Hier stellen wir ein immunhistochemisches Testprotokoll zum Nachweis von Tollwutvirus-Antigen als alternativen diagnostischen Test für formalinfixierte Gewebe vor.
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Methodenartikel
Immunhistochemischer Test für den Lyssavirus-Antigennachweis aus formalinfixierten Geweben
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Eine der primären diagnostischen Modalitäten für Tollwut ist der Nachweis des viralen Ribonukleoprotein (RNP) -Komplexes (Antigen) in den infizierten Gewebeproben. Während der direkte fluoreszierende Antikörpertest (DFA) oder der direkte immunhistochemische Schnelltest (DRIT) am häufigsten für den Antigennachweis verwendet werden, benötigen beide Tests frisches und / oder gefrorenes Gewebe für Abdrücke auf Objektträgern vor dem Antigennachweis mit Antikörpern. Wenn Proben gesammelt und in Formalin fixiert werden, ist keiner der Tests optimal für den Antigennachweis, jedoch können Tests durch konventionelle Immunhistochemie (IHC) nach Einbettung in Paraffinblöcke und Schnitte durchgeführt werden. Bei dieser IHC-Methode werden Gewebe mit Anti-Tollwut-Antikörpern gefärbt, Abschnitte deparaffiniert, Antigene durch partielle Proteolyse oder andere Methoden entnommen und mit primären und sekundären Antikörpern inkubiert. Antigene werden mit Meerrettichperoxidase / Aminoethylcarboxazol gefärbt und mit Hämatoxylin für die Visualisierung mit einem Lichtmikroskop gegengefärbt. Neben dem spezifischen Antigennachweis bietet die Formalinfixierung weitere Vorteile wie die Bestimmung histologischer Veränderungen, entspannte Bedingungen für die Lagerung und den Transport von Proben (unter Umgebungstemperaturen), die Möglichkeit, retrospektive Fälle zu testen und die biologische Sicherheit durch die Inaktivierung von Infektionserregern zu verbessern.
Einleitung
Tollwut ist eine akute progressive Enzephalitis, die durch die RNA-Viren des negativen Sinnes der Gattung Lyssavirus1verursacht wird. Fast 99% aller todesfälle beim Menschen, die durch die Infektion mit dem Tollwutvirus (RABV), dem Typmitglied der Gattung, verursacht werden, werden von Hunden übertragen2. Die Tollwutdiagnose verdächtiger Tiere beruht auf dem Nachweis von Antigen (hauptsächlich viral kodiertes Nukleoprotein, N-Protein) im Komplex mit genomischer RNA (Ribonukleoproteinkomplex, RNP) im Hirngewebe3. Der Antigennachweis durch den direkt fluoreszierenden Antikörpertest (DFA) gilt als Go....
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Protokoll
Während das IHC-Protokoll an formalinfixierten Geweben durchgeführt wurde, die RABV inaktivieren, falls vorhanden, sollten geeignete Biosicherheitsprotokolle ordnungsgemäß befolgt werden. Alle Biosicherheitsverfahren sind in der Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) 5th Edition (https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm) beschrieben, einschließlich des Tragens geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PSA) und der Impfpflicht wie beschrieben12. Darüber hinaus sollte die ordnungsgemäße Eindämmung und Handhabung gefährlicher Chemikalien (wie Formalin, AEC und Xylol) (z. B. Abzüge) befolgt werden.
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Ergebnisse
Abbildung 2 zeigt repräsentative IHC-Färbeergebnisse von Positiv- und Negativkontrollproben in verschiedenen getesteten Hirngeweben. Abbildung 2A,D,G stellen positive Proben mit 200x dar, während Abbildung 2B,E,H jeweils einer 400-fachen Vergrößerung entsprechen. Abbildung 2A-C entsprechen dem Hirnstamm;
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Diskussion
Aufgrund der hohen Sterblichkeitsrate der Tollwut nach Symptombeginn ist die Diagnose verdächtiger Tiere für eine RABV-Infektion äußerst kritisch für eine angemessene prophylaktische Behandlung nach der Exposition. Die Tollwutdiagnose hängt in erster Linie von DFA-, DRIT- und PCR-basierten Techniken mit frischem oder gefrorenem Gewebe ab. Für die Untersuchung von formalinfixiertem Gewebe bietet der IHC-Test eine alternative Methode zum sensitiven und spezifischen Nachweis von RABV-Antigen. Während die in Formalin fixiert.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Danksagungen
Wir danken den Arbeitern, Epidemiologen und Verbundenen der Gesundheitsbehörden für die Probeneinreichungen an die Zentren für Krankheitskontrolle und Prävention. Die Ergebnisse und Schlussfolgerungen in diesem Bericht sind die der Autoren und stellen nicht unbedingt die offizielle Position der Zentren für Krankheitskontrolle und Prävention dar. Die Verwendung von Handelsnamen und kommerziellen Quellen ist nur zur Identifizierung und impliziert keine Billigung durch die Zentren für Krankheitskontrolle und Prävention.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 3 % Wasserstoffperoxid | Pharamacy-Marken | von der Stange 3 % H2O2 | |
| 3-Amino-9-ethylcarbazol (AEC) | Millipore Sigma | A6926 | |
| Acetat-Puffer pH 5,2 | Poly Scientific R& D Corp. | s140 | |
| Gepuffertes Formalin 10% Phosphat gepuffert | Fisher Scientific | SF100-4 | zertifizierte |
| Deckgläser Corning | Fisher Scientific | 12-553-471 | 24 x 50 mm |
| Ethanol 190 Proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Ethanol 200 Proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Gill's Hämatoxylin-Formulierung #2 | Fisher Scientific | CS401-1D | |
| HistoMark Biotin-Streptavidin Peroxidase Kit | Seracare | 71-00-18 | Maus Primärer Antikörper |
| ImmunoHistoMount | Millipore Sigma | i1161 | Eindeckmedien |
| N,N, Dimethylformamid GR | Fisher Scientific | D119 | |
| Phosphat gepufferte Kochsalzlösung | HyClone | RR14440.01 | 01M, pH 7,2 (pH 7,2-7,6) |
| Plan-APOCHROMAT 40X/0,95 Objektiv | Mehrere Anbieter | ||
| Plan-APOCHROMATIC 20X/0,75 Objektiv | Mehrere Anbieter | ||
| Pronase | Millipore Sigma | 53702 | Protease, Streptomyces griseusScott's |
| Leitungswasser | Poly Scientific F& Technik D Corp. | s1887 | |
| Tissue-Tek Objektträger-Färbeset | Fisher Scientific | 50-294-72 | |
| TWEEN-80 | Millipore Sigma | P1754 | |
| Xylol | Fisher Scientific | X3S-4 | Histological Grade |
| Zeiss Axioplan 2 Bildgebung - Mikroskop | Mehrere Anbieter |
Referenzen
- Rupprecht, C., Kuzmin, I., Meslin, F. Lyssaviruses and rabies: current conundrums, concerns, contradictions and controversies. F1000Research. 6, 184(2017).
- Fooks, A. R., et al. Current status of rabies and prospects for elimination. Lancet. 384<....
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Nachdrucke und Genehmigungen
