Hocheffiziente Transfektion von primärer Makrophagen mit In Vitro transscribed mRNA

Zusammenfassung

Makrophagen, insbesondere primäre Makrophagen, sind eine Herausforderung zu transfetieren, da sie sich auf die Detektion von Molekülen ohne Selbstherkunft spezialisieren. Wir beschreiben ein Protokoll, das eine hocheffiziente Transfektion von primären Makrophagen mit mRNA ermöglicht, die aus DNA-Vorlagen wie Plasmiden generiert werden.

Zusammenfassung

Makrophagen sind phagozytische Zellen, die auf die Detektion von Molekülen ohne Selbstherkunft spezialisiert sind. Zu diesem Zweck sind sie mit einer großen Auswahl an Mustererkennungsrezeptoren (PRRs) ausgestattet. Leider macht dies auch Makrophagen besonders schwierig zu transfekieren, da das Transfektionsreagenz und die transfizierten Nukleinsäuren von den PRRs oft als nicht-selbst erkannt werden. Daher führt die Transfektion oft zu Makrophagenaktivierung und Abbau der transfizierten Nukleinsäuren oder sogar zum Selbstmord der Makrophagen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das eine hocheffiziente Transfektion von murinen primären Makrophagen wie Peritonealmakrophagen (PM) und Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen (BMDM) mit mRNA in vitro aus DNA-Vorlagen wie Plasmiden transkribiert ermöglicht. Mit diesem einfachen Protokoll werden Transfektionsraten von etwa 50-65% für PM und etwa 85% für BMDM erreicht, ohne dass Zytotoxizität oder Immunogenität beobachtet werden. Wir beschreiben detailliert die Generierung von mRNA für die Transfektion aus DNA-Konstrukten wie Plasmiden und dem Transfektionsverfahren.

Einleitung

Makrophagen sind phagozytische Zellen, die sich auf die Erkennung, Einnahme und Erniedrigung von Mikroben, apoptotischen Zellen und zellulären Ablagerungen spezialisieren. Darüber hinaus helfen sie, Immunantworten zu orchestrieren, indem sie Zytokine und Chemokine sezernieren und Antigene t-Zellen und B-Zellen präsentieren. Makrophagen spielen auch eine wichtige Rolle in zahlreichen anderen Prozessen, wie Wundheilung, Arteriosklerose, Tumorgenese und Adipositas.

Um Nicht-Selbstmoleküle wie pathogenassoziierte molekulare Muster (PAMPs) und außerorts entfernte Moleküle wie schadensassoziierte molekulare Muster (DAMPs) nachweisen zu können, sind Makrophagen mit einer Vielzahl von Mustererkennungsrezeptoren (PRR)^{ausgestattet 1}. Leider macht dies auch Makrophagen besonders schwierig,^{um 2} zu transfekieren, da das Transfektionsreagenz³ und die transfizierten Nukleinsäuren^4,5,6,7 oft von den PRRs als nicht selbst erkannt werden. Aus diesem Grund führt die Transfektion von Makrophagen mit chemischen oder physikalischen Methoden⁸ in der Regel zu Makrophagenaktivierung und Abbau der transfizierten Nukleinsäuren oder sogar zum Makrophagenselbstmord mittels Pyroptose, einer Form des programmierten lytischen Zelltodes, der nach Erkennung von zytosolischen PAMPs/DAMPs wie DNA oder Fremd-RNA⁹ausgelöst wird. Biologische Transfektion von Makrophagen mit Viren wie Adenoviren oder Lentiviren als Vektoren ist oft effizienter, aber die Konstruktion solcher viralen Vektoren ist zeitaufwändig und erfordert Biosicherheitsausrüstung der Stufe 2^10,11.

Obwohl Makrophagen intensiv erforscht werden, wird die Analyse ihrer Funktionen auf molekularer Ebene dadurch erschwert, dass eines der wichtigsten Instrumente der Molekularbiologie, die Transfektion von Nukleinsäurekonstrukten zur exogenen Expression von Proteine, ist kaum anwendbar. Dies zwingt Forscher oft dazu, makrophagenähnliche Zelllinien anstelle von bona fide Makrophagen zu verwenden. Anwendungen für Nukleinsäurekonstrukttransfektion enzinieren die Expression mutierter oder getaggter Proteinversionen, die Überexpression eines bestimmten Proteins, die Proteinreexpression in einem entsprechenden Knockout-Hintergrund und die Expression von Proteinen anderer Arten (z. B. , Cre Recombinase oder Guide RNA und Cas9 für gezielte Gen Knockout).

Hier beschreiben wir ein Protokoll, das hocheffiziente Transfektion von (in der Regel schwer zu transfekten) primären Makrophagen ermöglicht, d. h. murinen peritonealen Makrophagen (PM) und Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen (BMDM) mit mRNA, die aus DNA-Vorlagen wie Plasmiden generiert werden. Wichtig ist, dass die mit diesem Protokoll erzeugte in vitro transkribierte mRNA die natürlich vorkommenden modifizierten Nukleoside nukleoside nucleosides 5-methyl-CTP und Pseudo-UTP enthält, die die Immunogenität reduzieren und die^Stabilität4^,6,7,12,13. Darüber hinaus werden die 5'-Enden der in vitro transkribierten mRNA durch antarktische Phosphatase dephosphoryliert, um die Erkennung durch den RIG-I-Komplex^14,15zu verhindern. Dies minimiert die angeborene Immunerkennung der in vitro transkribierten mRNA. Mit unserem einfach durchzuführenden Protokoll werden Transfektionsraten zwischen 50-65% (Peritonealmakropages (PM)) und 85% (BMDM) erreicht, während, was wichtig ist, keine Zytotoxizität oder Immunogenität beobachtet wird. Wir beschreiben detailliert (i) wie die immunologisch stumme mRNA zur Transfektion aus DNA-Konstrukten wie Plasmiden und (ii) dem Transfektionsverfahren selbst erzeugt werden kann.

Protokoll

Die Makrophagenisolierung von Mäusen erfolgte nach dem Tierschutzgesetz Deutschlands in Übereinstimmung mit der Ethikkommission der Universität Köln.

HINWEIS: Führen Sie alle Schritte mit Handschuhen. Führen Sie alle Transfektionsschritte unter einer laminaren Durchflusshaube durch, um eine Kontamination der Zellen zu verhindern. Reinigen Sie vor der Arbeit mit mRNA alle Instrumente wie Pipetten und jede Oberfläche mit 70 % Ethanol und/oder einem RNAse-abbauenden Tensid (Materialtabelle). Stellen Sie sicher, dass alle Reaktionsröhrchen RNAse-frei und steril sind. Verwenden Sie nur steriles, RNAase-freies Wasser für Verdünnungen. Verwenden Sie ausschließlich Pipettenspitzen mit Filtern. Ändern Sie die Pipettenspitzen nach jedem Pipettierschritt.

1. Generierung der DNA-Vorlage

HINWEIS: Die DNA-Vorlage für die in vitro mRNA-Transkription mit diesem Protokoll muss eine T7-Promotorsequenz enthalten, um das Andocken der RNA-Polymerase zu ermöglichen. Enthält das Plasmid, das die DNA-Sequenz des von Interesse sindden Proteins enthält, bereits eine korrekt orientierte T7-Promotorsequenz direkt vor der Interessenssequenz, so muss eine Linearisierung des Plasmids (siehe Schritt 1.1.) durchgeführt werden. Andernfalls befestigen Sie einen T7-Promotor an der Interessensfolge durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR, siehe Schritt 1.2.).

1. Linearisierung von T7-promotorhaltigen Plasmiden
   1. Linearisieren Vonplasmide, die bereits eine korrekt orientierte T7-Promotorsequenz enthalten, durch Verdauung mit einem Restriktionsenzym, das nach dem Stop-Codon der Interessenssequenz schneidet. Andernfalls wird die Transkription nach der Reihenfolge des Interesses nicht ordnungsgemäß beendet.
      HINWEIS: Es ist am besten, Restriktionsenzyme zu verwenden, die stumpfe Enden oder 5' Überhänge hinterlassen.
   2. Bestätigen Sie die vollständige Linearisierung des Plasmids durch Agarose-Gel-Elektrophorese der unverdauten versus verdauten Plasmid-DNA.
   3. Reinigen Sie linearisierte Plasmid-DNA vor der Verwendung als DNA-Vorlage für die in vitro mRNA-Transkription mit einem DNA-Reinigungskit (Tabelle der Materialien).
2. Befestigung des T7-Promotors per PCR
   1. Verwenden Sie einen Vorwärtsprimer mit den folgenden Komponenten (in der angegebenen Reihenfolge von 5' bis 3'): ca. 5 zufällige bp vor dem Motor (z. B. GAAAT); die T7-Promotorsequenz (TAATACGACTCACTATAG); zwei zusätzliche Gs für erhöhte Transkriptionseffizienz (GG); der zielsequenzspezifische Teil, der homologe für die Plasmidsequenz ist, die das Startcodon umgibt.
      HINWEIS: Es sollte bestehend aus: 3-6 bp vor der KOZAK-Sequenz und Startcodon, der KOZAK-Sequenz und dem Startcodon (in der Regel GCCACC ATG G), 12-18 bp flussabwärts des Startcodons bestehen. Wenn die Interessensfolge noch keine KOZAK-Sequenz oder start-Codon enthält, können diese in diesem Schritt durch einfaches Einschließen in die Primersequenz angehängt werden.
   2. Berechnen Sie die t_m der Vorwärtsgrundierung nur unter Berücksichtigung des homologen Teils der Zielsequenz.
   3. Um Dimere/Haarnadelbildung zu beurteilen, verwenden Sie die gesamte Primersequenz, die leicht 50 bp überschreiten kann.
   4. Verwenden Sie eine Umgekehrte Grundierung, die sich irgendwo unterhalb des Stop-Codons befindet.
      HINWEIS: Wenn die Interessensfolge noch kein Stop-Codon enthält, kann es in diesem Schritt angefügt werden, indem man es einfach in die Primersequenz einfügt.
   5. Verwenden Sie die Vorwärts- und Rückwärtsgrundierungen, um eine PCR mit einer High-Fidelity-Polymerase mit Korrekturlesen(Materialtabelle )durchzuführen.
   6. Bestätigen Sie die Erzeugung eines einzelnen Produkts und amplicon Größe durch Agarose-Gel-Elektrophorese (z. B. verwenden Sie ein 1% Agarose-Gel und 100 V Konstantstrom).
   7. Reinigen Sie das PCR-Produkt vor der Verwendung als DNA-Vorlage für die In-vitro-mRNA-Transkription mit einem DNA-Reinigungskit.

2. mRNA-Generierung

1. Alle Komponenten des in vitro mRNA Transkriptionskits auftauen (siehe Materialtabelle). Vortex für 5 s und Spin-down für 2 s bei 2.000 x g. Auf Eis halten, bis es verwendet wird.
2. Bereiten Sie den Reaktionsmix für die in vitro mRNA-Transkription in einem 0,5 ml Mikrozentrifugenrohr in folgender Reihenfolge vor (Gesamtvolumen von 40 l): 20 l 10x ARCA/NTP-Mix (im in vitro mRNA-Transkriptionskit enthalten); 0,25 l 5-Methyl-CTP (Endkonzentration (z.B.) beträgt 1,25 mM; 50% des gesamten CTP); 0,25 l Pseudo-UTP (z. B. 1,25 mM; 50% der gesamten UTP); X L der DNA-Vorlage; 2 L t7-RNA-Polymerase-Mix (im in vitro mRNA-Transkriptionskit enthalten); Y-L von RNAse-frei_H2O.
   HINWEIS: X ist ein Volumen, das mindestens 1 g DNA enthält. Zum Beispiel 1,6 l aus einer 625 ng/l Stammlösung. Y ist das Reservevolumen bis zum Gesamtvolumen von 40 l.
3. Vortex für 5 s und Spin-down für 2 s bei 2.000 x g. Bei 37 °C für 30 min bei 400 Umdrehungen pro Minute auf einem Thermomischer zur In-vitro-Transkription inkubieren.
4. Fügen Sie dann 2 L DNase I direkt in den Reaktionsmix ein, um die Schablonen-DNA zu entfernen. Vortex für 5 s und Spin-down für 2 s bei 2.000 x g.
5. Bei 37 °C für 15 min bei 400 Umdrehungen pro Minute auf einem Thermomischer inkubieren. Nehmen Sie für das Kontrollgel (Schritt 3.3) ein Aliquot von 2 l und lagern Sie es bei -80 °C.
6. Fügen Sie für Poly(A)-Abstriche die folgenden Komponenten direkt in den vorherigen Reaktionsmix ein (zu einem Endvolumen von 50 l): 5 l 10x Poly(A)-Polymerase-Reaktionspuffer und 5 l Poly(A)-Polymerase (beide im in vitro mRNA-Transkriptionskit enthalten). Vortex für 5 s und Spin-down für 2 s bei 2.000 x g.
7. Inkubieren Sie die Mischung bei 37 °C für 30 min bei 400 Umdrehungen pro Minute auf einem Thermomixer. Nehmen Sie für das Kontrollgel (Schritt 3.3) ein Aliquot von 2 l und lagern Sie es bei -80 °C.
8. Zur Dephosphorylierung der 5-Enden der mRNA fügen Sie die folgenden Komponenten direkt in den vorherigen Reaktionsmix ein (bei einem Endvolumen von 60 l): 3 l RNAse-freies_H2O; 6 l des 10-fachen antarktischen Phosphatase-Reaktionspuffers; 3 L antarktische Phosphatase (15 Einheiten für ein Reaktionsvolumen von 60 l). Vortex für 5 s und Spin-down für 2 s bei 2.000 x g.
9. Inkubieren Sie die Mischung bei 37 °C für 30 min bei 400 Umdrehungen pro Minute auf einem Thermomischer.
10. Wärmeinaktivierende antarktische Phosphatase durch Inkubation bei 80 °C für 2 min.
    HINWEIS: Im Idealfall verwenden Sie einen separaten thermischen Mischer, warten Sie nicht, bis der erste Mischer die gewünschte Temperatur erreicht.

3. mRNA-Reinigung

1. Reinigen Sie die in vitro transkribierte mRNA mit einem speziellen RNA-Reinigungskit (Table of Materials).
   1. Fügen Sie dem mRNA-Reaktionsmix ab Schritt 2.10 eine X-L-Elutionslösung hinzu. Mischen Sie durch Invertieren 5 Mal. Fügen Sie 300 l Bindungslösung Konzentrat hinzu. Mischen Sie durch sanfte Pipettierung 5 mal.
      HINWEIS: X ist das Ersatzvolumen bis zu einem Gesamtvolumen von 100 L. Fügen Sie z. B. eine Elutionslösung von 40 l zu einem 60-L-mRNA-Reaktionsmix hinzu.
   2. Fügen Sie 100 l RNAase-freies Ethanol hinzu. Mischen Sie durch sanfte Pipettierung 5 mal.
   3. Platzieren Sie eine Filterspalte in einem der mitgelieferten Sammelrohre. Übertragen Sie den mRNA-Reaktionsmix sanft auf die Mitte des Filters, ohne den Filter zu berühren. Zentrifuge bei 15.000 x g für 1 min bei Raumtemperatur (RT).
   4. Heben Sie die Filtersäule vorsichtig an und entsorgen Sie den Durchfluss im Sammelrohr. Platzieren Sie die Filterspalte wieder in demselben Sammelrohr.
   5. Fügen Sie 500 l Waschlösung hinzu (vergessen Sie nicht, 20 ml RNAase-freies Ethanol hinzuzufügen, bevor Sie die Waschlösung zum ersten Mal verwenden).
   6. Zentrifuge bei 15.000 x g für 1 min bei RT. Wiederholen Sie die Schritte 3.1.4-3.1.6, um noch einmal zu waschen.
   7. Zentrifuge bei voller Geschwindigkeit (17.900 x g) für 1 min bei RT, um Restflüssigkeit aus der Filtersäule zu entfernen. Nehmen Sie vorsichtig die Filterspalte aus dem Sammelrohr. Platzieren Sie die Filterspalte in einem neuen Sammelrohr.
   8. Fügen Sie 50 L Elutionspuffer in die Mitte des Filters, ohne den Filter zu berühren. Bei 65 °C für 10 min auf einem Thermomischer inkubieren.
   9. Zentrifuge bei 15.000 x g für 1 min bei RT. Entfernen Sie die Filtersäule und entsorgen Sie sie.
2. Messen Sie die Konzentration und Reinheit der eluierten mRNA, indem Sie beispielsweise ein Mikrovolumenspektralphotometer verwenden, um die Absorption bei 260 und 280 nm zu messen.
   HINWEIS: Ein A260/A280-Verhältnis von 1,8-2,1 ist bezeichnend für hochgereinigte mRNA.
3. Überprüfen Sie das Vorhandensein eines einzelnen Produkts, korrigieren Sie die Transkriptlänge und die Poly(A)-Abhaltung, indem Sie die Aliquots aus den Schritten 2.5 und 2.7 durch Agarose-Gel-Elektrophorese unter Denaturing-Bedingungen analysieren (z. B. verwenden Sie ein 1,2% Agarose-Gel mit 20 mM 3-(N-Morpholino) Propanesulfonsäure [MOPS], 5 mM Natriumacetat, 1 mM EDTA und 20% Formaldehyd und laufen in 20 mM MOPS, 5 mM Natriumacetat, 1 mM EDTA und 0,74 % Formaldehyd bei 100 V Konstantstrom).
4. Bewahren Sie die gereinigte mRNA bis zur Transfektion bei -80 °C im Elutionsröhrchen auf. Wenn nur geringe Mengen der mRNA für die Transfektion verwendet werden, dann aliquot die mRNA, um wiederholte Frost-Tau-Zyklen zu vermeiden.
   HINWEIS: mRNA kann bei -80 °C für ca. 1 Jahr gelagert werden.

4. Makrophagen-Vorbereitung

1. Euthanize C57/BL6 Mäuse (verwenden Sie Mäuse des gleichen Geschlechts und von 6-24 Wochen alt) durch Zervixdislokation.
   HINWEIS: Die gleichen Mäuse können zur Isolierung von PM (Schritt 4.2) und zur Erzeugung von BMDM (Schritte 4.3 und 4.4) verwendet werden. Zur Isolierung von PM verwenden Sie mindestens zwei Mäuse. Wenn nur BMDM generiert werden soll, reicht in der Regel eine Maus aus.
2. Immunmagnetische Anreicherung von peritonealen Makrophagen.
   1. Füllen Sie eine 10 ml Spritze mit einer 0,9 x 40 mm Kanüle mit 8 ml eiskalter Phosphat-gepufferter Saline (PBS) und 2 ml Luft. Spülen Sie die Peritonealhöhle mit PBS. Die Luft bildet eine Blase, die Leckagen des PBS minimiert.
   2. Schnell peritoneale Lavung mit der gleichen Spritze sammeln und in ein 50 ml konisches Zentrifugationsrohr übertragen. Kombinieren Sie bei Bedarf Peritonealzellen mehrerer Mäuse. Halten Sie die Zellsuspension auf Eis.
   3. Zentrifugenzellaufhängung bei 650 x g für 5 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in 5 ml 0,2 % NaCl für 30 s aus, um rote Blutkörperchen zu lysieren.
   4. Fügen Sie 5 ml 1,6% NaCl zu einem Gesamtvolumen von 10 ml hinzu, um isotonische Bedingungen wiederherzustellen. Zentrifuge bei 650 x g für 5 min bei 4 °C.
   5. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in 97,5 L magnetischer Zellsortierungspuffer (MCS) (2 mM Ethylendiamintetraessigsäure [EDTA], 5% Rinderserumalbumin [BSA] in PBS) pro 1 Peritonealspülung (z. B. wenn drei Mäuse gespült wurden, ).
   6. Fügen Sie 2,5 l paramagnetische Perlen, die zu einem CD11b-spezifischen Antikörper konjugiert sind, pro 97,5 l Zellsuspension (z. B. 7,5 l bis 292,5 l) hinzuzufügen.
   7. 15 min bei 150 Umdrehungen auf einem Orbital-Shaker auf Eis bebrüten.
   8. Zentrifugenzellsuspension bei 650 x g für 5 min bei 4 °C, den Überstand entsorgen und das Zellpellet in 1 ml MCS-Puffer wieder aufhängen.
   9. Fügen Sie 4 ml MCS-Puffer zu einem Gesamtvolumen von 5 ml hinzu und waschen Sie die Zellen, indem Sie die Zellen vorsichtig dreimal nach oben und unten pfeifen.
   10. Wiederholen Sie die Schritte 4.2.8 und 4.2.9 zwei weitere Male für insgesamt drei Waschschritte.
   11. Legen Sie während der Waschschritte eine LS-Säule in einen magnetischen Zellabscheider (siehe Materialtabelle). Spülen Sie die Spalte mit 3 ml MCS-Puffer.
       HINWEIS: Vermeiden Sie Blasen, da diese die Spalte verstopfen können.
   12. Setzen Sie das Zellpellet in 1 ml MCS-Puffer wieder auf. Fügen Sie 3 ml MCS-Puffer zu einem Gesamtvolumen von 4 ml hinzu, mischen Sie durch Pipettieren nach oben und unten dreimal.
   13. Übertragen Sie die 4 ml Zellsuspension auf die vorspülte LS-Säule.
       HINWEIS: Vermeiden Sie erneut Blasen, da diese die Spalte verstopfen können.
   14. Warten Sie, bis das Reservoir der Säule vollständig leer ist. Fügen Sie keine zusätzliche Flüssigkeit hinzu, bis die Säule aufhört zu tropfen.
   15. Fügen Sie der Spalte 3 ml MCS-Puffer hinzu. Warten Sie dann, bis das Reservoir der Säule vollständig leer ist. Wiederholen Sie Schritt 4.2.15 zwei weitere Male.
   16. Legen Sie die LS-Säule in ein 15 ml konisches Zentrifugationsrohr. Wenden Sie 5 ml MCS-Puffer auf die Spalte an. Warten Sie, bis 2 ml Flüssigkeit durch die Säule gelangt ist, und verwenden Sie dann den Kolben, um den verbleibenden Bruch vorsichtig in die Röhre zu drücken.
   17. Zentrifugenzellsuspension bei 650 x g für 5 min bei 4 °C und den Überstand entsorgen.
   18. Das Zellpellet in 1 ml DMEM mit 10% hitzeinaktiviertem fetalem Kalbsserum (FCS) (DMEM+FCS) wieder aufhängen.
   19. Bestimmen Sie die Anzahl lebensfähiger Zellen, indem Sie in einer Trypan-Blaulösung in einer Neubauer-Zählkammer und Samenzellen in DMEM+FCS in Kulturplatten zählen.
       HINWEIS: Seed PM mit einer Dichte von 100.000 Zellen/Well in einer flachen unteren Mikrotiterplatte. Verwenden Sie keine gewebekulturbehandelten Platten, da PM nicht von diesen gelöst werden kann. Verwenden Sie stattdessen nicht behandelte Platten.
3. Generation of BMDM
   1. Entfernen Sie Haut und Muskeln von den Hinterbeinen mit einer Schere. Waschen Sie jedes Bein durch kurzes Eintauchen in 70% Ethanol.
   2. Lösen Sie die Beine und öffnen Sie beide Enden des Oberschenkelknochens und der Tibia durch Schneiden mit der Schere.
   3. Füllen Sie eine 5 ml Spritze gefüllt mit einer 0,6 mm x 30 mm Kanüle mit 5 ml sehr niedrigem Endotoxin (VLE) RPMI 1640 und spülen Sie das Knochenmark aus den geöffneten Knochen in eine Kulturschale.
   4. Kombinieren Sie knochenmark mehrerer Mäuse, falls erforderlich, indem Sie die Schritte 4.3.1-4.3.3 wiederholen. Übertragen Sie das Knochenmark in ein 50 ml konisches Zentrifugationsrohr.
   5. Zentrifugieren Sie die Knochenmarksuspension bei 650 x g für 5 min bei 4 °C und entsorgen Sie den Überstand.
   6. Setzen Sie das Zellpellet in 5 ml roter Blutzelllysepuffer (8,3% NH₄Cl, 0,1 M Tris) wieder auf und brüten sie für 5 min bei RT, um die roten Blutkörperchen zu lysieren.
   7. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 650 x g bei 4° C für 5 min und entsorgen Sie den Überstand.
   8. Das Zellpellet in 1 ml VLE RPMI 1640 Medium mit 10% FCS, 1% Penicillin/Streptomycin, 1% HEPES, 1% Natriumpyruvat und 10 ng/mL rekombinantem Makrophagenkoloniestimulierendem Faktor (M-CSF) (RPMI⁺⁺⁺⁺⁺) wieder aufsetzen
   9. Fügen Sie 4 ml RPMI⁺⁺⁺⁺⁺ zu einem Gesamtvolumen von 5 ml hinzu.
   10. Bereiten Sie 5 92 mm x 16 mm unbehandelte Petrischalen mit Nocken (siehe Materialtabelle)pro Maus vor, indem Sie 7 ml RPMI⁺⁺⁺⁺⁺ Medium in jede Schale pfeifen.
   11. Übertragen Sie die 1 ml Zelllösung auf die 5 zubereiteten Kulturgerichte und brüten bei 37 °C und 5%_CO2.
   12. Nach 4 Tagen füttern Sie die Zellen, indem Sie 4 ml RPMI⁺⁺⁺⁺⁺hinzufügen. Nach 6-7 Tagen werden die Knochenmarkzellen vollständig in BMDM differenziert.
4. Ernte von BMDM
   1. Entfernen Sie das Medium vollständig von Kulturgerichten. Fügen Sie 5 ml warme 0,2 mM EDTA in PBS zu jedem Gericht hinzu.
   2. Kratzen Sie die gesamte Platte vorsichtig mit einem Zellschaber, um das BMDM zu lösen. Kombinieren Sie die Zellsuspensionen in einem 50 ml konischen Zentrifugationsrohr.
   3. Spülen Sie alle 5 Gerichte wieder. Verwenden Sie das gleiche Volumen von 5 ml warme 0,2 mM EDTA in PBS für alle 5 Gerichte. Kombinieren Sie diese Zellsuspension mit der aus dem vorherigen Schritt.
   4. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 650 x g für 5 min bei 4° C und entsorgen Sie den Überstand.
   5. Setzen Sie das Zellpellet in 1 ml VLE RPMI 1640 Medium, ergänzt mit 10% FCS, 1% HEPES, 1% Natriumpyruvat und 10 ng/ml rekombinantem M-CSF, aber keine Antibiotika (RPMI⁺⁺⁺⁺).
   6. Bestimmen Sie die Anzahl lebensfähiger Zellen, indem Sie in einer Trypan-Blaulösung in einer Neubauer-Zählkammer und Samenzellen in RPMI⁺⁺⁺⁺ in Kulturplatten zählen.
      HINWEIS: Seed BMDM mit einer Dichte von 50.000 Zellen/Well Maximum in einer flachen unteren Mikrotiterplatte. Verwenden Sie keine gewebekulturbehandelten Platten, da BMDM kaum von diesen gelöst werden kann. Verwenden Sie stattdessen nicht behandelte Platten.

5. Transfektion von Makrophagen mit mRNA

1. Berechnen Sie das erforderliche Volumen des mRNA-Transfektionspuffers.
   HINWEIS: Das benötigte Volumen des mRNA-Transfektionspuffers hängt von der Brunnengröße ab: Verwenden Sie 200 l für die Transfektion in einer 6-Well-Platte, 100 l in einer 12-Well-Platte und so weiter. Fügen Sie immer ein wenig freies Volumen wegen Pipettierverlust (aber nicht zu viel, um übermäßige Verdünnung von mRNA zu verhindern). Verwenden Sie z. B. 450 l anstelle von 4 x 100 l = 400 l, um in 4 Bohrungen einer 12-Well-Platte zu transfekten.
2. Berechnen Sie das erforderliche Volumen des mRNA-Transfektionsreagenzes. Das mRNA-Transfektionsreagenz wird im Verhältnis 1:50 zugegeben. So werden z. B. 9 l mRNA-Transfektionsreagenz für ein Endvolumen von 450 l benötigt.
3. Berechnen Sie die Gesamtmenge der benötigten mRNA. Mindestens 100 ng pro 100.000 Makrophagen sind für eine effiziente Transfektion erforderlich, 200 ng funktionieren noch besser (z. B. 800 ng mRNA, um 400.000 Makrophagen zu transfezieren).
   1. Multiplizieren Sie die berechnete Menge an mRNA mit der Gesamtzahl der Brunnen, die transfiziert werden müssen (z.B. 4 Brunnen mit jeweils 400.000 Makrophagen: 4 x 800 ng = 3.200 ng mRNA ist insgesamt für alle Brunnen erforderlich). Wenn Ihr mRNA-Bestand z. B. 426,8 ng/l beträgt, werden 7,49 l für eine optimale Transfektion von 4 Bohrständen mit jeweils 400.000 Makrophagen benötigt.
4. Fügen Sie das berechnete Volumen des mRNA-Transfektionspuffers (Schritt 5.1.) abzüglich der Volumina für mRNA-Transfektionsreagenz (Schritt 5.2) und die mRNA (Schritt 5.3) zu einem Reaktionsröhrchen hinzu. Zum Beispiel 450 l - 9 l - 7,49 l = 433,51 l.
5. Den mRNA-Bestand auftauen und durch sanftes Umdrehen des Elutionsrohrs mischen. Fügen Sie das berechnete Volumen von mRNA (Schritt 5.3) in das Reaktionsröhrchen mit mRNA-Reaktionspuffer ein (im oben dargestellten Beispiel: 7,49 l in 433,51 l).
6. Vortex für 5 s und Spin-down für 2 s bei 2.000 x g.
7. Vortex das mRNA Transfektionsreagenz für 5 s und Spin down für 2 s bei 2.000 x g.
8. Fügen Sie das berechnete Volumen des mRNA-Transfektionsreageims (Schritt 5.2) in das Reaktionsröhrchen ein, das den mRNA-Transfektionspuffer und die mRNA enthält (im oben beschriebenen Beispiel: 9 l mRNA-Transfektionsreagenz).
9. Wirbel die Transfektion Mischung für 5 s und Spin-down für 2 s bei 2.000 x g.
10. 15 min bei RT inkubieren.
11. Ersetzen Sie in der Zwischenzeit das Kulturmedium der Makrophagen durch ein frisches, warmes Kulturmedium (siehe Schritte 4.2.18. und 4.4.5).
12. Fügen Sie nach dem Inkubationsschritt 5.10 die Transfektionsmischung in die Brunnen, die die Makrophagen enthalten, in einem Volumen hinzu, das der Größe des Brunnens entspricht (siehe Schritt 5.1). Fügen Sie die Transfektionsmischung tropfenweise in einem Kreis von außen bis zur Mitte des Brunnens hinzu.
13. Schaukeln Sie die Platte vorsichtig, zuerst in vertikaler und dann in horizontaler Richtung, um eine gleichmäßige Verteilung der Transfektionsmischung im Brunnen zu gewährleisten. Dann bei 37 °C und 5 %_CO2inkubieren. Die Synthese des durch die transfizierte mRNA kodierten Proteins beginnt kurz nach der Transfektion. Für beste Ergebnisse, inkubieren für mindestens 6 h.
14. Analysieren Sie nach der Inkubation die Transfektionseffizienz durch (Immun-)Fluoreszenzmikroskopie, Durchflusszytometrie oder Immunoblot¹⁶, oder verwenden Sie die transfizierten Makrophagen für das Experiment Ihrer Wahl.

Ergebnisse

Wir haben dieses Protokoll erfolgreich verwendet, um mRNA-Codierung für FLAG-markierte NEMO- und IKK-Varianten für die Transfektion von primären Makrophagen¹⁶zu generieren. Die Plasmide, die für FLAG-markierte Wildtyp (NEMO^WT) und C54/347A mutierte NEMO (NEMO^C54/374A) (siehe Materialtabelle) kodieren, enthalten bereits einen T7-Promotor in der richtigen Ausrichtung (Abbildung 1A)....

Diskussion

Hier stellen wir ein Protokoll zur hocheffizienten Transfektion von meist schwer transfekten primären Makrophagen mit in vitro transkribierter mRNA vor. Wichtig ist, dass die Transfektion der Makrophagen mit diesem Protokoll weder den Zelltod induziert noch die proinflammatorische Signalisierung aktiviert, was darauf hinweist, dass weder das Transfektionsreagenz noch die transfizierte mRNA als nicht-selbst erkannt werden.

Die Qualität der mRNA ist von zentraler Bedeutung für die erfolgreiche T...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
5-Methyl-CTP (100 mM)	Jena Biosience	NU-1138S	gelagert bei -20 &de; C
Antarktische Phosphatase	New England BioLabs	M0289	gelagert bei -20 &°; C
Antarktischer Phosphatase-Reaktionspuffer (10x)	New England BioLabs	B0289	gelagert bei -20 &Grad; C
Anti-NEMO/IKKγ Antikörper	Invitrogen	MA1-41046	gelagert bei -20 &Grad; C
Anti-β-Aktin-Antikörper	Sigma-Aldrich	A2228	gelagert bei -20 ° C
Petrischalen 92,16 mm mit Nocken	Sarstedt	821,473	gelagert bei RT
CD11b Mikrokügelchen Maus und Mensch	Miltenyi Biotec	130-049-601	gelagert bei 4 ° C
Cre Rekombinase + T7-Promotor Forward	Primer Sigma-Aldrich		5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGGCAGCCGCCACCATGTCC AATTTACTGACCGTAC-3´, gelagert bei -20 &de; C
Cre Rekombinase + T7-Promotor Reverse Primer	Sigma-Aldrich		5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG C-3′, gelagert bei -20 &de;
C-DNA-Aufreinigungskit: QIAquick PCR-Aufreinigungskit	Qiagen	28104	gelagert bei RT
eGFP + T7-Promotor Forward Primer	Sigma-Aldrich		5´-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGATCCATCGCCACCATGGTG AGCAAGG-3´, gelagert bei -20 &de; C
eGFP + T7-Promotor Reverse Primer	Sigma-Aldrich		5´-TGGTATGGCTGATTA TGATCTAGAGTCG-3´, gelagert bei -20&de; C
Fast Digest Puffer (10x)	Thermo Scientific	B64	gelagert bei -20 &Grad; C
FastDigest XbaI	Thermo Scientific	FD0684	gelagert bei -20 & Grad; C
High-Fidelity-Polymerase mit Korrekturlesen: Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase	New England Biolabs Inc	M0491S	gelagert bei -20 &de; C
IKKβ + T7-Promotor Forward Primer	Sigma-Aldrich		5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGTTGATCTACCATGGACTACA AAGACG-3′, gelagert bei -20 &de; C
IKKβ + T7-Promotor Reverse Primer	Sigma-Aldrich		5′-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3′, gelagert bei -20 ° C
In vitro mRNA-Transkriptionskit: HiScribe T7 ARCA mRNA-Kit (mit polyA-Tailing)	New England BioLabs	E2060	gelagert bei -20 &Grad; C
LS Säulen	Miltenyi Biotec	130-042-401	gelagert bei RT
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303	gelagert bei RT
mRNA-Transfektionspuffer und Reagenz: jetMESSENGER	Polyplus Transfektion	409-0001DE	gelagert bei 4 ° C
Mutant IKKβ IKK-2S177/181E Plasmid	Addgen	11105	gelagert bei -20 ° C
Mutante NEMOC54/347A Plasmid	Addgen	27268	gelagert bei -20 ° C
pEGFP-N3-Plasmid	Addgen	62043	gelagert bei -20 ° C
poly(I:C)	Calbiochem	528906	bei -20 &° gelagert; C
pPGK-Cre-Plasmid			F.T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, Neue Varianten der induzierbaren Cre-Rekombinase: Eine neuartige Mutante des Cre-PR-Fusionsproteins weist eine erhöhte Sensitivität und einen erweiterten Bereich der Induzierbarkeit auf. Nukleinsäuren Res. 29, 47e (2001). gelagert bei -20 & Grad; C
pseudo-UTP (100 mM)	Jena Biosience	NU-1139S	gelagert bei -20 ° C
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-090-976	gelagert bei RT
Ratten-Anti-Maus CD11b Antikörper, APC-konjugierter	BioLegend	101212	gelagert bei 4 ° C
Ratten-Anti-Maus F4/80 Antikörper, PE-konjugiert	eBioscience	12-4801-82	gelagert bei 4 ° C
Rekombinant M-CSF	Peprotech	315-02	gelagert bei -20 &°;
C-RNA-Aufreinigungskit: MEGAclear Transkriptions-Aufreinigungskit	ThermoFisher Scientific	AM1908	gelagert bei 4 & Grad; C
RNAse-abbauendes Tensid: RnaseZAP	Sigma-Aldrich	R2020	gelagert bei RT
Ultrapure LPS aus E.coli O111:B4	Invivogen		gelagert bei -20 &de; C
Wildtyp IKKβ Plasmid	Addgen	11103	gelagert bei -20 ° C
Wildtyp-NEMO-Plasmid	Addgene	27268	gelagert bei -20 μg; C