In Situ-Überwachung von transient gebildeten molekularen Chaperon-Baugruppen in Bakterien, Hefe und menschlichen Zellen

Eine große Menge an genomischen Informationen bleibt aufgrund unseres unvollständigen Verständnisses von zellulären Interomen nicht interpretierbar. Herkömmliche Methoden zur Erkennung von Protein-Protein-Wechselwirkungen wie Protein-Co-Immunpräzipitation mit/ohne chemischer Vernetzung und Protein-Co-Lokalisierung stellen, obwohl weit verbreitet, eine Reihe von Nachteilen dar. Zu den Hauptnachteilen zählen eine schlechte Quantifizierung der Wechselwirkungen und die mögliche Einführung nicht nativer Bindungsereignisse. Im Vergleich dazu bieten neu entstehende, auf DerNähe basierende Techniken eine Alternative und einen leistungsstarken Ansatz zur Erfassung von Proteininteraktionen in Zellen. Der Proximity Ligation Assay (PLA)¹, der jetzt als proprietäres Kit erhältlich ist, verwendet Antikörper, um speziell auf Proteinkomplexe zu zielen, die auf der Nähe der interagierenden Untereinheiten basieren.

PLA wird durch die Bildung eines Gerüstes initiiert, das aus primären und sekundären Antikörpern mit kleinen DNA-Tags (PLA-Sonden) auf der Oberfläche des Zielproteinkomplexes besteht (Abbildung 1, Schritte 1-3). Als nächstes wird, bestimmt durch die Nähe der DNA-Tags, ein kreisförmiges DNA-Molekül durch Hybridisierung mit Konnekleotiden erzeugt (Abbildung1, Schritt 4). Die Bildung der kreisförmigen DNA wird durch einen DNA-Ligationsschritt abgeschlossen. Das neu gebildete kreisförmige DNA-Stück dient als Vorlage für die anschließende Rolling Circle Amplification (RCA)-basierte Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die durch eine der konjugierten Oligonukleotid-Tags grundiert ist. Dadurch entsteht ein einsträngiges konsoterisches DNA-Molekül, das über das Antikörpergerüst am Proteinkomplex befestigt ist (Abbildung1, Schritt 6). Das konthetomere DNA-Molekül wird mit fluoreszierend markierten Oligonukleotiden visualisiert, die zu mehreren einzigartigen Sequenzen hybridisieren, die über die verstärkte DNA verstreut sind (Abbildung 1, Schritt 7)². Das erzeugte PLA-Signal, das als fluoreszierender Punkt erscheint (Abbildung1, Schritt 7), entspricht der Position des Zielproteinkomplexes in der Zelle. Dadurch konnte der Assay Proteinkomplexe mit hoher räumlicher Genauigkeit erkennen. Die Technik beschränkt sich nicht nur auf die einfache Erfassung von Protein-Wechselwirkungen, sondern könnte auch verwendet werden, um einzelne Moleküle oder Proteinmodifikationen an Proteinen mit hoher Empfindlichkeit zu erkennen^1,2.

Hsp70 bildet ein äußerst vielseitiges Chaperonsystem, das für die Aufrechterhaltung der zellulären Proteinhomöostase von grundlegender Bedeutung ist, indem es an einer Reihe von Haushaltsführung und stressassoziierten Funktionen teilnimmt. Zu den Housekeeping-Aktivitäten des Hsp70-Chaperon-Systems gehören de novo Proteinfaltung, Proteintranslokation über Zellmembranen, Montage und Demontage von Proteinkomplexen, Regulierung der Proteinaktivität und Verknüpfung verschiedener Proteinfaltung/ Qualitätskontrollmaschinen³. Das gleiche Chaperonsystem faltet auch falsch gefaltete/entfaltete Proteine neu, verhindert die Proteinaggregation, fördert die Proteindisaggregation und kooperiert mit zellulären Proteasen, um endlos falsch gefaltete/geschädigte Proteine zu degradieren, um die Zellreparatur nach proteotoxische Belastungen^4,5. Um diese funktionale Vielfalt zu erreichen, setzt der Hsp70-Chaperon auf Partner-Chaperones der JDP-Familie und Nukleotid-Austauschfaktoren (NEFs), die die ATP-abhängige allosterische Kontrolle der Substratbindung und -freisetzung³, ⁶. Darüber hinaus spielen die JDP-Chaperones eine entscheidende Rolle bei der Auswahl von Substraten für dieses vielseitige Chaperon-System. Die Mitglieder dieser Familie sind in drei Klassen (A, B und C) unterteilt, basierend auf ihrer strukturellen Homologie zum Prototyp JDP, dem E. coli DnaJ. JDPs der Klasse A enthalten eine N-Terminal-J-Domäne, die mit Hsp70 interagiert, einer glyin-phenylalaninreichen Region, einer Substratbindungsregion, die aus einer Zinkfinger-ähnlichen Region (ZFLR) und zwei -barrel-Domänen besteht, und einer C-Terminal-Dimerisierungsdomäne. JDPs mit einer N-terminalen J-Domäne und einer glycin-phenylalaninreichen Region, aber ohne ZFLR, fallen in die Klasse B. Im Allgemeinen sind die Mitglieder dieser beiden Klassen an der Begleitung von Funktionen beteiligt. Mitglieder, die unter die Catchall-Klasse C fallen, die JDPs enthält, die nur die J-Domain⁴gemeinsam nutzen, rekrutieren Hsp70s, um eine Vielzahl von Nicht-Chaperoning-Funktionen auszuführen. Die wichtige Rolle von JDPs als austauschbare Substraterkennungs-"Adaptoren" des Hsp70-Systems spiegelt sich in einer Erweiterung der Familienmitglieder während der Evolution wider. Zum Beispiel haben Menschen über 42 verschiedene JDP-Mitglieder⁴. Diese JDPs fungieren als Monomere, Homodimere und/oder Homo/Hetero-Oligomere^4,5. Kürzlich eine funktionale Zusammenarbeit durch vorübergehende komplexe Bildung zwischen Klasse A (z.B. H. sapiens DNAJA2; S. cerevisiae Ydj1) und Klasse B (z. B. H. sapiens DNAJB1; S. cerevisiae Sis1) eukaryotische JDPs wurde berichtet, um eine effiziente Erkennung von amorphen Proteinaggregaten in vitro zu fördern^7,8. Diese JDP-Komplexe der gemischten Klasse versammeln sich vermutlich auf der Oberfläche aggregierter Proteine, um die Bildung von Hsp70- und Hsp70+Hsp100-basierten Protein-Disaggregasen^{7,8,9, 10}. Die kritischen Beweise für die Existenz dieser vorübergehend gebildeten JDP-Komplexe der gemischten Klasse in eukaryotischen Zellen wurden mit PLA⁸geliefert.

PLA wird zunehmend zur Bewertung von Proteinwechselwirkungen in Metazoen, vor allem in Säugetierzellen, eingesetzt. Hier berichten wir über die erfolgreiche Erweiterung dieser Technik zur Überwachung vorübergehend gebildeter Chaperonkomplexe in eukaryotischen und prokaryotischen einzelligen Organismen wie der angehenden Hefe S. cerevisiae und dem Bakterium E. coli. Wichtig ist, dass diese Erweiterung den potenziellen Einsatz von PLA bei der Erkennung und Analyse von Mikroben hervorhebt, die menschliche und tierische Zellen infizieren.

1. Hela Zellvorbereitung

1. Bereiten Sie folgende Materialien vor: PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄), pH 7.4; DMEM, ergänzt durch 10% FCS und 1% Pen-Strep; 4% Paraformaldehyd in PBS; 0,5% Triton-X100 in PBS; TBS-T (150 mM NaCl, 20 mM Tris, 0,05% Tween), pH 7,4; 0,0001% sterile Poly-L-Lysin-Lösung; 10-Well-Diagnose-Dias; eine feuchte Kammer; Tissuepapier; und Coplin-Dia-Färbegläser.
   HINWEIS: Um eine optimale Fixationseffizienz zu gewährleisten, sollten Paraformaldehydlösungen vor jedem Experiment frisch zubereitet werden.
2. Bereiten Sie eine feuchte Kammer vor, indem Sie den Boden einer geschlossenen Box mit Nassgewebe bedecken. Platzieren Sie die feuchte Kammer vor Beginn des Experiments bei 37 °C, um sicherzustellen, dass die Kammertemperatur bei 37 °C liegt, während Sie die enzymatischen Reaktionen inkubieren.
3. Kultur HeLa Zellen in T25-Flaschen, in 5 ml DMEM (Hohe Glukose, Glutamat und Natriumpyruvat ergänzt) ergänzt mit 10% FCS und 1% Pen-Strep, in einem 37 °C CO2-Inkubator mit 5% CO2 . Dissoziieren Sie anhantibe Zellen mit 0,05% Trypsin-EDTA. Nach Zugabe von frischem DMEM zu dissoziierten Zellen, zählen Zellen mit einer Zellzählkammer und wachsen auf diagnostischen Dias in einer feuchten Kammer.
4. Sterilisieren Sie diagnostische Dias durch UV-Bestrahlung in einer sterilen Zellkulturhaube für 30 min.
5. Fügen Sie jedem für das Experiment erforderlichen Brunnen 100 l sterilgefiltertes 0,0001% Poly-L-Lysin hinzu. 30 min inkubieren. Überschüssiges Poly-L-Lysin wegwaschen, indem Sie jeden Brunnen 3x mit 50 l Reinstwasser waschen.
6. Trypsinize die HeLa-Zellen und fügen Sie etwa 15.000 Zellen zu jedem Brunnen. Verdünnen Sie bei Bedarf die Zellen auf mindestens 30-50 l DMEM pro Brunnen.
7. Wachsen Sie Zellen in einer feuchten Kammer innerhalb eines 37 °C 5% CO2-Inkubatorfür etwa 24 h. Zellen sollten 60%–80% konfluent sein, bevor sie mit dem PLA zu beginnen.
   HINWEIS: Eine zu hohe Konfluenz verringert die Absorption von Reagenzien und verringert das erhaltene Signal am Ende des Protokolls.
8. Entfernen Sie das Medium, indem Sie ein Tissuepapier am Rand des Brunnens platzieren. Waschen Sie Brunnen 3x mit 50 l PBS.
   HINWEIS: Zellen werden abgelöst, wenn Flüssigkeiten hart zugegeben werden. Dies kann verhindert werden, indem die Brunnen nicht vollständig trocknen, bevor neue Flüssigkeit hinzugefügt wird, und indem die neue Flüssigkeit sanft an den Rand des Brunnens hinzugefügt wird.
9. Fixzellen, indem Sie jedem Brunnen 50 l frisch zubereitetes 4% Paraformaldehyd in PBS hinzufügen. 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
10. Schlitten 3x in PBS waschen. Führen Sie Waschungen in einem Coplin-Dia-Färbeglaser mit 100 ml PBS durch. Für jede Wäsche 5 min bei Raumtemperatur ohne Schütteln inkubieren.
11. Permeabilisieren Sie die Zellmembran, indem Sie die Dias in 100 ml von 0,5% Triton-X100 in PBS in einem Coplin-Dia-Färbeglaser untertauchen. 10 min bei Raumtemperatur ohne Schütteln inkubieren.
12. Schlitten 3x in TBS-T waschen. Führen Sie Waschungen in einem Coplin-Dia-Färbeglaser mit 100 ml TBS-T durch. Für jede Wäsche 5 min bei Raumtemperatur ohne Schütteln inkubieren.
13. Nach der letzten Wäsche den überschüssigen Puffer mit einem Tissuepapier entfernen. An dieser Stelle sind die Zellen bereit für das Proximity Ligation Assay Protokoll, das in Abschnitt 4 besprochen wird.

2. S. cerevisiae Zellvorbereitung

1. Bereiten Sie die folgenden Materialien vor: 100 mM KPO₄, pH 6.5, genannt Waschpuffer; 37% Formaldehyd; 4% Paraformaldehyd in 100 mM KPO₄, pH 6,5; 1,2 M Sorbitol in 100 mM KPO₄, pH 6,5; Lyticase-Lösung (500 g/ml Lyticase, 20 mM -Mercaptoethanol, 100 mM KPO₄, pH 6,5); 0,0001% Poly-L-Lysin-Lösung; 1% Triton-X100 in 100 mM KPO₄, pH 6.5; 10-Well-Diagnose-Dias; eine feuchte Kammer (zubereitet wie in Schritt 1.2); Tissuepapier; und Coplin-Dia-Färbegläser.
   HINWEIS: Um eine optimale Fixationseffizienz zu gewährleisten, sollten Paraformaldehydlösungen vor jedem Experiment frisch zubereitet werden.
2. Wachsen Sie eine Nachtkultur in nicht-selektiven Hefe-Extrakt, Pepton und Dextrose (YPD) Medium bei 30 °C beim Schütteln.
   HINWEIS: Je nach experimentellen Anforderungen können S. cerevisiae Zellen stattdessen in Synthetic Complete (SC) Medium oder selektivsyntheticm Minimal (SM) Medium angebaut werden.
3. Verdünnen Sie die stationäre Kultur auf eine OD₆₀₀ von 0,1 in 20 ml Medium. Wachsen Sie die Zellen bei 30 °C beim Schütteln, bis die OD₆₀₀ 0,5 erreicht.
4. Übertragen Sie die 20 ml-Kultur auf ein 50 ml Zentrifugenrohr. Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 665 x g für 3 min. Entfernen Sie den Überstand. Setzen Sie die Zellen in 5 ml frischem Medium aus.
5. Fixieren Sie die Zellen, indem Sie der Kultur 550 L 37% Formaldehyd hinzufügen. Bei Raumtemperatur für 15 min inkubieren.
6. Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 665 x g für 3 min. Entfernen Sie den Überstand. Das Pellet in 1 ml frisch zubereitetem 4% Paraformaldehyd im Waschpuffer aussetzen. 45 min bei Raumtemperatur inkubieren.
7. Bereiten Sie während der Inkubation die Diagnosedias vor, indem Sie jedem Brunnen 100 L 0,01 % Poly-L-Lysin-Lösung hinzufügen. Inkubieren Sie die Dias für 30 min bei Raumtemperatur.
8. Nach 30 min überschüssiges Poly-L-Lysin mit Reinstwasser abwaschen und die Dias an der Luft trocknen lassen. Die Trockenschlitten sind einsatzbereit.
9. Waschen Sie Zellen zweimal mit 1 ml Waschpuffer. Waschen Sie die Zellen 3 min durch Zentrifugieren der Zellen bei 665 x g. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen im Waschpuffer wieder auf.
10. Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 665 x g für 3 min. Entfernen Sie den Überstand. Setzen Sie die Zellen in 1 ml von 1,2 M Sorbitol in Wash Buffer aus.
11. Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 665 x g für 3 min. Entfernen Sie den Überstand. Setzen Sie das Pellet in 250 l frisch zubereiteter Lyticase-Lösung aus, um die Zellwand zu verdauen. Inkubieren Sie die Zellen in Lyticase-Lösung für 15 min bei 30 °C beim Schütteln.
12. Nach der Verdauung 3x durch Zentrifugation bei 665 x g 3 min waschen und den Überstand entfernen. Setzen Sie die Zellen in 250 l von 1,2 M Sorbitol im Waschpuffer wieder aus.
    HINWEIS: Da Zellen nach der Zellwandverdauung zerbrechlich sind, suspendieren Sie sie sehr sorgfältig, um die Zellen nicht zu beschädigen.
13. Fügen Sie den Poly-L-Lysin-beschichteten Dias 20 l resuspendierte Zellen hinzu. Lassen Sie sie 30 min an den Dias befestigen. Waschen Sie nicht haftende Zellen weg, indem Sie die Brunnen 3x mit 50 l Waschpuffer waschen.
14. Permeabilisieren Sie die Zellmembran, indem Sie 3x mit 50 l Von 1% Triton-X im Waschpuffer waschen.
    HINWEIS: An dieser Stelle sind die Zellen bereit für das Näherungsligations-Assay-Protokoll, das in Abschnitt 4 besprochen wird.

3. E. coli Zellvorbereitung

1. Bereiten Sie folgende Materialien vor: PBS-T (140 mM NaCl, 2 mM KCl, 8 mM K₂HPO₄, 1.5 mM KH₂PO₄, 0.05% Tween-20), pH 7.4; Lysozymlösung (2 mg/ml Lysozym, 25 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM Glukose, 10 mM EDTA); 0,0001% Poly-L-Lysin-Lösung; 99% eiskaltes Methanol; 99% Raumtemperatur Methanol; 99% Aceton; 10-Well-Diagnose-Dias; eine feuchte Kammer (zubereitet wie in Schritt 1.1.1); Tissuepapier; und Coplin-Dia-Färbegläser.
2. Wachsen Sie eine Nachtkultur in Luria-Bertani (LB) Medium bei 30 °C beim Schütteln.
3. Verdünnen Sie die stationäre Kultur auf eine OD₆₀₀ von 0,02 in frischem LB Medium. Wachsen Sie die Zellen bei 30 °C beim Schütteln, bis die OD₆₀₀ 0,4 für Logphasenzellen erreicht.
4. Etwa 15 min, bevor die Zellen eine OD₆₀₀ von 0,4 erreichen, bereiten Sie Poly-L-Lysin-beschichtete Dias vor, indem Sie jedem Bohrkörper 100 l 0,0001% Poly-L-Lysin hinzufügen. Inkubieren Sie die Dias für 30 min bei Raumtemperatur.
5. Nach 30 min überschüssiges Poly-L-Lysin mit Reinstwasser wegwaschen und die Rutsche an der Luft trocknen lassen. Die Trockenschlitten sind einsatzbereit.
6. Wenn die Zellen eine OD₆₀₀ von 0,4 erreichen, übertragen Sie 1 ml der Kultur in ein steriles Mikrozentrifugenrohr und Pelletzellen bei 2.650 x g für 2 min.
7. Resuspend Zellen in 50 l LB Medium.
8. Fixzellen durch Zugabe von 1 ml eiskaltem 99% Methanol. Mischen Sie sehr sanft von Hand. Inkubieren Sie Zellen für 30 min bei -20 °C.
9. Nach der Fixierung 20 l der Zellen zu den Poly-L-Lysin-beschichteten Dias hinzufügen. Lassen Sie die Rutschen 30 min trocknen.
10. Fügen Sie jedem Brunnen 50 l frisch zubereitete Lysozymlösung hinzu, um die Zellwand zu verdauen. In einer feuchten Kammer 30 min bei 25 °C inkubieren.
11. Entfernen Sie die Lysozym-Lösung aus den Brunnen, indem Sie ein Gewebepapier an den Rand des Brunnens hinzufügen. Schlitten 3x in 100 ml PBS-T waschen. Führen Sie jede Wäsche in einem Coplin-Schiebe-Färbungsglas für 30 s, ohne zu schütteln.
12. Entfernen Sie den Waschpuffer von den Dias, indem Sie auf die Dias auf einem Tissuepapier tippen.
13. Permeabilisieren Sie die Zellmembranen, indem Sie jedem Brunnen 50 l 99 % Methanol hinzufügen. 1 min bei Raumtemperatur inkubieren.
14. Entfernen Sie Methanol, indem Sie ein Tissuepapier an den Rand des Brunnens legen.
15. Fügen Sie jedem Brunnen 50 l 99% Aceton hinzu. Inkubieren Sie für 1 min.
16. Entfernen Sie überschüssiges Aceton, indem Sie ein Tissuepapier an den Rand des Brunnens legen. Lassen Sie die Dias trocknen. An dieser Stelle sind die Zellen bereit für das Näherungsligations-Assay-Protokoll, das in Abschnitt 4 besprochen wird.

4. Nähe Ligation Assay

1. Bereiten Sie die folgenden Materialien vor: Blockierpuffer; Antikörper-Verdünnungspuffer; Waschpuffer 'A' – (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20) pH 7.4; Waschpuffer 'B' – (200 mM Tris, 100 mM NaCl) pH 7.4; Anti-Rabbit Sekundärantikörper PLUS; Anti-Maus Sekundärantikörper MINUS; 5x Ligationspuffer; Ligase; 5x Amplifikationspuffer (Orange: s_ex 554 nm; s_em 576 nm); Polymerase; Reinstwasser; und Montagemedium, das DAPI enthält.
   ANMERKUNG: Die PLA-Detektionsreagenzien sind auch in den Varianten Grün (-_ex 495 nm; - 527 nm), Rot (-ex 594 nm; - ₆₂₄ nm), FarRed (ca. 644 nm; -_em 669 nm) oder Brightfield (Meerrettichperoxidase (HRP) erhältlich. konjugiert).
2. Blockieren Sie die Zellen, indem Sie jedem Brunnen einen Abwurf von Blockierpuffer hinzufügen. 30 min bei 37 °C in einer feuchten Kammer inkubieren.
3. Bereiten Sie Antikörperlösungen vor, indem Sie Dieantikörper im Antikörper-Verdünnungspuffer verdünnen. Für jeden Brunnen werden 40 l Antikörperlösung benötigt.
4. Entfernen Sie den Sperrpuffer, indem Sie ein Tissuepapier am Rand des Brunnens platzieren. Fügen Sie jedem Brunnen 40 L Antikörper, der in Antikörper-Verdünnungspuffer verdünnt ist, hinzu. 60 min in einer feuchten Kammer bei 37 °C oder über Nacht bei 4 °C inkubieren.
5. Entfernen Sie die Antikörperlösung aus den Brunnen, indem Sie ein Tissuepapier am Rand des Brunnens platzieren. Waschen Sie Dias 2x in 100 ml Waschpuffer 'A' in einem Coplin Slide-Färbungsglas für 5 min, ohne zu schütteln.
6. Während der Waschschritte 5x Sekundärantikörper-Sonden, Anti-Kaninchen PLUS & Anti-Maus-MINUS (die Spezifität der Sonden hängt von den primären Antikörpern ab), im Antikörper-Verdünnungspuffer. Bereiten Sie 40 l Antikörperlösung pro Brunnen vor.
7. Fügen Sie jedem Brunnen 40 L sekundäre Antikörperlösung hinzu. 60 min bei 37 °C in einer feuchten Kammer inkubieren.
8. Entfernen Sie die sekundäre Antikörperlösung aus den Brunnen, indem Sie ein Tissuepapier am Rand des Brunnens platzieren. Waschen Sie Dias 2x in 100 ml Waschpuffer 'A' in einem Coplin Slide-Färbungsglas für 5 min, ohne zu schütteln.
9. Während der Wähen bereiten Sie 40 l Ligationsmischung pro Bohrung vor, indem Sie 8 l 5x Ligationspuffer, 31 l Reinstwasser und 1 l Ligase mischen.
10. Fügen Sie jedem Brunnen 40 L Ligationsmischung hinzu. 30 min bei 37 °C in einer feuchten Kammer inkubieren.
11. Entfernen Sie Ligationsmischung aus den Brunnen, indem Sie ein Gewebepapier am Rand des Brunnens platzieren. Waschen Sie Dias 2x in 100 ml Waschpuffer 'A' in einem Coplin Slide-Färbungsglas für 2 min, ohne zu schütteln.
12. Während der Wähen bereiten Sie 40 l Amplifikationsmischung pro Bohrung vor, indem Sie 8 l 5-l-Amplifikationslösung, 31,5 l Reinstwasser und 0,5 l Polymerase mischen.
    HINWEIS: Die 5-fache Amplifikation enthält fluoreszierende Sonden. Schützen Sie diese Mischung vor Licht. Schützen Sie die Dias auch während der folgenden Schritte vor Licht. Wenn Sie transluzente Coplin-Gleitfleckengläser und feuchte Kammern verwenden, wickeln Sie sie in Aluminiumfolie.
13. Fügen Sie 40 l Amplifikationsmischung pro Brunnen hinzu. 100 min bei 37 °C in einer feuchten Kammer inkubieren.
14. Verstärkungsmischung aus den Brunnen entfernen. Waschen Sie Dias 2x in 100 ml Waschpuffer 'B' in einem Coplin Slide-Färbungsglas für 10 min ohne schütteln.
15. Waschen Sie Dias in 100 ml Waschpuffer 'B' verdünnt 1:100 in Reinstwasser in einem Coplin Gleitglas für 30 s.
16. Fügen Sie den Dias 20 L DAPI mit Montagemedium pro Bohrung hinzu. Schließen Sie Dias mit einem Deckel- und Dichtungsschlitten mit Nagellack.
17. Bei Bildgebung sofort DAPI mit Montagemedium für 10-15 min inkubieren, während vor Licht geschützt. Wenn nicht, lagern Sie die Dias bis zu 1 Woche bei -20 °C, geschützt vor Licht.

5. Erkennung

1. Verwenden Sie die konfokale Mikroskopie, um Bilder von HeLa-, S. cerevisiae- und E. coli-Zellen mit 20x/0.8 NA, 63x/1.4 NA bzw. 100x/1.4 NA Plan Apochromat Objektiven zu erfassen. Erregen Sie DNA-beflecktes DAPI mit einem 405 nm gepulsten Diodenlaser. Für das PLA-Signal (für diese Studie) begeistern Sie mit einem 561 nm Festkörperlaser.

Unsere früheren In-vitro-Studien mit gereinigten Proteinen zeigten, dass eine Teilmenge der JDPs der menschlichen Klasse A und B transiente JDP-Komplexe der gemischten Klasse bildet, um effizient auf eine breite Palette aggregierter Proteine zu zielen und möglicherweise die Montage von Hsp70-basierten Protein-Disaggregasen7. Wir verwendeten PLA, um festzustellen, ob JDP-Komplexe der gemischten Klasse (A+B) in menschlichen Gebärmutterhalskrebszellen (HeLa) vorkommen. Menschliche JDPs DNAJA2 (Klasse A) und DNAJB1 (Klasse B) wurden mit hochspezifischen primären Antikörpern und sekundären PLA-Sonden ins Visier genommen (Abbildung 2A-C). Das Auftreten von roten fluoreszierenden Punktzeichen deutete auf das Vorhandensein von DNAJA2- und DNAJB1-Komplexen der gemischten Klasse in HeLa-Zellen hin (Abbildung 2C), die unsere früheren biochemischen Befunde bestätigten7. Jedes Punktium stellt ein individuelles Protein-Interaktionsereignis in der HeLa-Zelle Cytosol/Kern dar.

Frühere biochemische Ergebnisse aus der Förster-Resonanzenergieübertragung (FRET), die Proteinwechselwirkungen als Auslesung der Energiemenge erkennt, die von einem angeregten Spenderfluorophor übertragen wird, das an ein Protein an ein geeignetes Akzeptorfluorophor gebunden ist. an das zweite Protein angefügt, deutete darauf hin, dass ähnliche Mischklassenkomplexe auch zwischen Hefe-JDPs auftreten könnten, in vitro8. In Bestätigung unserer biochemischen Befunde beobachteten wir die Bildung von Mischklassenkomplexen zwischen Ydj1 (Klasse A) und Sis1 (Klasse B) in einzelligen Eukaryoten S. cerevisiae (Bäckerhefe) Zellen mit PLA (Abbildung 2F). In Hefe, aufgrund ihrer kleinen Zellgröße und der Koaleszenz mehrerer Punktzeichen, könnten die einzelnen fluoreszierenden Punkte, die von PLA erzeugt werden, oft weniger unterscheidbar sein. Eine erhebliche Abnahme der fluoreszierenden Punktzeichenbildung wurde nach Knockout oder Knockdown interagierender JDPs sowohl in menschlichen als auch in Hefezellen8beobachtet, was die hohe Spezifität von PLA bei der Erfassung dieser Co-Chaperon-Komplexe in verschiedenen Zelltypen. Im Gegensatz zu ihren eukaryotischen Gegenstücken fehlten den prokaryotischen (E. coli) JDPs die Fähigkeit, JDP-Komplexe der gemischten Klasse zu bilden und funktionell zusammenzuarbeiten, um die Proteindisaggregation in vitro8zu fördern. In Übereinstimmung mit der biochemischen Analyse haben wir keine gemischte JDP-Komplexbildung zwischen bakteriellen DnaJ-YFP (Klasse A) und CbpA-mCherry (Klasse B), den einzigen JDPs in E. coli (Abbildung 2I), beobachtet. Unser PLA-Setup war jedoch in der Lage, andere Chaperon-Assemblys mit den beiden JDPs zu erfassen. Zum Beispiel haben wir Chaperonkomplexe zwischen DnaJ-YFP und DnaK (bakterielle Hsp70) (Abbildung 2L) und CbpA-mCherry und DnaK8 (Daten nicht gezeigt) entdeckt. Diese beiden bakteriellen Chaperonkomplexe sind sowohl in vitro als auch in vivo8,11,12 extensiv charakterisiert und bestätigen damit unsere PLA-Ergebnisse. Zusammen zeigen diese Beobachtungen die Fähigkeit von PLA, transient geformte Chaperon-Maschinen in einzelzellulären/multizellulären eukaryotischen und prokaryotischen Zellen robust einzufangen. Die technischen Kontrollen, die keinen primären Antikörper gegen einen der interagierenden JDPs/Chaperone enthielten, aber sowohl die Maus- als auch die Kaninchen-abgeleiteten sekundären PLA-Sonden enthielten, zeigten wenig bis gar kein Hintergrundfluoreszenzsignal (Abbildung2A,B,D,E,G,H, J,K) weist auf einen Mangel an falsch positiver Signalverstärkung in unserem Versuchsaufbau hin.

Abbildung 1: Schematische Darstellung der chronologischen Schritte des Proximity Ligation Assay. (1) Komplex zwischen Protein A und Protein B. (2) Bindung primärer (1°) Antikörper (grün und hellbraun) an die Proteine A und B. Die beiden primären Antikörper müssen in verschiedenen Wirtsarten (z. B. Maus, Kaninchen oder Ziege) aufgezogen werden. (3) Primäre Antikörper werden durch artspezifische sekundäre (2°) Antikörper erkannt, die kovalent mit DNA-Oligo-Tags (PLA-Sonden) befestigt sind. (4) Wenn die Proteine A und B komplex sind, befinden sich die gebundenen PLA-Sonden in unmittelbarer Nähe, um die DNA-Oligos zur Hybridisierung mit Verbinder-DNA-Strängen zu erleichtern, was zur Bildung eines kreisförmigen DNA-Moleküls führt. Anschließend erleichtert eine DNA-Ligase das Zusammenfügen von DNA-Strängen, indem sie die Bildung einer Phosphodiester-Bindung katalysiert. (5) Einleitung der Rolling Circle Amplification (RCA) des kreisförmigen DNA-Moleküls durch eine bakterielle DNA-Polymerase bei 37°C. Die RCA-Reaktion wird durch eine der antikörperkonjugierten DNA-Oligo-Tags grundiert. (6) Erzeugung eines einsträngigen konatemsternischen DNA-Moleküls, das an einem der sekundären Antikörper befestigt ist. (7) Hybridisierung fluoreszierend markierter komplementärer Oligonukleotid-Sonden zu einer einzigartigen sich wiederholenden Sequenz im konskonatemerischen DNA-Molekül. Nach dem Hybridisierungsschritt konnte das konsopiräre DNA-Molekül als heller fluoreszierender Punkt an der Stelle des Zielproteinkomplexes in festen Zellen visualisiert werden. Unten bezeichnen die prokaryotischen und eukaryotischen Zelltypen, in denen die PLA-Technik anwendbar ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2. Molekulare Chaperon-Baugruppen, die von PLA in prokaryotischen und eukaryotischen Zellen gefangen werden. (A-C) Nachweis von JDP-Komplexen der gemischten Klasse, die zwischen DNAJA2 (Klasse A) und DNAJB1 (Klasse B) in der menschlichen Gebärmutterhalskrebs-Zelllinie HeLa gebildet wurden. PLA mit (A) Anti-DNAJA2 Antikörper allein durchgeführt (negative technische Kontrolle); (B) Anti-DNAJB1-Antikörper allein (negative technische Kontrolle); (C) Anti-DNAJB1- und Anti-DNAJA2-Antikörper zusammen. Das Auftreten mehrerer fluoreszierender Punkte in Panel C (positives Signal) zeigt das Vorhandensein von Proteinkomplexen, die zwischen DNAJA2 und DNAJB1 gebildet werden. Jeder rote fluoreszierende Punkt/Punktktum stellt eine einzelne Wechselwirkung dar. Kerne (DNA) mit DAPI (Cyan) gefärbt. (D-F) Detektion von JDP-Komplexen der gemischten Klasse, die zwischen Ydj1 (Klasse A) und Sis1 (Klasse B) in S. cerevisiae-Zellen gebildet wurden. (D) PLA mit Anti-Ydj1-Antikörper allein durchgeführt (negative technische Kontrolle); (E) PLA mit Anti-Sis1-Antikörper allein durchgeführt (negative technische Kontrolle); (F) PLA mit Anti-Ydj1- und Anti-Sis1-Antikörpern zusammen durchgeführt. Das positive fluoreszierende Signal bezeichnet das Vorhandensein von Ydj1- und Sis1-Komplexen in S. cerevisiae. Hefekerne mit DAPI (Cyan) gebeizt. (G-L) Nachweis von Chaperonkomplexen, die zwischen prokaryotischen Hsp70 (DnaK) und JDPs (DnaJ und CbpA) in E. coli-Zellen gebildet wurden. Aufgrund des Fehlens spezifischer primärer Antikörper gegen prokaryotische JDPs wurden die E. coli DnaJ (Klasse A) und CbpA (Klasse B) mit YFP bzw. mCherry getaggt. (G, J) PLA durchgeführt mit Anti-YFP allein (negative technische Kontrolle); (H) PLA durchgeführt mit Anti-mCherry allein (negative technische Kontrolle). (I) PLA mit Anti-YFP und Anti-MCherry Antikörper durchgeführt. Der Mangel an fluoreszierender Punktbildung deutet auf keine komplexe Bildung zwischen DnaJ und CbpA hin. (K) PLA mit Anti-DnaK-Antikörper allein durchgeführt (negative technische Kontrolle). (L) PLA mit Anti-YFP- und Anti-DnaK-Antikörpern zusammen durchgeführt. Das positive Fluoreszenzsignal weist auf eine komplexe Bildung zwischen DnaK und DnaJ hin. Bakterielle DNA mit DAPI (Cyan) gebeizt. Neben einem einzigen Primärantikörper wurden alle negativen technischen Kontrollen in Gegenwart der jeweiligen sekundären PLA-Sonden durchgeführt. Skalenbalken = 10 m.

Die Autoren haben nichts zu verraten.