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Methodenartikel

Optimierte Griess-Reaktion für UV-Vis und Nacktaugenbestimmung von Anti-Malaria-Primaquin

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DOI:

10.3791/60136

⸱

11. Oktober 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Tropical Medicine, Guangzhou University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige kolorimetrische Methode zum Nachweis von Malaria-Primärquin (PMQ) in synthetischen Urinen und menschlichen Seren.

Zusammenfassung

Primaquine (PMQ), ein wichtiges Malariamedikament, wurde von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) zur Behandlung lebensbedrohlicher Infektionen durch P. vivax und ovaleempfohlen. PMQ hat jedoch unerwünschte Nebenwirkungen, die bei Patienten mit Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase-Mangel (G6PD) zu einer akuten Hämolyse führen. Es ist notwendig, einfache und zuverlässige Methoden für die PMQ-Bestimmung mit dem Zweck der Dosierungsüberwachung zu entwickeln. Anfang 2019 haben wir einen UV-Vis- und Nacktaugen-basierten Ansatz für die kolorimetrische PMQ-Quantifizierung gemeldet. Die Detektion beruhte auf einer Griess-ähnlichen Reaktion zwischen PMQ und Anilines, die farbige Azoprodukte erzeugen kann. Die Nachweisgrenze für die direkte Messung von PMQ im synthetischen Urin liegt im Nanomolarbereich. Darüber hinaus hat diese Methode ein großes Potenzial für die PMQ-Quantifizierung aus menschlichen Serumproben in klinisch relevanten Konzentrationen gezeigt. In diesem Protokoll werden wir die technischen Details über die Synthesen und Charakterisierung von farbigen Azoprodukten, die Reagenzzubereitung und die Verfahren zur PMQ-Bestimmung beschreiben.

Einleitung

PMQ ist eines der wichtigsten Malariamedikamente, es wirkt nicht nur als Gewebeschizontozid, um einen Rückfall zu verhindern, sondern auch als Gametozytozid zur Unterbrechung der Krankheitsübertragung1,2,3,4. Intravaskuläre Hämolyse ist eine der bezugsgemäßen Nebenwirkungen von PMQ, die bei G6PD-Defiziten äußerst schwerwiegend wird. Es ist bekannt, dass die genetische Erkrankung G6PD weltweit mit einer Genhäufigkeit zwischen 3-30% in endemischen Malariagebieten verteilt wird. Der Schweregrad der PMQ-Schwäche hängt vom Grad des G6PD-Mangels sowie der Dosis und der Dauer der PMQ-Exposition5,6ab. Um das Risiko zu senken, hat die WHO eine einzelne niedrige Dosis (0,25 mg Base/kg) PMQ für die Malariabehandlung empfohlen. Dies wird jedoch immer noch durch die Variationen der Patientenarzneimittelempfindlichkeitin Fragegestellt 5,7. Dosisüberwachung ist notwendig, um die Pharmakokinetik nach der PMQ-Verabreichung zu bewerten, die Dosierungsanpassung für eine erfolgreiche Behandlung mit begrenzter Toxizität bewirken kann.

Die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) ist die am weitesten verbreitete Technik zur klinischen PMQ-Bestimmung. Endoh et al. berichteten über ein HPLC-System mit einem UV-Detektor zur Serum-PMQ-Quantifizierung mit einer C-18-Polymer-Gelsäule8. In ihrem System wurden Serumproteine zuerst mit Acetonitril ausgefällt, und dann wurde der PMQ im Überstand für HPLC getrennt. Die Kalibrierkurve war linear über den Konzentrationsbereich von 0,01-1,0 g/ml8. Für die Quantifizierung von PMQ und seinen Hauptmetaboliten9wurde eine weitere Methode auf Basis einer Reverse-Phase-HPLC mit UV-Erkennung bei 254 nm berichtet. Die Kalibrierkurve für PMQ lag linear im Bereich zwischen 0,025-100 g/ml. Für die PMQ-Trennung wurde eine zusätzliche flüssigkeits-flüssige Extraktion mit gemischtem Hexan und Ethylacetat als organische Phase verwendet, wobei die prozentuale Rückgewinnung bis zu 89%9erreicht wurde. In jüngerer Zeit haben Miranda et al. ein UPLC-Verfahren mit UV-Detektion bei 260 nm für die PMQ-Analyse in Tablettenformulierungen mit einer Nachweisgrenze von 3 g/ml10entwickelt.

Obwohl HPLC-Methoden eine vielversprechende Empfindlichkeit bei der Wirkstoffbestimmung aufweisen und die Empfindlichkeit weiter verbessert werden kann, wenn das HPLC mit einem Massenspektrometer ausgestattet ist, gibt es noch einige Nachteile. Direkte Arzneimittelmessungen in biologischen Flüssigkeiten sind von HPLC in der Regel unzugänglich, da viele Biomoleküle die Analyse stark beeinflussen können. Zusätzliche Extraktionen sind erforderlich, um endogene Moleküle vor der HPLC-Analyse zu entfernen11,12. Darüber hinaus wird die PMQ-Erkennung durch einen HPLC-UV-Detektor in der Regel bei seiner maximalen Absorptionswellenlänge (260 nm) durchgeführt;; Es gibt jedoch viele endogene Moleküle in biologischen Flüssigkeiten mit einer starken Absorption bei 260 nm (z. B. Aminosäuren, Vitamine, Nukleinsäuren und Urochrompigmente), wodurch der PMQ-UV-Nachweis beeinträchtigt wird. Es ist notwendig, einfache und kostengünstige Methoden für die PMQ-Bestimmung mit angemessener Empfindlichkeit und Selektivität zu entwickeln.

Die Griess-Reaktion wurde erstmals 1879 als kolorimetrischer Test zur Nitritdetektion13,14,15,16vorgestellt. Kürzlich wurde diese Reaktion ausgiebig erforscht, um nicht nur Nitrit, sondern auch andere biologisch relevante Moleküle17,18,19,20zu erkennen. Wir haben bereits über die erste systematische Studie einer unerwarteten Griess-Reaktion mit PMQ berichtet (Abbildung 1). In diesem System ist PMQ in der Lage, farbige Azos zu bilden, wenn es mit substituierten Anilines in Gegenwart von Nitritionen unter sauren Bedingungen gekoppelt ist. Wir haben weiter festgestellt, dass die Farbe von Azos von gelb bis blau variierte, wenn die Elektronen-Donier-Wirkung des Substituenten auf anilines21erhöht wurde. Durch die optimierte Reaktion zwischen 4-Methoxyaniline und PMQ wurde eine auf UV-Vis-Absorption basierende kolorimetrische Methode zur PMQ-Quantifizierung entwickelt. Diese Methode hat ein großes Potenzial für den empfindlichen und selektiven Nachweis von PMQ in biorelevanten Flüssigkeiten gezeigt. Hier wollen wir die detaillierten Verfahren für die PMQ-Bestimmung auf der Grundlage dieser kolorimetrischen Strategie beschreiben.

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Protokoll

1. Synthese von farbigen Azoen

  1. In einem 25 ml runden Bodenkolben (RBF) Anilin (0,1 mmol) und Primaquinbisphosphat (45,5 mg, 0,1 mmol) in 10 mlH3PO4 Lösung (5% v/v) auflösen. Legen Sie den RBF auf ein Eisbad, fügen Sie eine Rührstange mit der richtigen Größe in die Lösung ein und legen Sie den RBF auf eine Rührplatte.
    HINWEIS: Für die Synthese von Azo 3g (Abbildung 2) verwenden Sie 0,2 mmol Primaquinbisphosphat.
  2. NaNO2 (6,9 mg, 0,1 mmol) in 1 ml gekühltem Wasser auflösen und dann tropfenweise in das Reaktionsgemisch geben. Entfernen Sie das Eisbad, und halten Sie die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur gerührt.
  3. Überwachen Sie die Reaktion mit einer Mitglasgel-beschichteten Dünnschichtchromatographie (TLC) Platte. Verwenden Sie ein Dichlormethan -gemisch (DCM)/Methanol (MeOH) (vol/vol = 5:1) als Eluent für TLC. Das Azo-Produkt weist farbige Flecken auf der TLC-Platte auf, die sich leicht durch nackte Augen unterscheiden lässt. Beenden Sie die Reaktion, wenn die PMQ-Spots auf TLC verschwinden.
  4. Stellen Sie die Reaktionsmischung auf pH >10 von NaOH (2 M) auf einem Eisbad ein. Verwenden Sie einen 50 ml Trenntrichter, um das Gemisch 3 mal mit 20 ml Ethylacetat für jeweils zu extrahieren, die organische Phase unter Vakuum mit einem Rotationsverdampfer zu kombinieren und zu konzentrieren.
    HINWEIS: Passen Sie vor der Extraktion den pH-Wert von Reaktionslösungen über 10 an. Dies kann das primäre Amin als seine nicht-ionisierte Form beibehalten, wodurch die Extraktion erleichtert wird.
  5. Reinigen Sie die Rückstände durch Blitzchromatographie mit Reverse-Phase-Kieselgel unter Normaldruck, wobei MeOH/H2 O als Eluent verwendet wird. Trocknen Sie die Produktlösung durch Lyophilisierung, um gewünschte Azoprodukte zu erhalten.
    HINWEIS: Die gleiche Reaktion kann auch in verdünnten HCl-Lösungen (0,2 M) durchgeführt werden.

2. UV-Vis-Messungen und theoretische Berechnung

  1. Reiner Azo (50 m) in destilliertem Wasser bzw. in 5%H3PO4 Lösung (pH 1,1) auflösen. Erfassen Sie UV-Vis-Absorptionsspektren (250-700 nm) auf einem Spektralphotometer bei Raumtemperatur (25 °C). Exportieren Sie die Daten zur weiteren Analyse als .xls/.xlsx-Dateien.
  2. Führen Sie alle theoretischen Berechnungen für PMQ selbst und Azo-Produkte mit dem Gaussian 16 Programm durch. Verwenden Sie die zeitabhängige Dichtefunktionstheorie (TD-DFT) mit einem 6-31G-Basissatz. Fügen Sie Lösungsmitteleffekte durch polarisierbaren Kontinuumsmodell (PCM)-Formalismus mit Wasser ein.
    1. Verwenden Sie Software (z. B. Chemdraw Office), um die Strukturen zu zeichnen und dann die Struktur als Gaußsche Eingabedatei (.gif) zu speichern.
    2. Öffnen Sie die GIF-Datei mit Gauß Ansicht und klicken Sie auf die Schaltfläche Berechnen. Wählen Sie Gaussian Calculation Setup, Opt+Freqund ground state-DFT-B3LYP-6-31G; klicken Sie dann auf Senden. Die Geometrieoptimierung generiert eine .log-Datei.
    3. Verwenden Sie das obige Verfahren, um diese Protokolldatei zu öffnen. Klicken Sie auf Calculate-Gaussian Calculation Setup and select energy and TD-SCF-DFT-B3LYP-6-31G-Singlet only. Dann senden. Bei der Energieberechnung wird eine weitere Protokolldatei und eine Cubedatei generiert.
    4. Verwenden Sie Gaußansicht, um die Protokolldatei aus der Energieberechnung zu öffnen. Klicken Sie auf Ergebnisse-UV/Vis, um die vorhergesagte Absorption anzuzeigen.
    5. Verwenden Sie Gaußansicht, um die Cubedatei zu öffnen. Klicken Sie auf Ergebniss, und wählen Sie Flächen- und Konturlinien-Oberflächenaktionen und neue Oberfläche aus, um die Umlaufbahnen anzuzeigen.
  3. Vergleichen Sie die Ergebnisse sowohl der experimentellen Messung als auch der Gaußschen Berechnung. Berechnen Sie den Prozentfehler zwischen den berechneten und den gemessenen Werten gemäß der folgenden Gleichung.
                  Fehler = | (Wmax cal.-Wmaxexper.) / Wmaxexper. | • 100%
    wobei Wmax cal. die maximale Absorptionswellenlänge aus theoretischer Berechnung und Wmax exper darstellt. stellt die Wellenlänge des experimentellen Ergebnisses dar.

3. PMQ-Bestimmung

  1. PMQ-Messung mit einer 96-Well-Platte (Abbildung 5)
    1. 4-Methoxyaniin in 0,2 M HCl für eine 200 mM Aniinlösung, R1, auflösen. Natriumnitrit in destilliertem Wasser auflösen, um eine 5 mM Lösung, R2, zu erhalten. Halten Sie alle Lösungen vor Gebrauch bei 4 °C im Kühlschrank auf.
    2. Fügen Sie 100 l R1 in eine 96-Well-Platte und fügen Sie 50 l PMQ enthaltende Probe in die Platte, um sie mit R1 zu mischen. Fügen Sie dann 50 l R2 in die Platte ein. Mischen Sie die Lösungen durch wiederholtepipetieren.
    3. Halten Sie die Platte 15 min bei Raumtemperatur auf und notieren Sie dann die UV-Vis-Absorption bei 504 nm. Wiederholen Sie 3x für jeden Test.  Das Azo-Produkt ist stabil mit Raumlichtbelichtung; es ist nicht notwendig, die Platte unter Dunkel zu halten.
    4. Exportieren Sie die Daten zur weiteren Analyse als .xls/.xlsx-Dateien.
  2. Kalibrierkurve zur direkten PMQ-Messung in einer Urinprobe
    1. Bereiten Sie PMQ-Lösungen mit synthetischem Urin mit PMQ-Konzentrationen bei 0, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200 m vor.
    2. Fügen Sie 100 l R1 in eine 96-Well-Platte und fügen Sie 50 l PMQ-Urinlösung hinzu, um sie mit R1 zu mischen. Fügen Sie dann 50 l R2 in die obige Mischung ein. Mischen Sie die Lösungen durch wiederholtepipetieren. Halten Sie die Platte 15 min bei Raumtemperatur auf und notieren Sie dann die UV-Vis-Absorption bei 504 nm.
    3. Generieren Sie eine Kalibrierkurve basierend auf der Absorptions- undPMQ-Konzentration. Verwenden Sie die Werte aus den Brunnen ohne PMQ als Leerzeichen, und subtrahieren Sie die leeren Werte von allen Tests vor der Datenverarbeitung.
    4. Führen Sie eine lineare Anpassung aus, um die linearen Gleichungen als Y = aX+bzu erzeugen, wobei Y die Absorptionsintensität bei 504 nm, X die Konzentration von PMQ, a die Steigung und b der y-Abschnitt der linearen Linie ist.
  3. Kalibrierkurve zur direkten PMQ-Messung in einer menschlichen Serumprobe
    1. Bereiten Sie PMQ-Lösungen mit humanem Serum mit PMQ-Konzentrationen bei 0, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, m vor.
    2. Fügen Sie 100 l R1 in eine 96-Well-Platte und fügen Sie 50 l PMQ-Serumlösung hinzu, um sie mit R1 zu mischen. Fügen Sie der oben genannten Mischung 50 l R2 hinzu und mischen Sie die Lösungen durch wiederholtes Pipettieren. Halten Sie die Platte 15 min bei Raumtemperatur und notieren Sie dann die UV-Vis-Absorption bei 504 nm. Exportieren Sie die Daten zur weiteren Analyse als .xls/.xlsx-Datei.
    3. Generieren Sie eine Kalibrierkurve basierend auf der Absorptions- undPMQ-Konzentration. Verwenden Sie die Werte aus den Brunnen ohne PMQ als Leerzeichen, und subtrahieren Sie die leeren Werte von allen Tests vor der Datenverarbeitung.
    4. Führen Sie eine lineare Anpassung aus, um die linearen Gleichungen als Y = aX+bzu erzeugen, wobei Y die Absorptionsintensität bei 504 nm, X die Konzentration von PMQ, a die Steigung und b der y-Abschnitt der linearen Linie ist.
  4. PMQ-Extraktion aus Serum
    1. Fügen Sie eine bestimmte Menge an PMQ in das menschliche Serum ein, um PMQ-haltiges Serum zu simulieren. Zur PMQ-Extraktion 6 ml Mischung aus Ethylacetat/Hexan (7:1 v/v) in 2 ml PMQ-haltiges Serum in einem 15 ml Zentrifugenrohr geben.
    2. Fügen Sie dem Extraktionssystem 100 l Natriumhydroxid (2 M) Lösung hinzu. Schütteln Sie das Rohr mit einem Wirbelmischer 30 s. Sammeln Sie die organische Schicht und konzentrieren Sie sie mit einem Rotationsverdampfer unter Vakuum.
    3. Lösen Sie den Rückstand mit 200 l destilliertem Wasser auf und entfernen Sie unlösliche Lipidkomponenten durch Filtration durch eine scheibenförmige Membran mit 220 nm Porengröße. Verwenden Sie die endgültige Lösung für den Test.
  5. PMQ aus dem Serum mit Extraktion bestimmen
    1. Befolgen Sie die Schritte 3.2 oder 3.3, um die Kalibrierkurve für PMQ in destilliertem Wasser zu generieren. Extrahieren Sie PMQ aus PMQ-haltigen Seren nach Schritt 3.4.
    2. Fügen Sie 100 l R1 und 50 l PMQ-Lösung in eine 96-Well-Platte ein. Fügen Sie 50 l R2 zu oben Gemisch hinzu und mischen Sie die Lösungen durch wiederholtes Pipettieren.
    3. Halten Sie die Platte 15 min bei Raumtemperatur und notieren Sie die UV-Vis-Absorption bei 504 nm. Verwenden Sie die Bohrungen mit R1 und R2, aber ohne PMQ als Steuerung. Exportieren Sie die Daten zur weiteren Analyse als .xls/.xlsx-Dateien.
    4. Subtrahieren Sie die Regelwerte von den Absorptionswerten I504 für jeden Test, und verwenden Sie dann das Ergebnis für Konzentrationsberechnungen gemäß der Linergleichung aus der Kalibrierkurve.
      HINWEIS: Die Nachweisgrenze (LOD) für PMQ kann in allen Fällen nach einer Standardmethode22berechnet werden. Die Berechnung basierte auf der Kalibrierfunktion: LOD = 3,3 x SD/b, wobei SD die Standardabweichung des Rohlings und b die Steigung der Regressionslinie ist

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Ergebnisse

Zur Optimierung der Reaktionsbedingungen (Abbildung 2) wurden verschiedene Aniline verwendet, um pmQ durch die Griess-Reaktion zu koppeln. Wir haben eine Reihe von Azos mit verschiedenen Farben erreicht. Es wurde festgestellt, dass Anilines mit einem Elektronen-Stifter-Substituenten eine Rotverschiebung im UV-Vis-Absorptionsspektrum verursachen können. Theoretische Berechnungen wurden durch zeitabhängige Dichtefunktionstheorie (TD-DFT) durchgeführt. Wie in Abbildung 2A

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Diskussion

Wir beschrieben eine kolorimetrische Methode für die bequeme PMQ-Quantifizierung. Es ist potenziell die einfachste und kostengünstigste aktuelle Methode. Noch wichtiger ist, dass diese Methode eine PMQ-Messung mit bloßen Augen ohne Verwendung von Geräten ermöglicht.

Die optimierte Griess-Reaktion zur PMQ-Erkennung kann einen roten Azo mit einer maximalen Absorption von 504 nm erzeugen. Der potenzielle Einfluss der UV-Vis-Absorption endogener Biomoleküle ist begrenzt, so dass das Verfahren für ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu erklären.

Danksagungen

Die Autoren würdigen den Start-Up Grant der Guangzhou University of Chinese Medicine und das Jugendwissenschaftliche Forschungstrainingsprojekt gZUCM (2019QNPY06). Wir würdigen auch das Lingnan Medical Research Center der Guangzhou University of Chinese Medicine für die Unterstützung von Einrichtungen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
4-MethoxyanilinAladdinK1709027
2,4-DimethoxyanilinHeowns10154207
3,4-DimethoxyanilinBidepharmBD21914
4-MethylanilinAdamas-betaP1414526
4-NitroanilinMacklinC10191447
96-Wells, Flat BottonLabserv
Gaussian@16 SoftwareGaussian, IncVersion:x86-64 SSE4_2-fähig/Linux
SalzsäureGCRF20180902
Marvin Sketch (Software)CHEMAXONkostenlose Ausgabe: 15.6.29
PhosphorsäureMacklinC10112815
Primaquinbisiphosphat3A Chemikalien
NatriumnitritAlfa Aesar5006K18R
SulfonamideTCI (shanghai)GCPLO-BP
Varioskan LUX PlattenleserThermo FisherLieferung mit SkanIt Software 4.1
310109008CEBK200054

Referenzen

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