Methodenartikel

Generation von Chimeric Axolotls mit Mutant Haploid Limbs Durch Embryonale Grafting

DOI:

10.3791/60156

⸱

29. Januar 2020

 ,  , 
1Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, Yale University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Ziel dieses Protokolls ist es, chimäre Axolotle mit haploiden Vorderbeinen aus Cas9-mutagenisiertem Spendergewebe unter Verwendung embryonaler Gewebetransplantationstechniken zu produzieren.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eine wachsende Reihe von genetischen Techniken und Ressourcen ermöglichen es Forschern, die molekularen Ursprünge der Fähigkeit einiger Salamanderarten, wie Axolotls, ganze Gliedmaßen als Erwachsene zu regenerieren, zu erforschen. Hier skizzieren wir Techniken zur Erzeugung von chimerischen Axolotls mit Cas9-mutagenisierten haploiden Vorderbeinen, die zur Erforschung der Genfunktion und der Genauigkeit der Gliedmaßenregeneration verwendet werden können. Wir kombinieren mehrere embryologische und genetische Techniken, einschließlich der haploiden Erzeugung mittels In-vitro-Aktivierung, CRISPR/Cas9-Mutagenese und Gewebetransplantation in einem Protokoll, um ein einzigartiges System für haploidgenetisches Screening in einem Modellorganismus der Regeneration zu produzieren. Diese Strategie reduziert die Anzahl der Tiere, den Raum und den Zeitaufwand für die funktionelle Analyse von Genen bei der Regeneration der Gliedmaßen. Dies ermöglicht auch die Untersuchung von regenerationsspezifischen Funktionen von Genen, die für andere wesentliche Prozesse wie Organogenese, Gewebemorphogenese und andere wesentliche embryonale Prozesse erforderlich sein können. Die hier beschriebene Methode ist eine einzigartige Plattform für die Durchführung haploider genetischer Screenings in einem Wirbeltiermodellsystem.

Einleitung

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Historisch gesehen war die embryonale Gewebetransplantation in Amphibien eine wichtige Technik zur Erforschung grundlegender Mechanismen der Entwicklungsbiologie und Regeneration. Das Axolotl, eine Salamanderart, besitzt eine beeindruckende Fähigkeit, Gewebe und komplexe Strukturen wie Gliedmaßen und Organe nach Verletzungen oder Amputationen zu regenerieren. Ebenso beeindruckend können sie ohne Abstoßung Gewebetransplantate von anderen Individuen in embryonalen, juvenilen und erwachsenen Stadien1,2,3erhalten. Regionen von Embryonen, die ganze Strukturen wie Gliedmaßen, Schwänze, Augen und Köpfe produzieren, und spezifischere Gewebe, wie Neuroektoderm und Soden, können zwischen Embryonen gepfropft werden, um chimäre Tiere zu produzieren1,2,4,5,6. Seit fast einem Jahrhundert liefern Studien an solchen chimertieren den entscheidenden Einblicken in Regeneration, Gewebedifferenzierung, Größenkontrolle und Musterung1,7,8.

In den letzten zehn Jahren haben zahlreiche transkriptionelle Studien an regenerierenden Geweben Einblicke in die genetischen Programme der Salamanderregeneration9,10,11,12,13. Diese Studien haben zu einer wachsenden Liste von Kandidatengenen hinzugefügt, die bis heute im Kontext der Regeneration weitgehend uncharakterisiert sind. Gezielte Mutagenesetechniken wie CRISPR/Cas ermöglichen nun die Untersuchung solcher Gene, und solche genetischen Ansätze werden durch die kürzliche Sequenzierung und Montage des großen Axolotl-Genoms14,15,16erheblich erleichtert.

Wir versuchten, Techniken zu entwickeln, die klassische Entwicklungsbiologie mit neuer Gentechnologie koppelten, um die Mechanismen der Regeneration zu sezieren. Methoden zur Erzeugung haploider Embryonen von Axolotls und anderen Salamandern sind seit Jahrzehnten etabliert17. Während diese Techniken seit langem als Vorteile von Salamandern als genetische Modellorganismen18bezeichnet werden, haben nur wenige nachfolgende genetische Studien haploide Tiere aufgenommen. Wir verwenden In-vitro-Aktivierung im Axolotl, um haploide Embryonen zu produzieren, die als Gewebespender für die Transplantation dienen19. Mit Embryonen, die fluoreszierende genetische Marker tragen, haben wir zuverlässige Methoden zur Erzeugung von Gliedmaßen entwickelt, die fast ausschließlich aus Spendergeweben gewonnen wurden (Abbildung 1A). Durch die Kombination dieser beiden Techniken haben wir die späte embryonale Letalität im Zusammenhang mit der Haploidie umgangen, die die Produktion voll entwickelter, transplantierter haploider Gliedmaßen ermöglicht (Abbildung 1B, Abbildung 1B"und Abbildung 2).

Durch die Durchführung von CRISPR/Cas-vermittelter Mutagenese in haploiden Embryonen vor der Transplantation zur Herstellung von chimerischen Axolotlen mit mutierten haploiden Gliedmaßen können wir die Genfunktion speziell im Kontext der Gliedmaßenentwicklung und -regeneration untersuchen. Dies ermöglicht die Rettung von Gliedmaßen von potenziell embryonal-tödlichen mutierten Phänotypen. Während CRISPR/Cas Mikroinjektion Tiere erzeugen kann, die stark mutiert sind, sind solche Tiere in der Regel sehr mosaikartig, mit einem gewissen Grad an Retention von Wildtyp-Allelen und einer Vielzahl von unterschiedlichen Mutationen an den Zielstellen14,20. CRISPR-basierte Mutagenese in haploiden Zellen erhöht die Penetranz einzelner Allelverlust-der-Funktionsmutationen, da sie nicht durch zurückgehaltene Wildtyp-Allele maskiert werden können. Aus diesem Grund wird DAS CRISPR-basierte Screening in haploiden Zelllinien zunehmend zur Untersuchung der genetischen Grundlagen vieler zellulärer Prozesse21,22,23verwendet. Durch die Kombination von CRISPR-basierter Linienverfolgung mit unseren haploiden Gliedmaßenknospen-Pfropfprotokollen kann der hier beschriebene Ansatz als Plattform für haploide genetische Screens bei lebenden Tieren dienen20.

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Protokoll

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Experimentelle Verfahren, die in diesem Protokoll verwendet werden, wurden vom Yale University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC, 2017–10557) genehmigt und entsprachen allen Bundesrichtlinien und Richtlinien für die Verwendung von Wirbeltieren. Alle Tierversuche wurden am Ambystoma mexicanum (Axolotls) in Einrichtungen der Yale University durchgeführt.

1. Diploid Embryo Generation

  1. Erhalten Sie GFP+ diploide Embryonen, um als Transplantatwirte durch natürliche Paarung mit einem oder zwei gfp Eltern 24zu dienen.
  2. Sammeln Sie frisch gelegte diploide Eier und legen Sie sie in ein Metallsieb.
  3. Spülen Sie die Eier gründlich mit 40% Holtfreter Lösung (20 mM NaCl, 0,2 mM KCl, 0,8 mM NaHCO3, 0,2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH bis 7,4).
  4. Die Eier in frische 40% Holtfreter-Lösung geben und bei 12 °C lagern.
    HINWEIS: Diploide Embryonen sollten immer erhalten werden, bevor sie zur haploiden Embryoerzeugung übergehen.

2. Haploid Embryo Generation

  1. Weibliche Gamete Spender Vorbereitung
    1. 48 h vor Der in vitro Aktivierung, anästhetisieren Sie ein geschlechtsreifes weißes oder weißes/RFP weibliches Axolotl durch Eintauchen in 1 g/L HEPES-gepufferte MS-222 in 40% Holtfreters Lösung25.
    2. Stellen Sie sicher, dass das Tier nach ca. 30 min Eintauchen vollständig beäpft wird, indem Sie den Schwanz fest zwischen Daumen und Zeigefinger kneifen. Voll anästhesierte Tiere reagieren nicht physisch auf eine Prise.
    3. Bereiten Sie eine Lösung des menschlichen Choriongonadotropins (HCG) mit 10.000 U/ml in steriler Saline vor.
    4. Mit einer 30 G Insulinspritze 0,15 CC HCG (1.500 Einheiten) in die Muskulatur dorsal in die Hinterseite des anästhesierten Weibchens in 45° Winkel zur Mittellinie injizieren, um den Kontakt mit dem Rückenmark zu vermeiden.
    5. Das Weibchen auf frische 40% Holtfreter-Lösung zurückgeben und in einen 8-12 °C-Kühlschrank geben.
    6. Nach 48 h das Weibchen auf Raumtemperatur zurückbringen. Legen Sie ein paar Steine oder Plastikpflanzen in ihren Behälter als Oberflächen für die Eiablage.
      HINWEIS: Weibchen, die mit HCG injiziert werden, legen oft leere Gelee-Hüllen für mehrere Stunden ab, bevor sie Eier legen.
    7. Entfernen Sie die Steine oder Kunststoffpflanzen, nachdem das Weibchen begonnen hat, konsequent Eier zu legen.
    8. Lassen Sie das Weibchen 30 min bis 1 h im leeren Tank sitzen.
      HINWEIS: Das Zurückhalten von Materialien, auf die das Tier Eier legen kann, ermöglicht eine strengere Kontrolle der Eizellensammlung.
  2. Männliche Gamete-Sammlung
    1. Während die Eiablage des Weibchens ins Stocken gerät, befeuchten Sie ein geschlechtsreifes GFP+ männliches Axolotl, um als Samenspender zu dienen, wie in Schritt 2.1.1.
    2. Legen Sie das voll befruchtete Männchen auf den Rücken auf feuchte Papiertücher unter einem Sezierendes Mikroskop.
    3. Wenn der Experimentator rechtshändig ist, positionieren Sie die Spitze einer P1000 Pipette mit der rechten Hand an der Basis der Kloake.
    4. Legen Sie den linken Zeigefinger und Daumen der linken Hand 2 x 3 cm rostral auf das Becken. Drücken Sie das Tier vorsichtig, während Sie die Finger in Richtung der Hinterbeine bewegen, um Spermien-Urinproben auszuspülen.
    5. Sammeln Sie jeden, der aus der Kloake gespült wird, in ein einzelnes Mikrozentrifugenrohr. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um 6 bis 10 Proben zu sammeln.
    6. Pipette 5,0 l von jeder Probe auf eine Petrischale, um die Qualität des Spermas mit einem invertierten Mikroskop zu überprüfen.
      HINWEIS: Konzentrierte Spermienproben sind eine milchige weiße Farbe, in der Regel reichen von 5 bis 20 L, und werden in der Regel nach mehreren, höhervolumigen Sperma Urinproben extrahiert extrahiert. Sperma sammelt sich an der Unterseite der Rohre in Proben mit höherem Volumen, wenn sie ungestört gelassen werden. Konzentrierte Proben von gesunden Spermien sind stark motil und verlieren Aktivität, wenn ihre Konzentration abnimmt. Gesunde Männchen können bis zu 50 l konzentrierte Spermien produzieren.
  3. Weibliche Gamete-Sammlung
    1. Nach Erhalt und Bestätigung einer gesunden Spermienprobe, befeuchten Sie das HCG-injizierte weibliche Axolotl wie in Schritt 2.1.1.
    2. Legen Sie das voll befruchtete Weibchen auf feuchte Papiertücher auf ihren Rücken.
    3. Extrahieren Sie unbefruchtete Eier aus dem Weibchen mit einer Handbewegung ähnlich der in Schritt 2.2.4.
    4. Sammeln Sie die Eier mit nassen Zangen und übertragen Sie sie in eine 10 cm Petrischale. Behandeln Sie Eier mit bestrahlten Spermien innerhalb von 15 min nach der Sammlung.
  4. Männliche Gametenvorbereitung und In-vitro-Aktivierung
    1. Verwenden Sie eine P10- oder P20-Pipette, um das Sperma nach oben und unten zu pipette, indem Sie die Klumpen auseinanderbrechen, um eine homogene Suspension zu bilden.
    2. Ungefährden Prozentsatz der motilen Spermien, indem sie einen 0,5-L-Tropfen unverdünnter Spermiensuspension auf einen Petrischalendeckel oder glasschiebeleiter legen und mit einem invertierten Mikroskop untersuchen.
    3. Fügen Sie 9,5 l von 0,1x Marcs modifizierter Ringer-Lösung (MMR; Materialtabelle) zu dieser Probe, um eine 20-fache Spermienverdünnung zu machen. Sanfte Pipette nach oben und unten zu mischen.
    4. Mit einem invertierten Mikroskop zählen Sie das Sperma in drei 1,0 L Tropfen des 20x verdünnten Aliquots auf einer Petrischalenabdeckung oder einem Hämozytometer, um die Spermienkonzentration der unverdünnten Suspension abzuschätzen.
    5. Bereiten Sie das Sperma für die Bestrahlung vor, indem Sie ein Aliquot der ursprünglichen Spermienprobe auf etwa 80.000 motile Zellen/ml in sterilen 0,1x MMR verdünnen.
    6. Zählen Sie die Anzahl der Innerhalb der letzten 15 min erhaltenen Eier. Fügen Sie 0,5 l des frisch verdünnten Spermas aus Schritt 2,4,5 pro Ei in eine Petrischale ein. Verwenden Sie die Pipettenspitze, um diese Aufhängung in eine 1 mm dicke Schicht zu verteilen.
    7. Mit einem Kunststofflift die Probe 4 cm von den Glühbirnen eines 254 nm Verklinkers abstellen. Die Spermien werden genetisch inaktiviert, indem die Probe mit 800.000 uJ/mm2bestrahlt wird.
    8. Mit einer P10-Pipette die Suspension auf die unbefruchteten Eier zu pipette, wobei jedes Ei mit 0,25 bis 0,5 L bestrahlten Spermien beschichtet wird. Lassen Sie die Eier bei Raumtemperatur für 30 min sitzen.
    9. Nach 30 min die Eier mit 0,1x MMR überfluten. Legen Sie die Eier sofort in einen 8-10 °C-Inkubator für Injektionen am nächsten Tag oder bei 18 °C für Injektionen innerhalb von 7 Stunden nach der Aktivierung (hpa).
    10. Dejelly Haploide mit scharfen Zangen 30 min nach Hydratation. Die Eier sofort in einen 8-10 °C-Inkubator für Injektionen am nächsten Tag oder bei 18 °C für Injektionen am selben Tag legen.

3. Haploid Mutagenese und Wartung

  1. CRISPR/Cas9 Mikroinjektionen
    1. Entwerfen Sie sgRNAs mit CRISPRscan und synthetisierenSie 26,27.
    2. Für Multiplex-Mutagenese einen Vorrat von 5 sgRNAs (10 ng/l für jede sgRNA) und Cas9-Protein (1 g/ l) zubereiten. Bereiten Sie eine 100-fache Verdünnung dieses Vorrats (0,1 ng/L pro sgRNA, 10 ng/L Cas9) zur Injektion vor. Für einzelne Gene, hochmutationsreiche Mutagenese, folgen Sie dem zuvor beschriebenen Protokoll28.
    3. Injizieren Sie haploide Embryonen im Einzelzellstadium 7 hpa, wenn sie bei 18 °C gelagert werden, oder injizieren Sie Embryonen am nächsten Tag im Stadium von 2 x 8 Zellen, wenn sie bei 8 bis 10 °C gelagert werden.
    4. Übertragen Sie die Embryonen auf 1,0x MMR mit 20% Polysucrose 400.
    5. Wenn Einzelzelle, injizieren Sie jeden Embryo mit einem 5 nL Tropfen der Injektionslösung (ca. 1/4 Radius der Eizelle), die eine Gesamtmasse von 0,5 pg/sgRNA und 50 pg Cas9-Protein enthält. Wenn multizellulär, verteilen Sie diese Masse, indem Sie kleinere Volumes in mehrere Zellen injizieren.
    6. Lassen Sie die Embryonen in der Polysukrose 400 für mindestens 4 h und maximal 18 h bei 18 °C heilen.
  2. Haploid Embryo Gehäuse
    1. Übertragen Sie die Embryonen auf 0,1x MMR mit Antibiotikum.
    2. Beherbergen Sie jeden Embryo in einem individuellen Brunnen einer 24-Well-Platte, da einige absterben oder sich ungewöhnlich entwickeln. Bei 16 bis 18 °C aufbewahren. Niedrigere Temperaturen können bei Bedarf verwendet werden, um die Entwicklung zu verlängern.
    3. Ersetzen Sie die Medien jeden zweiten Tag durch frische0,1x MMR durch Antibiotika-Antimykotik.

4. Diploid Host Embryo Vorbereitung

  1. Halten Sie Embryonen in der Geleebeschichtung bei 12 bis 16 °C, bis sie Stufe 22 bis 26 erreichen.
  2. Sammeln Sie die embryonen, die für die Transplantation bereit sind, legen Sie sie in ein Sieb (4 mm Maschenweite), und spülen Sie sie vorsichtig mit 40% Holtfreters Lösung.
  3. Übertragen Sie die Embryonen in filtersterilisierte 0,1x MMR mit 1,5% Bleichmittel für bis zu 2 min. Tauchen Sie die Embryonen vollständig in die Bleichlösung und wirbeln Sie sie sanft, um sicherzustellen, dass die Geleebeschichtung vollen Kontakt mit der Bleichlösung herstellt, um die Mikroben abzutöten an den Embryonen vorhanden sind.
  4. Nach 2 min die Bleichlösung, die die Embryonen enthält, mit einem gleichen Volumen von filtersterilisierten 0,1x MMR verdünnen.
  5. Gießen Sie die Embryonen vorsichtig in ein bleiches Sieb (4 mm Maschenweite) und spülen Sie die Embryonen fünfmal mit filtersterilisiert0,1x MMR.
  6. Die Embryonen in sterile 10 cm Petrischalen mit 0,1x MMR mit Antibiotika zur Entjellytung (Penicillin 100 Einheiten/ml, Streptomycin 100 g/l, 0,25 g/ml, Gentamicin 25 g/ml) geben.
  7. Entfernen Sie unter einem fluoreszierenden Stereomikroskop die Geleemäntel und Vitelline-Membranen von GFP+-Embryonen mit scharfen Zangen (Spitzenmaße 0,05 x 0,01 mm2).
  8. Übertragen Sie die GFP+ Embryonen auf eine neue Petrischale. Minimieren Sie die Menge an Flüssigkeit, die von der Petrischale übertragen wurde, wo sie dejellied wurden.
  9. Spülen Sie die GFP+ Wirtsembryonen mit sterilen 0,1x MMR mit Antibiotika vier- bis sechsmal, um Verunreinigungen zu entfernen.
  10. Die sauberen Embryonen vor der Pfropfung auf 4 °C legen.
    HINWEIS: Das Abkühlen der Embryonen macht sie steifer und sauberer, das Mesoderm vom Endoderm zu trennen.

5. Haploid-diploid Chimäre Generation

  1. Chirurgische Schale und Medienzubereitung
    1. Bereiten Sie sterile chirurgische Operationsschalen vor, indem Sie autoklavierte 2% Agarose in 0,1x MMR in sterile 35 mm leicht griffige Petrischalen gießen. Füllen Sie die Petrischalen auf halbem Weg mit Agarose.
    2. Nachdem die Agarose abgekühlt ist, verwenden Sie ein steriles Skalpell, um einen 25 mm langen, schrägen Trog in der Agarose zu schneiden, um die Embryonen an Ort und Stelle zu halten.
    3. Füllen Sie die Schale mit sterilen chirurgischen Medien (0,1x MMR mit Antimykoplasma 2,5 g/ml, Amphotericin B 0,25 g/ml und Ciprofloxacin 10,0 g/ml) und kühlen Sie bei 4 °C.
  2. Embryo-Transplantationsverfahren
    1. Legen Sie einen gesunden haploiden Spender mit einem oder zwei stufengleichen GFP+ diploiden Wirtsembryonen in den Trog der vorgekühlten Operationsschale, die chirurgische Medien enthält (Abbildung 3).
      HINWEIS: Führen Sie das Verfahren nach Möglichkeit auf einer Kühlstufe (10 °C oder niedriger) durch.
    2. Verwenden Sie zwei ultrafeine, autoklavierte Zangen (gerade Spitze, Spitzenmaße 0,05 x 0,02 mm2), um die Ektoderm- und Mesodermenschichten vom Wirt mit der Gliedmaßenknospe in der Nähe der Mitte zu entfernen (Abbildung 4).
      HINWEIS: Der rechteckige Gewebetransplantatbereich umfasst die Gliedmaßenknospe und erstreckt sich von der neunten Sospe bis zur hinteren Hälfte der Kiemenwölbung, etwa 2 mm, entlang der vorderen hinteren Achse. Entlang der dorsoventralen Achse erstreckt sich der transplantierte Bereich über ca. 1,5 mm, einschließlich der Soden bis knapp über den ventralen Rand der Kiemenwölbung. Der transplantierte Bereich umfasst alle seitlichen Plattenmesoderm und die seitlichen Hälften der Sos, ohne die zugrunde liegende Endoderm zu stören. Weitere Informationen finden Sie in Abbildung 4 und im dazugehörigen Video.
    3. Legen Sie das Wirtsgewebe beiseite und entfernen Sie ein gleichwertig großes Gewebeblatt aus dem haploiden Spender mit den gleichen Methoden.
    4. Legen Sie das haploide Spendergewebeblatt auf den entsprechenden Bereich des Spenderembryons.
    5. Sichern Sie das Gewebe, indem Sie es mit einer autoklavierten, rechteckigen Glasscherbe aus einem zerkleinerten Mikroskop bedecken Glas bedecken und sanft in den Wirtsembryonkörper drücken.
    6. Drehen Sie den haploiden Spender-Embryo auf seine andere Seite, um die Gliedmaßenknospe für den zweiten Wirtsembryon zu ernten. Wiederholen Sie die Schritte 5.2.2 bis 5.2.5.
    7. Entfernen Sie vorsichtig das verbleibende überschüssige Wirtsgewebe und den Spenderembryon aus der Schale.
    8. Lassen Sie die Transplantate mit den Glasscherben an Ort und Stelle für 60 bis 75 min, überprüfen Sie alle 20 min, um sicherzustellen, dass das Glas nicht abgerutscht ist.
    9. Nachdem die Gewebetransplantate vollständig haften, verwenden Sie die Zange, um die Glasscherben ankert langsam abzuziehen.
  3. Chimäre Wartung
    1. Übertragen Sie die transplantierten Embryonen auf frische chirurgische Medien und halten Sie sie über Nacht bei 8 bis 12 °C, um zu heilen. Individuell hausierte embryonale Embryonen in 12 oder 24-Well-Platten.
    2. Übertragen Sie die transplantierten Embryonen nach 36 bis 48 h auf steriles 0,1x MMR-Antimykotikum. Die starken Antibiotika in den chirurgischen Medien verursachen Toxizität bei transplantierten Embryonen nach 3 Tagen.
    3. Ersetzen Sie die Medien alle 2 bis 3 Tage durch frische 0,1x MMR und Antibiotika.
    4. Bewahren Sie die transplantierten Embryonen bei 18 °C auf, bis sie28füttern können.
    5. Nach 1 bis 2 Monaten Entwicklung und Pflege können haploide Gliedmaßen mit einem fluoreszierenden Dissektionsmikroskop auf Reinheit des Transplantats bewertet werden.
      HINWEIS: Das Vorhandensein von nicht-neuralen oder nicht-Blut-Wirt-abgeleiteten GFP-Gewebe in Gliedmaßen ist ein Indikator für unreine Transplantation und ist oft mit abnormaler Gliedmaßenentwicklung verbunden. Diese Tiere sollten von der weiteren Analyse ausgeschlossen werden.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Entwicklung von haploiden Embryonen kann von diploiden Embryonen durch ihren "haploiden Syndrom"-Phänotyp29unterschieden werden. Im Transplantatstadium weisen haploide Embryonen eine reduzierte Krümmung entlang der vorderen-hinteren Achse und ein unvollständiges Gehäuse des Dottersteckers auf (Abbildung 3A). Ein Fluoreszenzmikroskop kann verwendet werden, um sicherzustellen, dass haploide Embryonen frei von väterli...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Es gibt einige kritische Schritte in unserem Protokoll zur Erzeugung von haploid-diploiden Chimären, die der Betriebstechniker für konsistente Pfropfergebnisse berücksichtigen sollte.

Der wahrscheinlichste Grund für haploid-Generation zu scheitern ist aufgrund schlechter In-vitro-AktivierungBedingungen. Die richtigen Mengen an motilen Spermien müssen verwendet werden, um Eier zu aktivieren. Um die Beweglichkeit zu verlängern, sollten Spermienproben immer bei 4 °C gehalten werden. Bevor Sie ein...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Katherine Roberts für ihre Pflege der Axolotl-Kolonie. Die Finanzierung dieser Arbeit wurde vom Connecticut Innovations Regenerative Medicine Research Fund (15RMA-YALE-09 und 15-RMB-YALE-01) und dem Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (Individual Postdoctoral) bereitgestellt. Stipendium F32HD086942).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
#55 Dumont ForcepsFine Science Tools11295-1Nur Dumostar Material verwenden (autoklavierbar)
Amphotericin BSigma AldrichA2942-20ML20 mL
Antibiotikum-Antimykotikum 100xThermo Fisher15240062
CiprofloxacinSigma Aldrich17850-5G-F
Ficoll 400 (Polysaccharose 400)bioworld40600032-3Ficoll 400
GentamicinSigma AldrichG1914-250MG
Heiz-/KühlinkubatorRevSciRS-IF-233
Humanes ChoriongonadotropinMerkChorulon
Megascript T7 TranskriptionskitThermo FisherAM133440 Reaktionen
Miroskop KühlstufeBrook IndustriesCustom
Custom NLS Cas9 ProteinPNAbioCP01-2004 Fläschchen mit 50 & Mikro; g Protein pro
PlasmocinInvivogenant-mpt-1Behandlungslevel
Rezepte
(MMR)0,1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0,1 mM EDTA, 5 mM HEPES (pH 7,8), ph 7,4
40% Holtfreter-Lösung20 mM NaCl, 0,2 mM KCl, 0,8 mM NaHCO3, 0,2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH bis 7,4
1,0x Marc's modifizierte Ringer-Lösung

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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