Summary
As proteínas do domínio J de cognato cooperam com a Chaperona HSP70 para auxiliar em uma infinidade de processos biológicos que vão desde a dobradura de proteínas até a degradação. Aqui, nós descrevemos um ensaio in situ da ligadura da proximidade, que permita a monitoração destas machineries transientemente formadas do acompanhante em bactérias, em fermento e em pilhas humanas.
Abstract
As proteínas do J-domínio (jdps) formam a família a maior e a mais diversa do co-Chaperone em pilhas eucarióticas. Os resultados recentes mostram que os membros específicos da família de JDP poderiam dar forma a heterocomplexos transientes nos eucariotas para ajustar a seleção da carcaça para a proteína de choque do calor de 70 kDa (HSP70)-base Chaperone-baseada disaggregases. Os complexos de JDP visam o estresse agudo/crônico induzido por proteínas agregadas e, presumivelmente, ajudam a montar os disaggregases recrutando múltiplos Hsp70s para a superfície de agregados proteicos. A extensão da rede de controle de qualidade proteica (PQC) formada por esses JDPs fisicamente interagindo permanece em grande parte não caracterizada in vivo. Aqui, nós descrevemos um ensaio in situ microscopia-baseado da interação da proteína nomeado o ensaio da ligadura da proximidade (PLA), que é capaz de capturar robustamente estes complexos transientemente formados do acompanhante em compartimentos celulares distintos de pilhas eucarióticas. Nosso trabalho amplia o emprego de PLA de células humanas a leveduras (Saccharomyces cerevisiae) e bactérias (Escherichia coli), tornando assim uma importante ferramenta para monitorar a dinâmica de conjuntos proteicos transientemente formados em ambos os células procarióticas e eucarióticas.
Introduction
Uma quantidade vasta de informação genomic permanece indefinidos devido a nossa compreensão incompleta de interactomes celulares. As metodologias convencionais de detecção de interação proteína-proteína, como a co-imunoprecipitação protéica com/sem ligação cruzada química e colocalização protéica, embora amplamente utilizadas, apresentam uma série de desvantagens. Algumas das principais desvantagens incluem a má quantificação das interações e a potencial introdução de eventos vinculativos não nativos. Em comparação, as técnicas emergentes de proximidade fornecem uma alternativa e uma abordagem poderosa para capturar interações protéicas nas células. O ensaio de ligadura de proximidade (PLA)1, agora disponível como um kit proprietário, emprega anticorpos especificamente destinados a complexos proteicos com base na proximidade das subunidades interagindo.
O PLA é iniciado pela formação de um andaime constituído por anticorpos primários e secundários com pequenas Tags de DNA (sondas PLA) na superfície do complexo proteico alvo (Figura 1, etapas 1-3). Em seguida, determinada pela proximidade das tags de DNA, uma molécula de DNA circular é gerada através da hibridação com oligonucleotídeos do conector (Figura 1, etapa 4). A formação do ADN circular é terminada por uma etapa da ligadura do ADN. A parte circular recentemente formada de ADN sere como um molde para a amplificação subseqüente do círculo do rolamento (RCA)-baseou a reacção em cadeia do polymerase (PCR) aprontado por um dos Tag conjugado do oligonucleotide. Isto gera uma molécula de DNA concatemeric única-encalhado unida ao complexo da proteína através do andaime do anticorpo (Figura 1, etapa 6). A molécula concatemeric do ADN é visualizada usando os oligonucleotídeos cDNAs etiquetados que hibridizam às seqüências originais múltiplas dispersadas através do ADN amplificado (Figura 1, etapa 7)2. O sinal do PLA gerado, que aparece como um ponto fluorescente (Figura 1, etapa 7), corresponde à posição do complexo alvejado da proteína na pilha. Como resultado, o ensaio poderia detectar complexos proteicos com alta precisão espacial. A técnica não se limita a simplesmente captar interações proteicas, mas também pode ser utilizada para detectar moléculas únicas ou modificações protéicas em proteínas com alta sensibilidade1,2.
HSP70 forma um sistema de acompanhante altamente versátil fundamentalmente importante para manter a homeostase de proteínas celulares, participando de uma série de tarefas domésticas e funções associadas ao stress. As atividades de limpeza do sistema de acompanhante HSP70 incluem dobradura de proteína de novo, translocação de proteínas através de membranas celulares, montagem e desmontagem de complexos proteicos, regulação da atividade proteica e vinculação de diferentes proteínas dobráveis/ controle de qualidade machineries3. O mesmo sistema de acompanhante igualmente redobra proteínas desdobradas/unfolded, impede a agregação da proteína, promove a desagregação da proteína e coopera com proteases celulares para degradar as proteínas terminalmente misfolded/danificadas para facilitar o reparo celular após tensões proteotóxicas4,5. Para alcançar essa diversidade funcional, a Chaperona HSP70 confia em parcerias de cochaperonas da família JDP e fatores de troca de nucleotídeo (NEFs) que afinar o controle alostérico dependente de Hsp70's ATP de ligação de substrato e liberação3, a 6. Além disso, os cochaperones JDP desempenham um papel vital na seleção de substratos para este sistema de acompanhante versátil. Os membros desta família são subdivididos em três classes (A, B e C) com base em sua homologia estrutural para o protótipo JDP, o E. coli DnaJ. Os jdps da classe A contêm um N-terminal J-Domain, que interage com o HSP70, uma região rica da glicina-fenilalanina, uma região obrigatória da carcaça que consiste em um zinco dedo-como a região (zflr) e dois domínios do β-tambor, e um domínio do dimerização do C-terminal. JDPs com um N-terminal J-domínio e um glicina-fenilalanina rica região, mas faltando o ZFLR, cair na classe B. Em geral, os membros dessas duas classes estão envolvidos em funções de chaperoning. Membros que caem a classe C do catchall, que contem os JDPs que compartilham somente do J-domínio4, recruta Hsp70s para executar uma variedade de funções não-chaperoning. O importante papel dos JDPs como "adaptadores" de reconhecimento de substrato intercambiáveis do sistema HSP70 é refletido por uma expansão dos membros da família durante a evolução. Por exemplo, os seres humanos têm sobre 42 Membros distintos4de JDP. Estes jdps funcionam como monómeros, homodimers e/ou oligômeros homo/hetero4,5. Recentemente, uma cooperação funcional através da formação complexa transiente entre A classe A (por exemplo, H. sapiens DNAJA2; S. cerevisiae Ydj1) e classe B (p. ex., H. sapiens DNAJB1; S. cerevisiae Sis1) o jdps eucarióticas foi relatado para promover o reconhecimento eficiente de agregados amorfos da proteína in vitro7,8. Estes complexos da classe misturada JDP presumivelmente montam na superfície de proteínas agregadas para facilitar a formação de HSP70-e HSP70 + Hsp100-based disaggregases da proteína7,8,9, 10. a evidência crítica para apoiar a existência destes complexos de classe mista de JDP em células eucarióticas foi formada transientemente com o PLA8.
O PLA é empregado cada vez mais para avaliar interações da proteína no Metazoa, primeiramente em pilhas mamíferos. Aqui, nós relatamos a expansão bem sucedida desta técnica para monitorar os complexos transientemente formados do acompanhante em organismos unicelulares eucarióticas e procarióticas tais como o fermento de brotamento S. cerevisiae e a bactéria e . coli. Importante, esta expansão destaca o uso potencial do PLA em detectar e em analisar os micróbios que infectam pilhas humanas e animais.
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Protocol
1. HeLa preparação celular
- Prepare os seguintes materiais: PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM na2HPO4, 1,8 mm KH2po4), pH 7,4; DMEM, suplementado com 10% FCS e 1% Pen-Strep; paraformaldeído a 4% em PBS; 0,5% Triton-X100 em PBS; TBS-T (150 mM NaCl, 20 mM Tris, 0, 5% Tween), pH 7,4; 0, 1% solução estéril de poli-L-lisina; lâminas diagnósticas de 10 poços; uma câmara húmida; papel tissue; e frascos de coloração da corrediça de Coplin.
Nota: Para assegurar a eficiência óptima da fixação, as soluções do paraformaldeído devem ser preparadas frescas antes de cada experimento. - Prepare uma câmara húmida cobrindo a parte inferior de uma caixa fechada com tecidos molhados. Coloque a câmara húmida a 37 ° c antes de iniciar o experimento, para garantir que a temperatura da câmara esteja a 37 ° c, enquanto incubando as reações enzimáticas.
- Células HeLa de cultura em frascos T25, em 5 mL de DMEM (alta glicose, glutamato e piruvato de sódio suplementados) suplementados com 10% FCS e 1% Pen-strep, em uma incubadora de 37 ° c CO2 contendo 5% de co2. Dissociar as células aderentes usando 0, 5% tripsina-EDTA. Depois que a adição de DMEM fresco às pilhas dissociada, contem pilhas usando uma câmara de contagem da pilha e cresce em corrediças diagnósticas dentro de uma câmara húmida.
- Esterilizar as lâminas diagnósticas por irradiação UV em uma capa de cultura celular estéril por 30 min.
- Adicionar 100 μL de estéril filtrado 0, 1% poli-L-lisina a cada poço necessário para o experimento. Incubar por 30 min. Lave o excesso de poli-L-lisina, lavando cada poço 3x com 50 μL de água ultrapura.
- Trypsinize as pilhas de HeLa e adicione aproximadamente 15.000 pilhas a cada poço. Se necessário, diluir as células para, pelo menos, 30-50 μL de DMEM por poço.
- Cresça pilhas em uma câmara húmida dentro de uma incubadora de 37 ° c 5% CO2 para aproximadamente 24 h. as pilhas devem ser 60%-80% confluentes antes de começar o PLA.
Nota: Uma confluência muito alta diminui a absorção dos reagentes, diminuindo o sinal obtido no final do protocolo. - Remova o meio colocando um papel de tecido na borda do poço. Lave os poços 3x com 50 μL de PBS.
Nota: As células estão sujeitas a desanexação quando líquidos são adicionados duramente. Isto pode ser impedido não deixando os poços secar completamente antes de adicionar o líquido novo e adicionando o líquido novo delicadamente à borda do poço. - Fixe pilhas adicionando 50 μL de paraformaldeído recentemente preparado de 4% em PBS a cada poço. Incubar por 10 min à temperatura ambiente.
- Lave as lâminas 3x em PBS. Realize lavas em um frasco de coloração de slide Coplin contendo 100 mL de PBS. Para cada lavagem, incubar durante 5 min à temperatura ambiente sem agitação.
- Permeabilize a membrana celular submergindo as lâminas em 100 mL de 0,5% Triton-X100 em PBS em um frasco de coloração de slide Coplin. Incubar durante 10 min à temperatura ambiente sem agitação.
- Lave os slides 3x em TBS-T. Realize lavas em um frasco de coloração de slides Coplin contendo 100 mL de TBS-T. Para cada lavagem, incubar durante 5 min à temperatura ambiente sem agitação.
- Após a última lavagem, remova o excesso de tampão com um papel tissue. Neste ponto, as células estão prontas para o protocolo de ensaio de ligadura de proximidade que será discutido na seção 4.
Preparação da pilha 2. S. cerevisiae
- Prepare os seguintes materiais: 100 mM KPO4, pH 6,5, referido como tampão de lavagem; 37% formaldeído; 4% paraformaldeído em 100 mM KPO4, pH 6,5; 1,2 M sorbitol em 100 mM KPO4, pH 6,5; solução de liticase (500 μg/mL de liticase, 20 mM β-Mercaptoetanol, 100 mM KPO4, pH 6,5); 0, 1% solução de poli-L-lisina; 1% Triton-X100 em 100 mM KPO4, pH 6,5; lâminas diagnósticas de 10 poços; uma câmara húmida (preparada como no passo 1,2); papel tissue; e frascos de coloração da corrediça de Coplin.
Nota: Para assegurar a eficiência óptima da fixação, as soluções do paraformaldeído devem ser preparadas frescas antes de cada experimento. - Cresça uma cultura overnight no meio de extrato de levedura não seletivo, peptona e dextrose (YPD) a 30 ° c durante a agitação.
Nota: Dependendo das exigências experimentais as células S. cerevisiae podem ser cultivadas em meio sintético (SC) médio ou seletivo sintético mínimo (SM) em vez disso. - Diluir a cultura estacionária para um OD600 de 0,1 em 20 ml médio. Cresça as pilhas em 30 ° c ao agitar até que o OD600 alcangue 0,5.
- Transfira a cultura de 20 mL para um tubo de centrifugação de 50 mL. Pellet as células por centrifugação em 665 x g por 3 min. Retire o sobrenadante. Ressuscitem as células em 5 mL de meio fresco.
- Fixe as células adicionando 550 μL de 37% de formaldeído à cultura. Incubar à temperatura ambiente durante 15 min.
- Pellet as células por centrifugação em 665 x g por 3 min. Retire o sobrenadante. Resuspend o pellet em 1 mL de recém preparado 4% paraformaldeído em tampão de lavagem. Incubar por 45 min à temperatura ambiente.
- Durante a incubação, prepare as lâminas diagnósticas adicionando 100 μL de 0, 1% de solução de poli-L-lisina a cada poço. Incubar as lâminas durante 30 min à temperatura ambiente.
- Após 30 min, lave o excesso de poli-L-lisina com água ultrapura e deixe o ar das lâminas secar. As lâminas secas estão prontas para uso.
- Lave as células duas vezes com 1 mL de tampão de lavagem. Realize lavagens por centrifugação das células a 665 x g durante 3 min. Retire o sobrenadante e ressuscitem as células no tampão de lavagem.
- Pellet as células por centrifugação em 665 x g por 3 min. Retire o sobrenadante. Ressuscitou as células em 1 mL de 1,2 M de sorbitol em tampão de lavagem.
- Pellet as células por centrifugação em 665 x g por 3 min. Retire o sobrenadante. Ressuscitem o pellet em 250 μL de solução de Liticase preparada na hora para digerir a parede celular. Incubar as células na solução de Liticase durante 15 min a 30 ° c durante a agitação.
- Após a digestão, lave as células 3x por centrifugação a 665 x g durante 3 min e retire o sobrenadante. Ressuscitou as células em 250 μL de 1,2 M de sorbitol em tampão de lavagem.
Nota: Porque as células são frágeis após a digestão da parede celular, ressuscitem-los com muito cuidado para não danificar as células. - Adicionar 20 μL de células ressopadas às lâminas revestidas de poli-L-lisina. Permita que eles se anexem aos slides por 30 min. Lave as células não aderentes lavando os poços 3x com 50 μL de tampão de lavagem.
- Permeabilize a membrana celular por lavagem 3x com 50 μL de 1% Triton-X em tampão de lavagem.
Nota: Neste ponto as pilhas estão prontas para o protocolo do ensaio da ligadura da proximidade que será discutido na seção 4.
Preparação da pilha 3. E. coli
- Prepare os seguintes materiais: PBS-T (140 mM NaCl, 2 mM KCl, 8 mM K2HPO4, 1,5 mm KH2po4, 0, 5% Tween-20), pH 7,4; solução de lisozima (2 mg/mL de lisozima, 25 mM de Tris-HCl pH 8,0, 50 mM de glicose, 10 mM de EDTA); 0, 1% solução de poli-L-lisina; 99% metanol gelo-frio; 99% temperatura ambiente metanol; 99% acetona; lâminas diagnósticas de 10 poços; uma câmara húmida (preparada como no passo 1.1.1); papel tissue; e frascos de coloração da corrediça de Coplin.
- Cresça uma cultura durante a noite no meio de Luria-Bertani (libra) em 30 ° c ao agitar.
- Diluir a cultura estacionária a um OD600 de 0, 2 no meio fresco da libra. Cresça as pilhas em 30 ° c ao agitar até que o OD600 alcangue 0,4 para pilhas da fase do registro.
- Aproximadamente 15 minutos antes que as pilhas alcancem um OD600 de 0,4, prepare as corrediças revestidas poli-l-lysine adicionando 100 μL de 0, 1% poli-l-lisina a cada poço. Incubar as lâminas durante 30 min à temperatura ambiente.
- Após 30 min lave o excesso de poli-L-lisina com água ultrapura e deixe deslizar o ar seco. As lâminas secas estão prontas para uso.
- Quando as pilhas alcangam um OD600 de 0,4, transfira 1 ml da cultura a um tubo estéril do microcentrifugador e às pilhas da pelota em 2.650 x g por 2 minutos.
- Reressuscitem as células em 50 μL de meio LB.
- Fixar as células adicionando 1 mL de gelo-frio 99% metanol. Misture muito suavemente com a mão. Incubar células por 30 min a-20 ° c.
- Após a fixação, adicione 20 μL das células às lâminas revestidas com poli-L-lisina. Deixe as lâminas secar ao ar por 30 min.
- Adicionar 50 μL de solução de lisozima preparada na hora para cada poço para digerir a parede celular. Incubar em câmara húmida durante 30 min a 25 ° c.
- Remova a solução da lisozima dos poços adicionando um papel de tecido à borda do poço. Lave as lâminas 3x em 100 mL de PBS-T. Realize cada lavagem em um frasco de coloração de slides Coplin por 30 s, sem tremer.
- Retire o tampão de lavagem das lâminas tocando nos slides em um papel tissue.
- Permeabilize as membranas celulares adicionando 50 μL de metanol de 99% a cada poço. Incubar durante 1 min à temperatura ambiente.
- Remova o metanol colocando um papel de tecido na borda do poço.
- Adicionar 50 μL de 99% de acetona a cada poço. Incubar por 1 min.
- Retire o excesso de acetona, colocando um papel de tecido para a borda do poço. Permitir que os slides para secar ao ar. Neste ponto as pilhas estão prontas para o protocolo do ensaio da ligadura da proximidade que será discutido na seção 4.
4. ensaio de ligadura de proximidade
- Prepare os seguintes materiais: bloqueio de buffer; Tampão de diluição de anticorpos; Tampão de lavagem ' A ' – (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0, 5% Tween-20) pH 7,4; Tampão de lavagem ' B ' – (200 mM Tris, 100 mM NaCl) pH 7,4; Anticorpo secundário anti-coelho PLUS; Anti-mouse anticorpo secundário MINUS; 5x tampão de ligadura; Ligase 5x tampão de amplificação (laranja: λex 554 nm; λem 576 nm); polimerase água ultrapura; e meio de montagem contendo DAPI.
Nota: os reagentes de detecção de PLA também estão disponíveis nas variantes verde (λ ex 495 nm;λ em 527 nm), vermelho (λex 594 nm; λem 624 nm), farred (λex 644 nm; λem 669 nm) ou brightfield (horseradish peroxidase (HRP) conjugados). - Bloqueie as células adicionando uma gota de buffer de bloqueio a cada poço. Incubar durante 30 min a 37 ° c numa câmara húmida.
- Prepare soluções do anticorpo diluindo anticorpos do estoque no amortecedor da diluição do anticorpo. Para cada poço 40 μL de solução de anticorpos é necessária.
- Remova o tampão de obstrução coloc um papel de tecido na borda do poço. Adicionar 40 μL de anticorpo diluído em tampão de diluição de anticorpos a cada poço. Incubar por 60 min numa câmara húmida a 37 ° c ou durante a noite a 4 ° c.
- Remova a solução do anticorpo dos poços coloc um papel de tecido na borda do poço. Lave as lâminas 2x em 100 mL de tampão de lavagem ' A ' em um frasco de coloração de slides Coplin por 5 min, sem agitação.
- Durante as etapas da lavagem, diluir pontas de prova secundárias do anticorpo 5x, anti-coelho mais & anti-rato menos (a especificidade das espécies das pontas de prova depende dos anticorpos preliminares usados), no amortecedor da diluição do anticorpo. Prepare 40 μL de solução de anticorpos por poço.
- Adicionar 40 μL de solução de anticorpos secundários a cada poço. Incubar por 60 min a 37 ° c em câmara húmida.
- Remova a solução secundária do anticorpo dos poços coloc um papel de tecido na borda do poço. Lave as lâminas 2x em 100 mL de tampão de lavagem ' A ' em um frasco de coloração de slides Coplin por 5 min, sem agitação.
- Durante as lavagens Prepare 40 μL de mistura de ligadura por poço, misturando 8 μL de tampão de ligadura 5x, 31 μL de água ultrapura e 1 μL de ligase.
- Adicionar 40 μL de mistura de ligadura a cada poço. Incubar durante 30 min a 37 ° c numa câmara húmida.
- Remover a mistura de ligadura dos poços, colocando um papel de tecido na borda do poço. Lave as lâminas 2x em 100 mL de tampão de lavagem ' A ' em um frasco de coloração de slides Coplin por 2 min, sem agitação.
- Durante as lavagens Prepare 40 μL de mistura de amplificação por poço, misturando 8 μL de solução de amplificação de 5x, 31,5 μL de água ultrapura e 0,5 μL de polimerase.
Nota: A amplificação de 5x contém sondas fluorescentes. Proteja esta mistura da luz. Além disso, proteja os slides da luz durante cada uma das etapas a seguir. Se usar frascos translúcidos da corrediça-mancha de Coplin e câmaras húmidas, envolva-os na folha de alumínio. - Adicionar 40 μL de mistura de amplificação por poço. Incubar por 100 min a 37 ° c em câmara húmida.
- Remover a mistura de amplificação dos poços. Lave as lâminas 2x em 100 mL de tampão de lavagem ' B ' em um frasco de coloração de slides Coplin por 10 min sem tremer.
- Lave as lâminas em 100 mL de tampão de lavagem ' B ' diluído 1:100 em água ultrapura em um frasco de coloração de corrediça Coplin por 30 s.
- Adicione 20 μL de DAPI contendo meio de montagem por poço aos slides. Feche os slides com uma lamínula e lâminas de vedação com esmalte.
- Se a imagem latente, imediatamente Incubar o DAPI que contem o meio de montagem por 10 – 15 minutos, quando protegido da luz. Se não, armazene os slides a-20 ° c por até 1 semana, protegidos da luz.
5. detecção de
- Use a microscopia confocal para adquirir imagens de HeLa, S. cerevisiae e células de e. coli com 20x/0.8 na, 63x/1.4 na e objetivos do apochromat da planta de 100x/1.4 na, respectivamente. Excite DNA-manchado DAPI com um 405 nm pulsado laser de diodo. Para o sinal PLA (para este estudo) excitar com um laser de estado sólido de 561 nm.
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Representative Results
Nossos estudos in vitro prévios usando proteínas purificadas revelaram que um subconjunto de classe humana A e de classe B JDPs formam complexos transientes de classe mista JDP para direcionar eficientemente uma ampla gama de proteínas agregadas e possivelmente facilitar a montagem de HSP70-based disaggregases proteicos7. Nós empregamos o PLA para determinar se os complexos da classe misturada (A + B) JDP ocorrem em pilhas de cancro cervicais humanas (HeLa). Os JDPs humanos DNAJA2 (classe A) e DNAJB1 (classe B) foram direcionados com anticorpos primários altamente específicos e sondas de PLA secundárias (Figura 2a-C). A aparência de punctae fluorescente vermelho indicou a presença de complexos misturados da classe DNAJA2 e DNAJB1 em pilhas de HeLa (Figura 2C) que confirmam nossos resultados bioquímicos precedentes7. Cada punctum representa um evento individual da interação da proteína no cytosol/núcleo da pilha de HeLa.
Resultados bioquímicos prévios obtidos da transferência de energia da ressonância de Förster (fret), que detecta interações da proteína como um leitura da quantidade de energia transferida de um fluoróforo doador excited Unido a uma proteína a um fluoróforo apropriado do Acceptor anexado à segunda proteína, indicou que complexos similares da classe misturada poderiam igualmente ocorrer entre os JDPs do fermento, in vitro8. Confirmando nossos achados bioquímicos, observamos a formação de complexos de classe mista entre Ydj1 (classe A) e Sis1 (classe B) em células unicelulares de eucarite S. cerevisiae (levedura de padeiro) com PLA (Figura 2F). No fermento, devido a seu tamanho pequeno da pilha e à coalescência de punctae múltiplos, os pontos fluorescentes individuais gerados pelo PLA podiam frequentemente ser menos distinguíveis. Uma diminuição considerável na formação fluorescente dos punctae foi observada após o nocaute ou o knockdown de JDPs de interação nas pilhas humanas e do fermento8, que demonstra a especificidade elevada do PLA em capturar estes complexos do co-Chaperone em diferentes tipos de células. Em contraste com suas contrapartes eucarióticas, os jdps procarióticas (e. coli) faltaram a habilidade de formar complexos misturados da classe JDP e cooperam funcionalmente para impulsionar a desagregação da proteína, in vitro8. De acordo com a análise bioquímica, não observamos a formação complexa de classe mista JDP entre DnaJ-YFP bacteriano (classe A) e CbpA-mCherry (classe B), os únicos JDPs em E. coli (Figura 2i). No entanto, nossa configuração PLA foi capaz de capturar outros conjuntos de acompanhante envolvendo os dois jdps. Por exemplo, detectamos complexos de Chaperona entre DnaJ-YFP e DnaK (bacteriano HSP70) (Figura 2L) e CBPA-Mcherry e dnak8 (dados não mostrados). Esses dois complexos de Chaperona bacteriana são extensivamente caracterizados tanto in vitro como invivo 8,11,12 confirmando assim nossos resultados de PLA. Junto, estas observações demonstram a habilidade do Pla de capturar robusta machineries transientemente formados do acompanhante em pilhas eucarióticas e procarióticas Unicellular/multicelular. Os controles técnicos que faltam um anticorpo preliminar de encontro a um dos JDPs/chaperones de interação, mas que contêm as pontas de prova secundárias derivadas do rato e do coelho do PLA, mostraram pouco a nenhum sinal da fluorescência do fundo (Figura 2a, B, D, E, G, H, J, K) indicando uma falta de amplificação de sinal falso positivo em nossa configuração experimental.
Figura 1: representação esquemática das etapas cronológicas do ensaio de ligadura de proximidade. (1) complexo entre proteína A e proteína B. (2) ligação de anticorpos primários (1 °) (verde e castanho claro) a proteínas a e B. Os dois anticorpos primários devem ser levantados em diferentes espécies hospedeiras (por exemplo, rato, coelho ou cabra). (3) os anticorpos primários são reconhecidos por anticorpos secundários específicos de espécies (2 °) covalentemente anexados com tags de oligo de DNA (sondas PLA). (4) quando as proteínas A e B estão no complexo, as pontas de prova acopladas do PLA estão na proximidade próxima para facilitar os oligos do ADN hibridizam com as costas do ADN do conector, que conduz à formação de uma molécula circular do ADN. Subseqüentemente, uma ligase do ADN facilita a junção de costas do ADN junto Catalisando a formação de uma ligação do fosfodiéster. (5) a iniciação da amplificação do círculo do rolamento (RCA) da molécula circular do ADN por um polymerase de ADN bacteriano em 37 ° C. a reação do RCA é aprontado por um dos Tag anticorpo-conjugados do oligo do ADN. (6) geração de uma molécula de DNA concatemeric única-encalhado unida a um dos anticorpos secundários. (7) hibridação de pontas de prova complementares fluorescently-etiquetadas do oligonucleotide a uma seqüência repetitiva original na molécula concatemeric do ADN. Após a etapa da hibridação, a molécula concatemeric do ADN podia ser visualizada como um ponto fluorescente brilhante na posição do complexo alvejado da proteína em pilhas fixas. A parte inferior denotam os tipos procarióticas e eucarióticas da pilha em que a técnica do PLA é aplicável. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Montagens moleculars do acompanhante capturadas pelo PLA em pilhas procarióticas e eucarióticas. (A-C) detecção de complexos mistos de classe JDP formados entre DNAJA2 (classe A) e DNAJB1 (classe B) na linhagem celular de câncer cervical humano Hela. PLA realizada com (A) Anticorpo DNAJA2 isoladamente (controle técnico negativo); (B) anticorpo anti-DNAJB1 isoladamente (controlo técnico negativo); (C) anticorpos anti-DNAJB1 e DNAJA2 juntos. O aparecimento de múltiplos pontos fluorescentes no painel C (sinal positivo) indica a presença de complexos proteicos formados entre DNAJA2 e DNAJB1. Cada ponto fluorescente vermelho/punctum representa uma única interação. Núcleos (DNA) corados com DAPI (ciano). (D-F) Detecção de complexos de classe mista JDP formado entre Ydj1 (classe A) e Sis1 (classe B) em células de S. cerevisiae . (D) PLA realizada com anticorpo anti-Ydj1 isoladamente (controle técnico negativo); (E) PLA realizada com anticorpo anti-Sis1 isoladamente (controle técnico negativo); (F) PLA realizada com anticorpos anti-Ydj1 e Sis1 juntos. O sinal fluorescente positivo denota a presença de complexos Ydj1 e Sis1 em S. cerevisiae. Núcleos de levedura corados com DAPI (ciano). (G-L) Detecção de complexos de Chaperona formados entre HSP70 procarióticos (DnaK) e JDPs (DnaJ e CbpA) em células de E. coli . Devido à falta de anticorpos primários específicos contra os JDPs procarióticos, o e. coli DnaJ (classe A) e CBPA (classe B) foram marcados com YFP e mcherry, respectivamente. (G, J) PLA realizado com anti-YFP sozinho (controle técnico negativo); (H) PLA realizada com anti-mcherry isoladamente (controlo técnico negativo). (I) PLA realizada com anticorpo anti-YFP e anti-mcherry. A falta de formação de pontos fluorescentes não indica formação complexa entre DnaJ e CbpA. (K) PLA realizada com anticorpo anti-dnak isoladamente (controle técnico negativo). (L) PLA realizada com anti-YFP e anti-dnak anticorpos juntos. O sinal fluorescente positivo indica a formação complexa entre DnaK e DnaJ. DNA bacteriano manchado com DAPI (ciano). Além de conter um único anticorpo primário, todos os controles técnicos negativos foram realizados na presença das respectivas sondas de PLA secundárias. Barras de escala = 10 μm.
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Discussion
As abordagens baseadas em coimunoprecipitação e colocalização têm sido utilizadas como métodos de longa data para caracterizar as montagens de proteínas. A detecção de complexos de Chaperona em forma transitória é um grande desafio com tais métodos convencionais e, como resultado, os achados anteriores são largamente restritos a interpretações qualitativas. As técnicas de coimunoprecipitação à base de lise celular geralmente exigem cross-linking para estabilizar interações proteína-proteína. A lise celular aumenta o risco de interromper complexos de chaperonas transientemente formadas, enquanto o cross-linking pode introduzir interações não nativas, particularmente impulsionadas pela "viscosidade" inerente da maioria das acompanhantes. Ao analisar o sistema de acompanhante HSP70 usando a coimunoprecipitação, os artefatos potenciais poderiam surgir de (a) altos níveis de expressão da Chaperona e (b) problemas de solubilidade pertencentes a machineries de acompanhante vinculado agregado de membrana ou proteína. Além disso, as técnicas baseadas em coimunoprecipitação não fornecem informações sobre a localização celular dos conjuntos proteicos capturados, o que pode ser importante para delinear as funções associadas. As desvantagens de usar técnicas da coimunoprecipitação são reduzidas um tanto em aproximações colocalização-baseadas que preservam a informação da localização da proteína. Entretanto, a colocalização de duas ou mais proteínas poderia indicar associação direta proteína-proteína ou particionamento de proteínas no mesmo microdomínio nas células. Portanto, a análise de colocalização é, na melhor das dúvidas, especulativa na predição de interações protéicas e carece de qualquer valor de proximidade. Devido ao volume e à deteção indiscriminada das proteínas alvejadas, a técnica é altamente limitada em estudar conjuntos específicos da proteína nas pilhas. Isto é particularmente problemático quando a proteína (s) alvo poderia, em paralelo, formar uma ampla gama de conjuntos de proteínas distintas como no caso com o sistema de acompanhante HSP70. Comparado a estas metodologias convencionais, o PLA é uma técnica in situ mais refinada desenvolvida para detectar e quantificar robustamente associações nativas da proteína nas pilhas com informação preservada da localização da proteína. Uma interação da proteína é revelada por este ensaio baseado na proximidade (aproximadamente 10-30 nanômetro) entre as proteínas alvejadas. PLA é "sintonável" em que o intervalo da distância de proximidade poderia ser reduzido para obter uma leitura mais rigorosa por (a) diminuindo o comprimento das tags oligonucleotídeo anexado às sondas de PLA e/ou (b) conjugando as tags diretamente para anticorpos primários. O cuidado deve ser tomado ao interpretar um sinal positivo do PLA. Idealmente, uma interação protéica deve ser confirmada com duas ou mais metodologias independentes. A intensidade do sinal fluorescente no PLA não é tão deterministicamente relacionada ao tamanho do cluster proteico ou à distância de separação entre as proteínas interagindo como é o caso da FRET. No entanto, o PLA tem um alto grau de especificidade e sensibilidade, e pode até ser usado para analisar proteínas muito baixas, como fatores de crescimento ou citocinas e suas interações em tipos de células raras ou espécimes clínicos13.
A acompanhante HSP70 parceiros com várias cochaperonas (por exemplo, jdps e NEFs) durante a sua vida celular14 para conduzir funções biológicas distintas. O número enorme de configurações prováveis da máquina HSP70-JDP-NEF e seu comportamento dinâmico nas pilhas prejudicaram pela maior parte uma compreensão detalhada das funções específicas destas máquinas do acompanhante. As ferramentas biológicas que permitem o traçado seletivo de montagens HSP70 distintas são, portanto, necessárias para dissecar a fiação geral desta rede de Chaperona nas células. Os complexos de Chaperona7 de JDP-JDP e JDP-HSP70 foram efetivamente capturados em células com PLA, indicando que esta técnica é adequada para o estudo de interações moleculares com constantes de alta dissociação (por exemplo, ≫ 3 μm Kd ). Embora, no trabalho atual, o ensaio é usado principalmente como um "Sim" ou "não" tipo indicador binário para a interação acompanhante, os usuários podem empregar esta técnica para obter leituras semiquantitativos do grau de interação, contando digitalmente a fluorescência intensidades de sinal15. Entretanto, devido à amplificação não-linear do sinal do PLA, o cuidado deve ser exercido ao interpretar dados do PLA em uma maneira quantitativa16. Apesar das vantagens acima mencionadas, este método tem certas limitações. Uma das desvantagens principais do PLA é que o ensaio exige a fixação da pilha assim em grande parte limitando sua habilidade de resolver a dinâmica temporal da complexação da proteína em pilhas vivos. Em comparação, in vivo FRET17 ou transferência de energia de ressonância bioluminescência (BRET)18 permite o monitoramento de interações protéicas semelhantes de forma espacio-temporal em células vivas com valores de proximidade relativamente menores (< 10 nm). Em contraste com PLA, um sinal de FRET exibe uma correlação linear rigorosa com níveis de expressão protéica16 fazendo fret o padrão-ouro na análise quantitativa de interações protéicas. No entanto, diferentemente da dependência do FRET sobre o fator de orientação enigmática κ2, o PLA não é influenciado pela orientação das sondas de PLA, o que aumenta a probabilidade de capturar um complexo proteico19. Em termos de facilidade de utilização, o FRET e o BRET necessitam de conhecimentos únicos, limitando assim a acessibilidade destas metodologias à comunidade de investigação mais alargada. Além disso, ambas as técnicas exigem a modificação das proteínas interagindo, anexando volumosos luminescentes/fluorescentes Tags de proteínas que poderiam potencialmente interferir com a função protéica e formação complexa.
As seguintes etapas (1-4) exigem a consideração cuidadosa para a implementação bem sucedida do PLA nas pilhas. (1) seleção do anticorpo: o jogo comercialmente disponível do PLA é compatível com os anticorpos preliminares levantados de encontro ao rato, ao coelho e à cabra somente. O PLA exige os anticorpos preliminares altamente específicos que não se ligam aos alvos fora. Adicionalmente, é importante selecionar os anticorpos preliminares que são compatíveis com as aplicações tais como immunohistochemistry (IHC), o ensaio enzima-lig da imunosorbent (ELISA), e/ou a imunoprecipitação (IP) para assegurar-se de que os anticorpos pudessem reconhecer seqüências antigénicas do ácido aminado expor na superfície de proteínas dobradas. Antes do uso, o teste de todos os anticorpos primários para sua especificidade é altamente recomendado. Isto pode ser executado através da análise ocidental do borrão de lysates inteiros da pilha. Nos casos em que as proteínas alvo têm homólogos com pequenas variações de tamanho e similaridade de seqüência (por exemplo, HSP70 e paralogs JDP), a especificidade dos anticorpos poderia ser testada com o nocaute genético/Knockout abordagens ou por sondagem contra purificada homólogos para descartar qualquer potencial reconhecimento cruzado. Se anticorpos adequados não estiverem disponíveis, as proteínas-alvo podem ser marcadas com epítopos que têm anticorpos de qualidade aceitável (Figura 2F). (2) fixação e permeabilização das células: um tratamento de 4% paraformaldeído e 0,1-0,5% Triton-X100 pode ser usado para fixar e permeabilizar as células, respectivamente. O uso de paraformaldeído a 4% é um melhor tratamento para preservar interações proteína-proteína e ultraestrutura celular em comparação com condições fixativas empregando 99% de metanol20,21,22. A fixação de células com 99% de metanol, no entanto, produz menos manchas de fundo citoplasmática, e talvez seja mais adequada para casos específicos, como a detecção de citoesqueleto associado proteínas conjuntos21,22. A permeabilização eficiente tanto da membrana plasmática como das membranas organela para aumentar a acessibilidade dos anticorpos pode ser alcançada com o surfactante não-iônico Triton-X100. Triton-X100 pode, no entanto, não especificamente remover proteínas da membrana plasmática23,24. Portanto, para a análise de conjuntos proteicos associados a membranas celulares, detergentes alternativos como saponina ou digitonina que se destina a esteróis para membranas permeabilizantes poderiam ser aplicados21,22,25. (3) ruptura da parede celular: antes da permeabilização da membrana, um passo adicional envolvendo enzimas líticas específicas é necessário para aumentar a penetrabilidade de anticorpos em tipos de células com paredes celulares (por exemplo, fungos, plantas e células bacterianas). Por exemplo, empregamos liticase, que degrada β-glucan para interromper a parede celular deS. cerevisiae26. Da mesma forma, oE. colia parede de pilha foi interrompida usando o lysozyme, uma enzima que alvos peptidoglycans27,28. A composição da parede celular e a sensibilidade da enzima lítica variam com diferentes condições de crescimento26e confluência cultural29,30. Conseqüentemente, a concentração das enzimas Lytic e os tempos da digestão podem variar e o cuidado tem que ser tomado para impedir o excesso ou a subdigestão das pilhas. Após a digestão da parede celular, as células são relativamente frágeis e exigem agentes de aglomerar como sorbitol para que permaneçam intactos durante as etapas de lavagem. (4) amplificação do ADN: a ligadura do ADN e as etapas da reação do PCR do círculo do rolamento são sensíveis às flutuações da temperatura e da umidade. Para assegurar a amplificação e a reprodutibilidade robustas do ADN do ensaio, estas reações devem ser executadas em 37 ° c em uma câmara da umidade. Importante, as células processou devem ser impedidas de secar ao executar o ensaio para evitar qualquer ligação de anticorpos não específicos e eventos de amplificação de DNA que poderiam levar a um aumento no sinal de fundo.
Todas as coisas consideradas, a implementação deste ensaio não requer experiência única e instrumentação sofisticada. A monitoração bem sucedida de complexos do acompanhante de JDP-JDP e de JDP-HSP70 ilustra a aplicação potencial desta técnica para traçar assemblies transientemente formados da proteína em todos os tipos da pilha. Nossa implementação da técnica em leveduras e bactérias aumenta significativamente a aplicabilidade do PLA para estudar vários processos biológicos mediados por conjuntos proteicos distintos em uma ampla gama de organismos. Além disso, nosso trabalho destaca o PLA como uma nova ferramenta de interação protéica promissora para estudar as mudanças evolutivas que ocorrem em um nível molecular através das espécies8.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
NBN é apoiado por um subsídio especial de recrutamento da faculdade de medicina da Universidade de Monash de enfermagem e Ciências da saúde com financiamento do governo estadual de Victoria e do governo australiano. Agradecemos a Bernd Bukau (ZMBH, Universidade de Heidelberg, Alemanha) e a Harm H. Kampinga (departamento de Ciências Biomédicas de células & sistemas, Universidade de Groningen, Países Baixos) pelo seu inestimável apoio e partilha de reagentes, Holger Lorenz (ZMBH Imaging Facility, Heidelberg University, Alemanha) por seu apoio com microscopia confocal e processamento de imagens, e Claire Hirst (ARMI, Monash University, Austrália) para leitura crítica do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Formaldehyde | Merck | 103999 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 32201 | |
| anti-DNAJA2 antibody | Abcam | ab157216 | |
| anti-DNAJB1 Antibody | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-450 | |
| anti-DnaK antibody | In house | ||
| anti-mCherry antibody | Abcam | ab125096 | |
| anti-Sis1 Antibody | Cosmo Bio Corp | COP-080051 | |
| anti-Ydj1 antibody | StressMarq Biosciences | SMC-150, | |
| anti-YFP antibody | In house | ||
| Coplin slide-staining jar | Sigma-Aldrich | S5516 | |
| Diagnostic slides | Marienfeld | 1216530 | |
| DMEM | Thermo-Fischer | 31966021 | |
| DuoLink In Situ Detection Reagents Orange | Sigma-Aldrich | DUO92007 | |
| DuoLink In Situ Mounting Medium + DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 | |
| DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS | Sigma-Aldrich | DUO92004 | |
| DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | |
| DuoLink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma-Aldrich | DUO82049 | |
| Fetal Calf Serum | Thermo-Fischer | 10082147 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | 62971 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fischer | 15070063 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich | P47-07 | |
| Sorbitol | Sigma-Aldrich | S7547 | |
| Triton-X100 | Merck | 108643 | |
| Trypsin | Thermo-Fischer | 25300096 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Zymolase 100T / / Lyticase | United States Biological | Z1004 |
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