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Methodenartikel

In Situ-Überwachung von transient gebildeten molekularen Chaperon-Baugruppen in Bakterien, Hefe und menschlichen Zellen

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DOI:

10.3791/60172

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2. September 2019

 ,  , 
1Department of Biomedical Sciences of Cells & Systems, University of Groningen, 2Department of Anatomy, Faculty of Medicine, University of Colombo, 3Australian Regenerative Medicine Institute (ARMI), Monash University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Cognate J-Domain-Proteine arbeiten mit dem Hsp70-Chaperon zusammen, um eine Vielzahl biologischer Prozesse zu unterstützen, die von der Proteinfaltung bis zum Abbau reichen. Hier beschreiben wir einen in situ-Näheligationstest, der die Überwachung dieser vorübergehend gebildeten Chaperon-Maschinen in Bakterien-, Hefe- und menschlichen Zellen ermöglicht.

Zusammenfassung

J-Domain-Proteine (JDPs) bilden die größte und vielfältigste Co-Chaperone-Familie in eukaryotischen Zellen. Jüngste Ergebnisse zeigen, dass bestimmte Mitglieder der JDP-Familie vorübergehende Heterokomplexe in Eukaryoten bilden könnten, um die Substratauswahl für das 70 kDa-Wärmeschockprotein (Hsp70) auf Chaperon-Basis zu optimieren. Die JDP-Komplexe zielen auf akute/chronische stressinduzierte aggregierte Proteine ab und helfen vermutlich, die Disaggregasen zusammenzusetzen, indem sie mehrere Hsp70s an die Oberfläche von Proteinaggregaten rekrutieren. Das Ausmaß des Proteinqualitätskontrollnetzwerks (PQC), das durch diese physikalisch interagierenden JDPs gebildet wird, bleibt in vivo weitgehend uncharakterisiert. Hier beschreiben wir einen mikroskopiebasierten In-situ-Protein-Interaktionstest namens Proximity Ligation Assay (PLA), der in der Lage ist, diese transient gebildeten Chaperonkomplexe in verschiedenen zellulären Kompartimenten eukaryotischer Zellen robust einzufangen. Unsere Arbeit erweitert den Einsatz von PLA von menschlichen Zellen auf Hefe (Saccharomyces cerevisiae) und Bakterien (Escherichia coli), wodurch ein wichtiges Werkzeug zur Überwachung der Dynamik von transient gebildeten Protein-Baugruppen in beiden prokaryotischen und eukaryotischen Zellen.

Einleitung

Eine große Menge an genomischen Informationen bleibt aufgrund unseres unvollständigen Verständnisses von zellulären Interomen nicht interpretierbar. Herkömmliche Methoden zur Erkennung von Protein-Protein-Wechselwirkungen wie Protein-Co-Immunpräzipitation mit/ohne chemischer Vernetzung und Protein-Co-Lokalisierung stellen, obwohl weit verbreitet, eine Reihe von Nachteilen dar. Zu den Hauptnachteilen zählen eine schlechte Quantifizierung der Wechselwirkungen und die mögliche Einführung nicht nativer Bindungsereignisse. Im Vergleich dazu bieten neu entstehende, auf DerNähe basierende Techniken eine Alternative und einen leistungsstarken Ansatz zur Erfassung von Proteininteraktionen in Zellen. Der Proximity Ligation Assay (PLA)1, der jetzt als proprietäres Kit erhältlich ist, verwendet Antikörper, um speziell auf Proteinkomplexe zu zielen, die auf der Nähe der interagierenden Untereinheiten basieren.

PLA wird durch die Bildung eines Gerüstes initiiert, das aus primären und sekundären Antikörpern mit kleinen DNA-Tags (PLA-Sonden) auf der Oberfläche des Zielproteinkomplexes besteht (Abbildung 1, Schritte 1-3). Als nächstes wird, bestimmt durch die Nähe der DNA-Tags, ein kreisförmiges DNA-Molekül durch Hybridisierung mit Konnekleotiden erzeugt (Abbildung1, Schritt 4). Die Bildung der kreisförmigen DNA wird durch einen DNA-Ligationsschritt abgeschlossen. Das neu gebildete kreisförmige DNA-Stück dient als Vorlage für die anschließende Rolling Circle Amplification (RCA)-basierte Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die durch eine der konjugierten Oligonukleotid-Tags grundiert ist. Dadurch entsteht ein einsträngiges konsoterisches DNA-Molekül, das über das Antikörpergerüst am Proteinkomplex befestigt ist (Abbildung1, Schritt 6). Das konthetomere DNA-Molekül wird mit fluoreszierend markierten Oligonukleotiden visualisiert, die zu mehreren einzigartigen Sequenzen hybridisieren, die über die verstärkte DNA verstreut sind (Abbildung 1, Schritt 7)2. Das erzeugte PLA-Signal, das als fluoreszierender Punkt erscheint (Abbildung1, Schritt 7), entspricht der Position des Zielproteinkomplexes in der Zelle. Dadurch konnte der Assay Proteinkomplexe mit hoher räumlicher Genauigkeit erkennen. Die Technik beschränkt sich nicht nur auf die einfache Erfassung von Protein-Wechselwirkungen, sondern könnte auch verwendet werden, um einzelne Moleküle oder Proteinmodifikationen an Proteinen mit hoher Empfindlichkeit zu erkennen1,2.

Hsp70 bildet ein äußerst vielseitiges Chaperonsystem, das für die Aufrechterhaltung der zellulären Proteinhomöostase von grundlegender Bedeutung ist, indem es an einer Reihe von Haushaltsführung und stressassoziierten Funktionen teilnimmt. Zu den Housekeeping-Aktivitäten des Hsp70-Chaperon-Systems gehören de novo Proteinfaltung, Proteintranslokation über Zellmembranen, Montage und Demontage von Proteinkomplexen, Regulierung der Proteinaktivität und Verknüpfung verschiedener Proteinfaltung/ Qualitätskontrollmaschinen3. Das gleiche Chaperonsystem faltet auch falsch gefaltete/entfaltete Proteine neu, verhindert die Proteinaggregation, fördert die Proteindisaggregation und kooperiert mit zellulären Proteasen, um endlos falsch gefaltete/geschädigte Proteine zu degradieren, um die Zellreparatur nach proteotoxische Belastungen4,5. Um diese funktionale Vielfalt zu erreichen, setzt der Hsp70-Chaperon auf Partner-Chaperones der JDP-Familie und Nukleotid-Austauschfaktoren (NEFs), die die ATP-abhängige allosterische Kontrolle der Substratbindung und -freisetzung3, 6. Darüber hinaus spielen die JDP-Chaperones eine entscheidende Rolle bei der Auswahl von Substraten für dieses vielseitige Chaperon-System. Die Mitglieder dieser Familie sind in drei Klassen (A, B und C) unterteilt, basierend auf ihrer strukturellen Homologie zum Prototyp JDP, dem E. coli DnaJ. JDPs der Klasse A enthalten eine N-Terminal-J-Domäne, die mit Hsp70 interagiert, einer glyin-phenylalaninreichen Region, einer Substratbindungsregion, die aus einer Zinkfinger-ähnlichen Region (ZFLR) und zwei -barrel-Domänen besteht, und einer C-Terminal-Dimerisierungsdomäne. JDPs mit einer N-terminalen J-Domäne und einer glycin-phenylalaninreichen Region, aber ohne ZFLR, fallen in die Klasse B. Im Allgemeinen sind die Mitglieder dieser beiden Klassen an der Begleitung von Funktionen beteiligt. Mitglieder, die unter die Catchall-Klasse C fallen, die JDPs enthält, die nur die J-Domain4gemeinsam nutzen, rekrutieren Hsp70s, um eine Vielzahl von Nicht-Chaperoning-Funktionen auszuführen. Die wichtige Rolle von JDPs als austauschbare Substraterkennungs-"Adaptoren" des Hsp70-Systems spiegelt sich in einer Erweiterung der Familienmitglieder während der Evolution wider. Zum Beispiel haben Menschen über 42 verschiedene JDP-Mitglieder4. Diese JDPs fungieren als Monomere, Homodimere und/oder Homo/Hetero-Oligomere4,5. Kürzlich eine funktionale Zusammenarbeit durch vorübergehende komplexe Bildung zwischen Klasse A (z.B. H. sapiens DNAJA2; S. cerevisiae Ydj1) und Klasse B (z. B. H. sapiens DNAJB1; S. cerevisiae Sis1) eukaryotische JDPs wurde berichtet, um eine effiziente Erkennung von amorphen Proteinaggregaten in vitro zu fördern7,8. Diese JDP-Komplexe der gemischten Klasse versammeln sich vermutlich auf der Oberfläche aggregierter Proteine, um die Bildung von Hsp70- und Hsp70+Hsp100-basierten Protein-Disaggregasen7,8,9, 10. Die kritischen Beweise für die Existenz dieser vorübergehend gebildeten JDP-Komplexe der gemischten Klasse in eukaryotischen Zellen wurden mit PLA8geliefert.

PLA wird zunehmend zur Bewertung von Proteinwechselwirkungen in Metazoen, vor allem in Säugetierzellen, eingesetzt. Hier berichten wir über die erfolgreiche Erweiterung dieser Technik zur Überwachung vorübergehend gebildeter Chaperonkomplexe in eukaryotischen und prokaryotischen einzelligen Organismen wie der angehenden Hefe S. cerevisiae und dem Bakterium E. coli. Wichtig ist, dass diese Erweiterung den potenziellen Einsatz von PLA bei der Erkennung und Analyse von Mikroben hervorhebt, die menschliche und tierische Zellen infizieren.

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Protokoll

1. Hela Zellvorbereitung

  1. Bereiten Sie folgende Materialien vor: PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4), pH 7.4; DMEM, ergänzt durch 10% FCS und 1% Pen-Strep; 4% Paraformaldehyd in PBS; 0,5% Triton-X100 in PBS; TBS-T (150 mM NaCl, 20 mM Tris, 0,05% Tween), pH 7,4; 0,0001% sterile Poly-L-Lysin-Lösung; 10-Well-Diagnose-Dias; eine feuchte Kammer; Tissuepapier; und Coplin-Dia-Färbegläser.
    HINWEIS: Um eine optimale Fixationseffizienz zu gewährleisten, sollten Paraformaldehydlösungen vor jedem Experiment frisch zubereitet werden.
  2. Bereiten Sie eine feuchte Kammer vor, indem Sie den Boden einer geschlossenen Box mit Nassgewebe bedecken. Platzieren Sie die feuchte Kammer vor Beginn des Experiments bei 37 °C, um sicherzustellen, dass die Kammertemperatur bei 37 °C liegt, während Sie die enzymatischen Reaktionen inkubieren.
  3. Kultur HeLa Zellen in T25-Flaschen, in 5 ml DMEM (Hohe Glukose, Glutamat und Natriumpyruvat ergänzt) ergänzt mit 10% FCS und 1% Pen-Strep, in einem 37 °C CO2-Inkubator mit 5% CO2 . Dissoziieren Sie anhantibe Zellen mit 0,05% Trypsin-EDTA. Nach Zugabe von frischem DMEM zu dissoziierten Zellen, zählen Zellen mit einer Zellzählkammer und wachsen auf diagnostischen Dias in einer feuchten Kammer.
  4. Sterilisieren Sie diagnostische Dias durch UV-Bestrahlung in einer sterilen Zellkulturhaube für 30 min.
  5. Fügen Sie jedem für das Experiment erforderlichen Brunnen 100 l sterilgefiltertes 0,0001% Poly-L-Lysin hinzu. 30 min inkubieren. Überschüssiges Poly-L-Lysin wegwaschen, indem Sie jeden Brunnen 3x mit 50 l Reinstwasser waschen.
  6. Trypsinize die HeLa-Zellen und fügen Sie etwa 15.000 Zellen zu jedem Brunnen. Verdünnen Sie bei Bedarf die Zellen auf mindestens 30-50 l DMEM pro Brunnen.
  7. Wachsen Sie Zellen in einer feuchten Kammer innerhalb eines 37 °C 5% CO2-Inkubatorfür etwa 24 h. Zellen sollten 60%–80% konfluent sein, bevor sie mit dem PLA zu beginnen.
    HINWEIS: Eine zu hohe Konfluenz verringert die Absorption von Reagenzien und verringert das erhaltene Signal am Ende des Protokolls.
  8. Entfernen Sie das Medium, indem Sie ein Tissuepapier am Rand des Brunnens platzieren. Waschen Sie Brunnen 3x mit 50 l PBS.
    HINWEIS: Zellen werden abgelöst, wenn Flüssigkeiten hart zugegeben werden. Dies kann verhindert werden, indem die Brunnen nicht vollständig trocknen, bevor neue Flüssigkeit hinzugefügt wird, und indem die neue Flüssigkeit sanft an den Rand des Brunnens hinzugefügt wird.
  9. Fixzellen, indem Sie jedem Brunnen 50 l frisch zubereitetes 4% Paraformaldehyd in PBS hinzufügen. 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  10. Schlitten 3x in PBS waschen. Führen Sie Waschungen in einem Coplin-Dia-Färbeglaser mit 100 ml PBS durch. Für jede Wäsche 5 min bei Raumtemperatur ohne Schütteln inkubieren.
  11. Permeabilisieren Sie die Zellmembran, indem Sie die Dias in 100 ml von 0,5% Triton-X100 in PBS in einem Coplin-Dia-Färbeglaser untertauchen. 10 min bei Raumtemperatur ohne Schütteln inkubieren.
  12. Schlitten 3x in TBS-T waschen. Führen Sie Waschungen in einem Coplin-Dia-Färbeglaser mit 100 ml TBS-T durch. Für jede Wäsche 5 min bei Raumtemperatur ohne Schütteln inkubieren.
  13. Nach der letzten Wäsche den überschüssigen Puffer mit einem Tissuepapier entfernen. An dieser Stelle sind die Zellen bereit für das Proximity Ligation Assay Protokoll, das in Abschnitt 4 besprochen wird.

2. S. cerevisiae Zellvorbereitung

  1. Bereiten Sie die folgenden Materialien vor: 100 mM KPO4, pH 6.5, genannt Waschpuffer; 37% Formaldehyd; 4% Paraformaldehyd in 100 mM KPO4, pH 6,5; 1,2 M Sorbitol in 100 mM KPO4, pH 6,5; Lyticase-Lösung (500 g/ml Lyticase, 20 mM -Mercaptoethanol, 100 mM KPO4, pH 6,5); 0,0001% Poly-L-Lysin-Lösung; 1% Triton-X100 in 100 mM KPO4, pH 6.5; 10-Well-Diagnose-Dias; eine feuchte Kammer (zubereitet wie in Schritt 1.2); Tissuepapier; und Coplin-Dia-Färbegläser.
    HINWEIS: Um eine optimale Fixationseffizienz zu gewährleisten, sollten Paraformaldehydlösungen vor jedem Experiment frisch zubereitet werden.
  2. Wachsen Sie eine Nachtkultur in nicht-selektiven Hefe-Extrakt, Pepton und Dextrose (YPD) Medium bei 30 °C beim Schütteln.
    HINWEIS: Je nach experimentellen Anforderungen können S. cerevisiae Zellen stattdessen in Synthetic Complete (SC) Medium oder selektivsyntheticm Minimal (SM) Medium angebaut werden.
  3. Verdünnen Sie die stationäre Kultur auf eine OD600 von 0,1 in 20 ml Medium. Wachsen Sie die Zellen bei 30 °C beim Schütteln, bis die OD600 0,5 erreicht.
  4. Übertragen Sie die 20 ml-Kultur auf ein 50 ml Zentrifugenrohr. Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 665 x g für 3 min. Entfernen Sie den Überstand. Setzen Sie die Zellen in 5 ml frischem Medium aus.
  5. Fixieren Sie die Zellen, indem Sie der Kultur 550 L 37% Formaldehyd hinzufügen. Bei Raumtemperatur für 15 min inkubieren.
  6. Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 665 x g für 3 min. Entfernen Sie den Überstand. Das Pellet in 1 ml frisch zubereitetem 4% Paraformaldehyd im Waschpuffer aussetzen. 45 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  7. Bereiten Sie während der Inkubation die Diagnosedias vor, indem Sie jedem Brunnen 100 L 0,01 % Poly-L-Lysin-Lösung hinzufügen. Inkubieren Sie die Dias für 30 min bei Raumtemperatur.
  8. Nach 30 min überschüssiges Poly-L-Lysin mit Reinstwasser abwaschen und die Dias an der Luft trocknen lassen. Die Trockenschlitten sind einsatzbereit.
  9. Waschen Sie Zellen zweimal mit 1 ml Waschpuffer. Waschen Sie die Zellen 3 min durch Zentrifugieren der Zellen bei 665 x g. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen im Waschpuffer wieder auf.
  10. Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 665 x g für 3 min. Entfernen Sie den Überstand. Setzen Sie die Zellen in 1 ml von 1,2 M Sorbitol in Wash Buffer aus.
  11. Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 665 x g für 3 min. Entfernen Sie den Überstand. Setzen Sie das Pellet in 250 l frisch zubereiteter Lyticase-Lösung aus, um die Zellwand zu verdauen. Inkubieren Sie die Zellen in Lyticase-Lösung für 15 min bei 30 °C beim Schütteln.
  12. Nach der Verdauung 3x durch Zentrifugation bei 665 x g 3 min waschen und den Überstand entfernen. Setzen Sie die Zellen in 250 l von 1,2 M Sorbitol im Waschpuffer wieder aus.
    HINWEIS: Da Zellen nach der Zellwandverdauung zerbrechlich sind, suspendieren Sie sie sehr sorgfältig, um die Zellen nicht zu beschädigen.
  13. Fügen Sie den Poly-L-Lysin-beschichteten Dias 20 l resuspendierte Zellen hinzu. Lassen Sie sie 30 min an den Dias befestigen. Waschen Sie nicht haftende Zellen weg, indem Sie die Brunnen 3x mit 50 l Waschpuffer waschen.
  14. Permeabilisieren Sie die Zellmembran, indem Sie 3x mit 50 l Von 1% Triton-X im Waschpuffer waschen.
    HINWEIS: An dieser Stelle sind die Zellen bereit für das Näherungsligations-Assay-Protokoll, das in Abschnitt 4 besprochen wird.

3. E. coli Zellvorbereitung

  1. Bereiten Sie folgende Materialien vor: PBS-T (140 mM NaCl, 2 mM KCl, 8 mM K2HPO4, 1.5 mM KH2PO4, 0.05% Tween-20), pH 7.4; Lysozymlösung (2 mg/ml Lysozym, 25 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM Glukose, 10 mM EDTA); 0,0001% Poly-L-Lysin-Lösung; 99% eiskaltes Methanol; 99% Raumtemperatur Methanol; 99% Aceton; 10-Well-Diagnose-Dias; eine feuchte Kammer (zubereitet wie in Schritt 1.1.1); Tissuepapier; und Coplin-Dia-Färbegläser.
  2. Wachsen Sie eine Nachtkultur in Luria-Bertani (LB) Medium bei 30 °C beim Schütteln.
  3. Verdünnen Sie die stationäre Kultur auf eine OD600 von 0,02 in frischem LB Medium. Wachsen Sie die Zellen bei 30 °C beim Schütteln, bis die OD600 0,4 für Logphasenzellen erreicht.
  4. Etwa 15 min, bevor die Zellen eine OD600 von 0,4 erreichen, bereiten Sie Poly-L-Lysin-beschichtete Dias vor, indem Sie jedem Bohrkörper 100 l 0,0001% Poly-L-Lysin hinzufügen. Inkubieren Sie die Dias für 30 min bei Raumtemperatur.
  5. Nach 30 min überschüssiges Poly-L-Lysin mit Reinstwasser wegwaschen und die Rutsche an der Luft trocknen lassen. Die Trockenschlitten sind einsatzbereit.
  6. Wenn die Zellen eine OD600 von 0,4 erreichen, übertragen Sie 1 ml der Kultur in ein steriles Mikrozentrifugenrohr und Pelletzellen bei 2.650 x g für 2 min.
  7. Resuspend Zellen in 50 l LB Medium.
  8. Fixzellen durch Zugabe von 1 ml eiskaltem 99% Methanol. Mischen Sie sehr sanft von Hand. Inkubieren Sie Zellen für 30 min bei -20 °C.
  9. Nach der Fixierung 20 l der Zellen zu den Poly-L-Lysin-beschichteten Dias hinzufügen. Lassen Sie die Rutschen 30 min trocknen.
  10. Fügen Sie jedem Brunnen 50 l frisch zubereitete Lysozymlösung hinzu, um die Zellwand zu verdauen. In einer feuchten Kammer 30 min bei 25 °C inkubieren.
  11. Entfernen Sie die Lysozym-Lösung aus den Brunnen, indem Sie ein Gewebepapier an den Rand des Brunnens hinzufügen. Schlitten 3x in 100 ml PBS-T waschen. Führen Sie jede Wäsche in einem Coplin-Schiebe-Färbungsglas für 30 s, ohne zu schütteln.
  12. Entfernen Sie den Waschpuffer von den Dias, indem Sie auf die Dias auf einem Tissuepapier tippen.
  13. Permeabilisieren Sie die Zellmembranen, indem Sie jedem Brunnen 50 l 99 % Methanol hinzufügen. 1 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  14. Entfernen Sie Methanol, indem Sie ein Tissuepapier an den Rand des Brunnens legen.
  15. Fügen Sie jedem Brunnen 50 l 99% Aceton hinzu. Inkubieren Sie für 1 min.
  16. Entfernen Sie überschüssiges Aceton, indem Sie ein Tissuepapier an den Rand des Brunnens legen. Lassen Sie die Dias trocknen. An dieser Stelle sind die Zellen bereit für das Näherungsligations-Assay-Protokoll, das in Abschnitt 4 besprochen wird.

4. Nähe Ligation Assay

  1. Bereiten Sie die folgenden Materialien vor: Blockierpuffer; Antikörper-Verdünnungspuffer; Waschpuffer 'A' – (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20) pH 7.4; Waschpuffer 'B' – (200 mM Tris, 100 mM NaCl) pH 7.4; Anti-Rabbit Sekundärantikörper PLUS; Anti-Maus Sekundärantikörper MINUS; 5x Ligationspuffer; Ligase; 5x Amplifikationspuffer (Orange: sex 554 nm; sem 576 nm); Polymerase; Reinstwasser; und Montagemedium, das DAPI enthält.
    ANMERKUNG: Die PLA-Detektionsreagenzien sind auch in den Varianten Grün (-ex 495 nm; - 527 nm), Rot (-ex 594 nm; - 624 nm), FarRed (ca. 644 nm; -em 669 nm) oder Brightfield (Meerrettichperoxidase (HRP) erhältlich. konjugiert).
  2. Blockieren Sie die Zellen, indem Sie jedem Brunnen einen Abwurf von Blockierpuffer hinzufügen. 30 min bei 37 °C in einer feuchten Kammer inkubieren.
  3. Bereiten Sie Antikörperlösungen vor, indem Sie Dieantikörper im Antikörper-Verdünnungspuffer verdünnen. Für jeden Brunnen werden 40 l Antikörperlösung benötigt.
  4. Entfernen Sie den Sperrpuffer, indem Sie ein Tissuepapier am Rand des Brunnens platzieren. Fügen Sie jedem Brunnen 40 L Antikörper, der in Antikörper-Verdünnungspuffer verdünnt ist, hinzu. 60 min in einer feuchten Kammer bei 37 °C oder über Nacht bei 4 °C inkubieren.
  5. Entfernen Sie die Antikörperlösung aus den Brunnen, indem Sie ein Tissuepapier am Rand des Brunnens platzieren. Waschen Sie Dias 2x in 100 ml Waschpuffer 'A' in einem Coplin Slide-Färbungsglas für 5 min, ohne zu schütteln.
  6. Während der Waschschritte 5x Sekundärantikörper-Sonden, Anti-Kaninchen PLUS & Anti-Maus-MINUS (die Spezifität der Sonden hängt von den primären Antikörpern ab), im Antikörper-Verdünnungspuffer. Bereiten Sie 40 l Antikörperlösung pro Brunnen vor.
  7. Fügen Sie jedem Brunnen 40 L sekundäre Antikörperlösung hinzu. 60 min bei 37 °C in einer feuchten Kammer inkubieren.
  8. Entfernen Sie die sekundäre Antikörperlösung aus den Brunnen, indem Sie ein Tissuepapier am Rand des Brunnens platzieren. Waschen Sie Dias 2x in 100 ml Waschpuffer 'A' in einem Coplin Slide-Färbungsglas für 5 min, ohne zu schütteln.
  9. Während der Wähen bereiten Sie 40 l Ligationsmischung pro Bohrung vor, indem Sie 8 l 5x Ligationspuffer, 31 l Reinstwasser und 1 l Ligase mischen.
  10. Fügen Sie jedem Brunnen 40 L Ligationsmischung hinzu. 30 min bei 37 °C in einer feuchten Kammer inkubieren.
  11. Entfernen Sie Ligationsmischung aus den Brunnen, indem Sie ein Gewebepapier am Rand des Brunnens platzieren. Waschen Sie Dias 2x in 100 ml Waschpuffer 'A' in einem Coplin Slide-Färbungsglas für 2 min, ohne zu schütteln.
  12. Während der Wähen bereiten Sie 40 l Amplifikationsmischung pro Bohrung vor, indem Sie 8 l 5-l-Amplifikationslösung, 31,5 l Reinstwasser und 0,5 l Polymerase mischen.
    HINWEIS: Die 5-fache Amplifikation enthält fluoreszierende Sonden. Schützen Sie diese Mischung vor Licht. Schützen Sie die Dias auch während der folgenden Schritte vor Licht. Wenn Sie transluzente Coplin-Gleitfleckengläser und feuchte Kammern verwenden, wickeln Sie sie in Aluminiumfolie.
  13. Fügen Sie 40 l Amplifikationsmischung pro Brunnen hinzu. 100 min bei 37 °C in einer feuchten Kammer inkubieren.
  14. Verstärkungsmischung aus den Brunnen entfernen. Waschen Sie Dias 2x in 100 ml Waschpuffer 'B' in einem Coplin Slide-Färbungsglas für 10 min ohne schütteln.
  15. Waschen Sie Dias in 100 ml Waschpuffer 'B' verdünnt 1:100 in Reinstwasser in einem Coplin Gleitglas für 30 s.
  16. Fügen Sie den Dias 20 L DAPI mit Montagemedium pro Bohrung hinzu. Schließen Sie Dias mit einem Deckel- und Dichtungsschlitten mit Nagellack.
  17. Bei Bildgebung sofort DAPI mit Montagemedium für 10-15 min inkubieren, während vor Licht geschützt. Wenn nicht, lagern Sie die Dias bis zu 1 Woche bei -20 °C, geschützt vor Licht.

5. Erkennung

  1. Verwenden Sie die konfokale Mikroskopie, um Bilder von HeLa-, S. cerevisiae- und E. coli-Zellen mit 20x/0.8 NA, 63x/1.4 NA bzw. 100x/1.4 NA Plan Apochromat Objektiven zu erfassen. Erregen Sie DNA-beflecktes DAPI mit einem 405 nm gepulsten Diodenlaser. Für das PLA-Signal (für diese Studie) begeistern Sie mit einem 561 nm Festkörperlaser.

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Ergebnisse

Unsere früheren In-vitro-Studien mit gereinigten Proteinen zeigten, dass eine Teilmenge der JDPs der menschlichen Klasse A und B transiente JDP-Komplexe der gemischten Klasse bildet, um effizient auf eine breite Palette aggregierter Proteine zu zielen und möglicherweise die Montage von Hsp70-basierten Protein-Disaggregasen7. Wir verwendeten PLA, um festzustellen, ob JDP-Komplexe der gemischten Klasse (A+B) in menschlichen Gebärmutterhalskrebszellen (HeLa) vorkommen. Menschliche JDPs DNAJA2 (Klasse...

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Diskussion

Co-Immunpräzipitation und co-localization basierte Ansätze wurden als langjährige Methoden zur Charakterisierung von Protein-Assembls verwendet. Der Nachweis von transient gebildeten spezifischen Chaperonkomplexen stellt bei solchen konventionellen Methoden eine große Herausforderung dar, so dass sich frühere Erkenntnisse weitgehend auf qualitative Interpretationen beschränken. Die Zelllyse-basierten Co-Immunpräzipitierstit-Techniken erfordern oft eine Vernetzung, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu stabilisieren. Die...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

NBN wird durch einen speziellen Recruitment Grant der Monash University Faculty of Medicine Nursing and Health Sciences mit Finanzieller Unterstützung der Regierung von Victoria und der australischen Regierung unterstützt. Wir danken Bernd Bukau (ZMBH, Universität Heidelberg, Deutschland) und Harm H. Kampinga (Abteilung für Biomedizinische Wissenschaften von Zellen & Systemen, Universität Groningen, Niederlande) für ihre unschätzbare Unterstützung und den Austausch von Reagenzien, Holger Lorenz (ZMBH Imaging Facility, Universität Heidelberg, Deutschland) für seine Unterstützung bei der konfokalen Mikroskopie und Bildverarbeitung und Claire Hirst (ARMI, Monash University, Australien) für die kritische Lektüre des Manuskripts.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
37% FormaldehydMerck103999
AcetonSigma-Aldrich32201
Anti-DNAJA2-AntikörperAbcamab157216
Anti-DNAJB1 AntikörperEnzo Life SciencesADI-SPA-450
Anti-DnaK-AntikörperInhouse
Anti-mCherryAntikörper Abcamab125096
Anti-Sis1-AntikörperCosmo Bio CorpCOP-080051
Anti-Ydj1-AntikörperStressMarq Biosciences  SMC-150,
Anti-YFP-AntikörperInhouse-Coplin
Objektträger-FärbegefäßSigma-AldrichS5516
Diagnostische ObjektträgerMarienfeld1216530
DMEMThermo-Fischer31966021
DuoLink In-situ-Detektionsreagenzien OrangeSigma-AldrichDUO92007
DuoLink In Situ Einbettmedium + DAPISigma-AldrichDUO82040
DuoLink In Situ PLA Sonde Anti-Maus MINUSSigma-AldrichDUO92004
DuoLink In Situ PLA Sonde Anti-Kaninchen PLUSSigma-AldrichDUO92002
DuoLink In Situ Waschpuffer, FluoreszenzSigma-AldrichDUO82049
Fötales KälberserumThermo-Fischer10082147
LysozymSigma-Aldrich62971
MethanolSigma-Aldrich32213
ParaformaldehydSigma-AldrichP6148
Penicillin/StreptomycinThermo-Fischer15070063
Poly-L-LysinSigma-AldrichP47-07
SorbitSigma-AldrichS7547
Triton-X100Merck108643
TrypsinThermo-Fischer25300096
Tween-20Sigma-AldrichP1379
Zymolase 100T / / LyticaseUnited States BiologicalZ1004

Referenzen

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  4. Kampinga, H. H., Craig, E. A. The HSP70 chaperone machinery: J proteins as drivers of functional specificity. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 579-592 (2010).
  5. Nillegoda, N. B., Bukau, B. Metazoan Hsp70-based protein disaggregases: emergence and mechanisms. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).
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