Method Article

Generierung von ventrikulären HiPSC-abgeleiteten Cardiomyozyten und hochwertigen Zellpräparaten für die Calciumhandling-Charakterisierung

DOI:

10.3791/60135

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January 17th, 2020

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1Cardiovascular Research Center, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

In This Article

Summary

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Hier beschreiben und validieren wir eine Methode, um konsequent robuste humaninduzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten zu erzeugen und ihre Funktion zu charakterisieren. Diese Techniken können bei der Entwicklung mechanistischer Einblicke in Signalwege helfen, eine Plattform für groß angelegte Arzneimittelscreenings bieten und Herzkrankheiten zuverlässig modellieren.

Abstract

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Humaninduzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten (iPSC-CMs) stellen eine wertvolle menschliche Quelle für die Untersuchung der grundlegenden Wissenschaft der Kalzium - Ca2+Handhabungs- und Signalwege sowie Hochdurchsatz-Medikamentenscreening und Toxizitätstests. Hierin bieten wir eine detaillierte Beschreibung der Methoden zur Erzeugung hochwertiger iPSC-CMs, die molekulare und funktionelle Eigenschaften über verschiedene Zelllinien hinweg konsistent reproduzieren können. Darüber hinaus wird eine Methode beschrieben, um ihre funktionelle Charakterisierung durch die Bewertung der Ca2+-Handlingeigenschaften zuverlässig zu bewerten. Niedrige Sauerstoffwerte (O2), Laktatauswahl und längere Kulturzeit erzeugen hochreine und hochwertige ventrikuläre Kardiomyozyten. Ähnlich wie isolierte adulte Rattenkardiomyozyten (ARCMs) weisen 3 Monate alte iPSC-CMs eine höhere Ca 2+-Amplitude, eine schnellere Aufnahmerate von Ca2+ (Decay-Tau) und eine positive lusidrope Reaktion auf die adrenerge Stimulation im Vergleich zu Tag 30 iPSC-CMs auf. Die Strategie ist technisch einfach, kostengünstig und reproduzierbar. Es bietet eine robuste Plattform, um Herzerkrankungen zu modellieren und für das groß angelegte Arzneimittelscreening, um Ca2+ umgangen von Proteinen zu zielen.

Introduction

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Humaninduzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten (iPSC-CMs) sind eine attraktive menschliche Plattform, um eine Vielzahl von Herzerkrankungen in vitro1,2,3,4,5,6,7,8zu modellieren. Darüber hinaus können iPSC-CMs für die Vorhersage von Patientenreaktionen auf neuartige oder bestehende Medikamente verwendet werden, um Trefferverbindungen zu überprüfen und neue personalisierte Medikamente z....

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Protocol

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Die Experimente mit erwachsenen Rattenkardiomyozyten in dieser Studie wurden mit zugelassenen Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Protokollen der Icahn School of Medicine am Berg Sinai durchgeführt. Die erwachsenen Rattenkardiomyozyten wurden von Sprague Dawley Rattenherzen nach der Langendorff-basierten Methode, wie zuvor beschrieben16,isoliert.

1. Vorbereitung der Medien

  1. Bereiten Sie hiPSC-Medien vor.
    1. Gleichgewichten Sie die Ergänzung und das Basalmedium auf Raumtemperatur (RT). Stellen Sie sicher, dass die Ergänzung vollständig aufgetaut hat. Mischen Sie 400 ml des Basalmediums un....

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Results

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Das in Abbildung 1A beschriebene Protokoll erzeugte hochreine Kardiomyozyten, die mit der Zeit in der Kultur einen ventrikulären/erwachsenen-ähnlichen Phänotyp erwerben. Wie durch Immunfluoreszenzfärbung für die atrialen und ventrikulären Myosin-Regulatorischen Lichtketten-2-Isoformen (MLC2A bzw. MLC2V) beurteilt, war die Mehrheit der durch dieses Protokoll erzeugten Zellen mlC2A-positiv an Tag 30 nach Induktion der herzkargen Differenzierung, während MLC2V in viel niedriger.......

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Discussion

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Kritische Schritte für die Verwendung menschlicher iPSC-CMs als experimentelle Modelle sind: 1) Erzeugung hochwertiger Kardiomyozyten (CMs), die die konsistente Leistung und reproduzierbare Ergebnisse gewährleisten können; 2) die Zellen in kulturreif für mindestens 90 Tage reifen lassen, um ihren Phänotyp angemessen zu bewerten; 3) Durchführung elektrophysiologischer Untersuchungen, z. B. transiente Kalziummessungen (Ca2+),um eine physiologisch relevante funktionelle Charakterisierung menschlicher iPSC-CMs zu .......

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgements

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Diese Forschung wurde durch den AHA Scientist Development Grant 17SDG33700093 (F.S.) unterstützt; Mount Sinai KL2 Scholars Award for Clinical and Translational Research Career Development KL2TR001435 (F.S.); NIH R00 HL116645 und AHA 18TPA34170460 (C.K.).

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-Aktin, α-Antikörper der glatten Muskulatur, Maus monoklonalSigma AldrichA5228
Alexa Fluor 488 Ziege Anti MausInvitrogenA11001
Alexa Fluor 555 Ziege Anti KaninchenInvitrogenA21428
B27 SupplementGibco17504-044
B27(-) Insulin SupplementGibcoA18956-01
CHIR-99021SelleckchemS2924
DAPI NuklearfärbungThermoFisherD1306
DMEM/F12 (1:1) (1X) + L-Glutamin + 15mM HepesGibco11330-032
Double Ended Cell Lifter, Flat Blade und J-HookCelltreat229306
Falcon Multiwell Tissue Culture Plate, 6 WellCorning353046
Fluidische Inline-Heizungfür lebende ZellenIL-H-10
Fura-2, AMInvitrogenF1221
hESC-qualifizierte MatrixCorning354277Matrigel Matrix
hPSC-MedienGibcoA33493-01StemFlex Basalmedium
IWR-1Sigma AldrichI0161
Bildgebungskammer für lebende ZellenLebendzellinstrumentEC-B25
MLC-2A, monoklonale Maus-AntikörperSynaptische Systeme311011
Myozyten-Calcium- und KontraktilitätssystemIonoptixISW-400
Myosin-Leichtketten-2-Antikörper, Kaninchen polyklonal (MLC2V)Proteintech10906-1-AP
Nalgene Rapid Flow Sterile Einwegfiltereinheiten mit PES-MembranThermoFisher124-0045
PBS mit Calcium und MagnesiumCorning21-030-CV
PBS ohne Calcium und MagensiumCorning21-031-CV
Premium Glas DeckgläserLab Scientific7807
RPMI medium 1640 (-) D-Glukose (1X)Gibco11879-020
RPMI medium 1640 (1X)Gibco11875-093
Natrium-L-LactatSigma AldrichL7022
StemFlex SupplementGibcoA33492-01
ThiazovivinTocris3845
Trypsin-EDTA (0,25%)ThermoFisher25200056
Tyrode's LösungBoston BioproductsBSS-355wStellen Sie den pH-Wert auf 7,2 ein. Fügen Sie 1,2 mM Calciumchlorid hinzu
Instrument

References

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  1. Karakikes, I., et al. Correction of human phospholamban R14del mutation associated with cardiomyopathy using targeted nucleases and combination therapy. Nature Communications. 6, 6955(2015).
  2. Moretti, A., et al.

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Ventricular Like CardiomyocytesiPSC Derived CardiomyocytesCalcium Handling CharacterizationLow Oxygen ConditionsLactate SelectionFlow Cytometric QuantificationFura 2 AM StainingTyrode s Solution PerfusionMLC2 Isoform ExpressionCardiac Differentiation Protocol

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