientific	Cat# NP0007
P62-his	Novus	Cat# NBP1-44490
Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards	Bio-Rad	Cat# 1610373
Kaninchen Anti-P62/SQSTM1	Millipore-Sigma	Kat#P0067; RRID:AB_1841064
rhPoly-Ub WT (2-7) (K48)	Boston Biochem	Cat# UC-230
SDS-PAGE Midi-Size Gels	Invitrogen	Cat# WG1403
SIGMAFAST Proteasehemmer Tabletten	Millipore-Sigma	Cat# S8830