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Methodenartikel

Visualisierung und Analyse des intrazellulären Transports von Organellen und anderen Ladungen in Astrozyten

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DOI:

10.3791/60230

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28. August 2019

 ,  , 
1Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine In-vitro-Live-Imaging-Methode zur Visualisierung des intrazellulären Transports von Organellen und des Handels mit Plasmamembranproteinen in murinen Astrozyten. Dieses Protokoll stellt auch eine Bildanalysemethodik zur Bestimmung von Frachttransportrouten und Kinetik dar.

Zusammenfassung

Astrozyten gehören zu den häufigsten Zelltypen im erwachsenen Gehirn, wo sie eine Schlüsselrolle in einer Vielzahl von Funktionen spielen. Als zentraler Akteur bei der Homöostase des Gehirns versorgen Astrozyten Neuronen mit lebenswichtigen Metaboliten und puffern extrazelluläres Wasser, Ionen und Glutamat. Astrozyten sind ein integraler Bestandteil der "Tripartiten"-Synapse und sind auch entscheidend für die Bildung, Beschnitt, Wartung und Modulation von Synapsen. Um diese hochinteraktiven Funktionen zu ermöglichen, kommunizieren Astrozyten untereinander und mit anderen Gliazellen, Neuronen, der Gehirnvaskulatur und der extrazellulären Umgebung durch eine Vielzahl von spezialisierten Membranproteinen, die Zell Adhäsionsmoleküle, Aquaporine, Ionenkanäle, Neurotransmitter-Transporter und Spaltknotenmoleküle. Um diesen dynamischen Fluss zu unterstützen, verlassen sich Astrozyten, wie Neuronen, auf eng koordinierten und effizienten intrazellulären Transport. Im Gegensatz zu Neuronen, wo der intrazelluläre Handel umfassend abgegrenzt wurde, wurde der mikrotubulierbasierte Transport in Astrozyten weniger untersucht. Nichtsdestotrotz orchestriert der exo- und endozytische Handel mit Zellmembranproteinen und intrazellulären Organellentransporten die normale Biologie von Astrozyten, und diese Prozesse sind oft bei Krankheiten oder als Reaktion auf Verletzungen betroffen. Hier präsentieren wir ein einfaches Protokoll zur Kultur hochwertiger muriner Astrozyten, zur fluoreszierenden Kennzeichnung von astrozytären Proteinen und Organellen von Interesse und zur Aufzeichnung ihrer intrazellulären Transportdynamik mittels zeitrafferkonfokaler Mikroskopie. Wir zeigen auch, wie man relevante Transportparameter aus den aufgenommenen Filmen mit verfügbaren Bildanalyse-Software (d.h. ImageJ/FIJI) Plugins extrahiert und quantifiziert.

Einleitung

Astrozyten sind die am häufigsten vorkommenden Zellen im erwachsenen Zentralnervensystem, wo sie einzigartige entwicklungs- und heimostatische Funktionen ausführen1. Astrozyten modulieren synaptische Entwicklung durch direkten Kontakt mit prä- und postsynaptischen Terminals als Teil der Tripartit-Synapse, die Neurotransmitter-Rezeptoren, Transporter und Zelladhäsionsmoleküle enthält, die die Synapsenbildung erleichtern und Neuron-Astrozyten-Kommunikation2. Darüber hinaus steuern Astrozyten aktiv die synaptische Übertragung und verhindern neuronale Exzitotoxizität, indem sie exzitatorische Neurotransmitter schnell aus dem synaptischen Spalten entfernen, Neurotransmitter recyceln und an synaptischem Schnitt teilnehmen3 , 4 , 5 , 6. Um diese hochinteraktiven Funktionen zu ermöglichen, kommunizieren Astrozyten untereinander, mit anderen Gliazellen und mit Neuronen durch spezialisierte Membranproteine, einschließlich Zelladhäsionsmoleküle, Aquaporine, Ionenkanäle, Neurotransmitter-Transporter und Lückenknotenmoleküle. Astrozyten verändern aktiv die Oberflächenniveaus dieser Proteine als Reaktion auf Schwankungen in ihrer intra- und extrazellulären Umgebung7. Darüber hinaus modulieren Veränderungen in den Konzentrationen und der Verteilung von Mitochondrien, Lipidtröpfchen und abbauenden und recycelnden Organellen die Energieversorgung, die Verfügbarkeit von Metaboliten und zelluläre Clearingprozesse, die für die Astrozytenfunktion und überleben.

Die dynamischen Veränderungen des Membranprotein- und Organellenhandels und der Positionierung in Astrozyten werden durch die konzertierte Funktion von motorischen Proteinen und Adaptern erleichtert, die die BeweglichkeitderLadung 8,9fördern. In ähnlicher Weise werden die Oberflächenniveaus von Membranproteinen durch Internalisierung simonieren und Recyceln10moduliert. Diese Ladungen werden über ein kompliziertes Netz von Actin, Mikrotubuliund möglicherweise Zwischenfilamenten 8 transportiert. Studien auf der Grundlage der Immunfluoreszenzfärbung des Endbindungsproteins 1 (EB1), das sich an den wachsenden Mikrotubuli plus Enden ansammelt, deuten darauf hin, dass in Astrozyten Bündel von Mikrotubuli aus dem Perinucleus ausstrahlen und ihr Plus-Ende in Richtung Peripherie11. Eine umfassende Untersuchung der Organisation und Polarität von Mikrotubuli und anderen zytoskelettalen Elementen mittels Live-Zell-Bildgebung fehlt jedoch noch. Während viele der Mechanismen, die der Dynamik von Organellen und Membranproteinen zugrunde liegen, ausgiebig in Neuronen und anderen Zelltypen untersucht wurden, ist die Beweglichkeit der Ladung in Astrozyten weniger gut verstanden. Der größte Teil unseres derzeitigen Wissens über Veränderungen der Protein- und Organellenverteilung in Astrozyten basiert auf der traditionellen Antikörper-basierten Kennzeichnung fester Zubereitung, die eine genaue räumliche und zeitliche Untersuchung der Ladungsdynamik ausschließt7, 12.

Hier beschreiben wir eine Methode zur Kennzeichnung von Membranproteinen und Organellen für live-Bildgebung in hochreinen primären Maus-Astrozytenkulturen. Anhand dieses Protokolls liefern wir Beispiele, in denen wir die dynamische Lokalisierung von grünen fluoreszierenden Proteinen (GFP) verfolgen, die mit Membranproteinen in transfizierten Astrozyten getaggt sind, einschließlich des Spaltknotenproteins Connexin 43 (Cx43-GFP) und der exzitatorischen Aminosäure Transporter 1 (EAAT1-GFP). Wir beschreiben auch die Verwendung einer fluoreszierenden säureotropen Sonde, um saure Organellen zu visualisieren und deren Handelsdynamik in lebenden Astrozyten zu verfolgen. Abschließend zeigen wir, wie die Zeitrafferdaten analysiert werden, um Transportparameter für einzelne Ladungen zu extrahieren und auszuwerten.

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Protokoll

Alle tierischen Eingriffe wurden mit Genehmigung der University of North Carolina im Chapel Hill Animal Care and Use Committee (IACUC) durchgeführt.

1. Hirnsektion und Kultur der primären Mausastrozyten

HINWEIS: Das folgende Protokoll wurde von veröffentlichten Methoden angepasst, die dem ursprünglichen Verfahren folgen, das von McCarthy und deVellis13,14,15entwickelt wurde. Gemischte Zellkulturen von McCarthy/deVellis (MD)-Astrozyten werden aus postnatalen Tag 2-4 (P2-P4) Mauskortika hergestellt, mit einem anti-mitotischen Faktor behandelt und gereinigt, um die endgültige angereicherte Astrozytenkultur zu ergeben. Vier Kortiken von Mauswelpen beiderGeschlechter reichen aus, um eine T75-Gewebekultur-Kulturzufaltkultur zu erzeugen.

  1. Den Boden der T75-Kolben (100% abgewinkelter Nackenzugang, 0,22 m hydrophobe belüftete Filterkappe) mit Poly-D-Lysin (1 mg/ml in 0,1 M Tris-Puffer, pH 8,5) beschichten und bei 37 °C für 24 h vor Beginn der Zerlegung inkubieren.
  2. Vor Beginn des Dissektionsverfahrens, warm 30 ml Astrozytenkulturmedien (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium [DMEM] hohe Glukose, 10% hitzeinaktiviertes fetales Rinderserum, 1% Penicillin/Streptomycin) bei 37 °C und tauen eine 5 ml Aliquot von 2,5% Trypsin auf Eis auf. Bereiten Sie zwei Sezieren desiede Schalen (60 mm Durchmesser) auf Eis vor, gefüllt mit 6 ml Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS) ohne Ca2+ oder Mg2+.
  3. Desinfizieren Sie alle chirurgischen Werkzeuge (Feinspitzen-Pinzette, Schere, Vannas Schere gerade, Graefe Zange mit gekrümmten Spitzen) in 70% Ethanol vor und zwischen jeder Sebung.
  4. Sprühen Sie Kopf und Hals der P2-P4-Mauswelpen mit 70% Ethanol, bevor Sie sie durch Enthauptung mit einer chirurgischen Schere schnell einschläfern. Führen Sie einen hinteren bis vorderen Mittellinienschnitt entlang der Kopfhaut durch, um den Schädel freizulegen. Schneiden Sie den Schädel vorsichtig vom Hals bis zur Nase.
  5. Führen Sie zwei zusätzliche seitliche Einschnitte von den Augen aus. Mit feiner Spitzenpinzette kippen Sie die Schädelklappen vorsichtig zur Seite. Entfernen Sie das Gehirn und legen Sie es in die erste Sezieren Schale gefüllt mit eiskalten HBSS ohne Ca2+ oder Mg2+. Halten Sie das Gericht auf Eis und weiter ernten sie den Rest des Gehirns.
    HINWEIS: Führen Sie den Rest der Sezierprozedur in einem Sezierbereich aus.
  6. Entfernen Sie die Olfaktor-Lampen mit Vannas Schere oder feine Pinzette (Abbildung 1Ai). Mit den gekrümmten Spitzenzangen am Schnittpunkt der Quer- und Interhämisphärischen Risse, legen Sie vorsichtig ein zweites Paar gekrümmter Spitzenzange zwischen dem Kortex und diencephalon, langsam öffnen die Zange, um die zerebralen Hemisphären vom Rest der das Gehirn (Abbildung 1Aii,Aiii). Entfernen Sie das unerwünschte Gewebe (Abbildung 1Aiv).
  7. Für jede kortikale Hemisphäre, entfernen Sie vorsichtig die Meninges mit feiner SpitzenPinzette. Optional entfernen Sie den Hippocampus aus den Kortiken. Übertragen Sie die sezierten Mauskortika in eine zweite Schale, gefüllt mit eiskaltem HBSS ohne Ca2+ oder Mg2+, und halten Sie sie auf Eis, während Sie die restlichen Gehirne sezieren.
    HINWEIS: Führen Sie die nächsten Schritte unter aseptischen Bedingungen in einer laminaren Durchflusshaube durch.
  8. Schneiden Sie die sezierten Kortiken mit einer sterilen scharfen chirurgischen Schere oder einem Skalpell in kleine Stücke (ca. 2 x 4 mm). Übertragen Sie das sezierte Gewebe in eine 50 ml konische Röhre, die Enzymlösung enthält (22,5 ml HBSS ohne Ca2+ oder Mg2+,2,5 ml 2,5% Trypsin). Bei 37 °C für 30 min mit sanfter Inversion alle 10 min inkubieren.
  9. Sammeln Sie das verdaute Gewebe durch Zentrifugation bei 300 x g für 5 min und entfernen Sie die Enzymlösung durch Dekantation (verwenden Sie keinen Vakuum-Aspirator). Fügen Sie 10 ml Astrozytenkulturmedien hinzu und dissoziieren Sie das Gewebe in einzelne Zellen, indem Sie die Lösung 20 bis 30x mit einer 10 ml serologischen Pipette pipetieren.
  10. Filtern Sie die Zellsuspension durch ein 70-m-Zellsieb, um Zellklumpen und unverdautes Gewebe zu minimieren. Sammeln Sie das Filtrat in einem sauberen 50 ml konischen Rohr und passen Sie das Gesamtvolumen auf 20 ml mit Astrozytenkulturmedien an. Bewerten Sie an dieser Stelle die Effizienz der kortikalen Dissoziation, indem Sie 10 l der Zellsuspension mit 10 l Trypanblau und Zählzellen mit einem Hämozytometer mischen.
    HINWEIS: Ein Präparat aus vier P2-P4-Mauskortika ergibt 10 x 15 x 106 Einzelzellen.
  11. Die Poly-D-Lysin-Beschichtungslösung aus den T75-Kulturkolben ansaugen und zweimal mit sterilem Wasser waschen. Die 20 ml Zellsuspension verfestigen und bei 37°C und 5% CO2 inkubieren.

2. Reinigung und Pflege von Astrozytenkulturen

HINWEIS: Führen Sie alle Medienänderungen unter aseptischen Bedingungen in einer laminaren Durchflusshaube mit sterilgefilterten (0,22 m Filtermembran) auf 37 °C erwärmten Astrozytenmedien durch.

  1. Ersetzen Sie das Zellmedium 48 h nach der Beschichtung (Tag in vitro 2, DIV2).
  2. Ersetzen Sie bei DIV5 die Medien durch frische Astrozytenkulturmedien, die durch 10 M Cytosin-Arabinosid (AraC) ergänzt werden.
    HINWEIS: Dieser Schritt erleichtert die Entfernung von Schadstoffzellen, einschließlich Fibroblasten und anderen Gliazellen. Es ist wichtig, die Kulturen mit AraC nicht länger als 48 h zu behandeln, da längere Inkubationszeiten die Astrozytenlebensfähigkeit reduzierenwerden.
  3. Wechseln Sie bei DIV7 Medien zu Astrozytenkulturmedien ohne AraC und beginnen Sie täglich, die Kulturzusammenfluss zu überprüfen. Sobald die Zellen 80 % Zusammenfluss erreicht haben, schichten Sie zwei-T75-Flaschen für jeden ungereinigten Astrozyten-Kulturkolben mit Poly-D-Lysin und inkubieren sie bei 37 °C für mindestens 8 h bis über Nacht.
  4. Beginnen Sie am nächsten Tag mit der Astrozytenreinigung, indem Sie die Kulturkolben 30 min lang in einem 37 °C-Orbital-Shaking-Inkubator bei 180 U/min schütteln. Entfernen Sie die Medien und ersetzen Sie sie durch neue Astrozytenkulturmedien. Schütteln Sie Zellen bei 240 Umdrehungen pro Minute für 6 h in einem 37 °C Orbital-Shaking-Inkubator. Vorwarme 1x phosphatgepufferte Saline (PBS), Astrozytenkulturmedien und 0,25% Trypsin-EDTA bis 37 °C 20 bis 30 min vor dem Ende der Schüttelzeit.
    HINWEIS: EineCO2-Inkubationist während der Schüttelschritte nicht erforderlich. Auf Wunsch können die nach den 30-min- und 6-h-Schüttelungsschritten gesammelten Medien zur Kultur von Mikroglia bzw. Oligodendrozyten verwendet werden. Die AraC-Behandlung der Mischkultur wird jedoch die Fülle der anderen Gliazellen verringern.
  5. Entfernen Sie die Kulturkolben aus dem Shaker und ersetzen Sie das Medium sofort durch 10 ml warme 1x PBS pro Kolben. Entfernen Sie PBS und fügen Sie 3 ml von 0,25% Trypsin-EDTA pro Kolben hinzu. Bei 37 °C und 5%CO2 inkubieren, alle 5 min auf Ablösung prüfen.
  6. Sobald sich zellenvom Kolben gelöst haben, stoppen Sie die Trypsinisierung, indem Sie 10 ml Astrozytenkulturmedien hinzufügen. Übertragen Sie abgetrennte Astrozyten durch Zentrifugation bei 300 x g für 5 min auf eine 50 ml konische Röhre und Pelletzellen. Aspirieren Sie überstand und suspendiert die Zellen in 40 ml Astrozytenkulturmedien.
  7. Waschen Sie die poly-D-Lysin-beschichteten T75-Kolben zweimal mit sterilem Wasser und Platte 20 ml der gereinigten Astrozytensuspension. Kehren Sie zum 37 °C und 5% CO2-Inkubator zurück. Ändern Sie die Astrozytenkulturmedien alle zwei Tage für weitere 10 Tage, bis die Astrozyten reifen.
    HINWEIS: Jeder T75-Kolben gereinigter Astrozyten sollte ausreichen, um 2 neue T75-Flaschen mit je 3 x 105 Zellen bei der Beschichtung zu produzieren.
  8. Wiederholen Sie die Schritte 2.5-2.7 für nachfolgende Durchgänge oder zu Plattenastrozyten für die Mikroskopie.
    ANMERKUNG: Die Reinheit der Astrozytenkulturen nach zugabe von AraC und anschließender Reinigung kann qualitativ durch Hellfeldmikroskopie beurteilt werden, genauer gesagt durch Quantifizierung des Prozentsatzes des Glialfibrillary Acid Proteins (GFAP)-positive Zellen pro Sichtfeld in fluoreszierenden Bildern (Abbildung 1B,C).

3. Transfektion von fluoreszierend getaggten Plasmiden

  1. Am Tag vor der Transfektion oder Etikettierung, Samen-Astrozyten mit der gewünschten Dichte für die Bildgebung 24-48 h Post-Transfektion. Eine empfohlene Dichte für 24-Well-Platten oder 14 mm Glasbodenbrunnen beträgt 2 x 104 Zellen/Well.
    HINWEIS: Dieses Protokoll ist für die Transfektion von Astrozyten optimiert, die auf 12 mm Glasabdeckungen auf 24-Well-Platten oder 14 mm Glasbodenbrunnen mit einem Lipofection-basierten Verfahren plattiert sind. Reagenzien sollten je nach Größe des Kulturgerichts, in dem die Astrozyten wachsen, skaliert werden.
  2. Verdünnen Sie das Lipofektionsreagenz (Materialtabelle) in reduzierten Serummedien (Materialtabelle). Um das Verhältnis von Lipofektionsreagenz zu DNA zu optimieren, testen Sie eine Reihe von ausreichenden Verdünnungen. Wenn Sie z. B. das in diesem Protokoll verwendete Reagenz verwenden (Materialtabelle), 2, 3, 4 und 5 l des Lipofektionsreagenzes in 50 l reduzierten Serummedien verdünnen.
  3. Verdünnen Sie 5 g hochreine DNA in 250 l reduzierten Serummedien. Fügen Sie 5 l Lipofection Enhancer Reagenz (Tabelle der Materialien) hinzu. Kombinieren Sie die Tube, die das Lipofektionsreagenz enthält, mit einem gleichen Volumen der DNA-Lipofection Enhancer-Mischung. Durch Pipettieren mischen und bei Raumtemperatur (RT) für 15 min inkubieren.
  4. Entfernen Sie Astrozytenkulturmedien und fügen Sie den Zellen tropfenweise einen Transfektionsmix (Schritt 3.3) hinzu. Nach einer 6-h-Inkubation bei 37°C und 5% CO2 ersetzen Sie den Transfektionskomplex durch ein entsprechendes Volumen an Astrozytenkulturmedien (2 ml für 14 mm Glasbodenschalen). Inkubieren Sie für weitere 24 x 72 h, bevor Sie mit der Bildaufnahme fortfahren. Beobachten Sie die Dauer des Inkubationsschritts genau, um das beste Gleichgewicht zwischen Proteinexpression und Zelllebensfähigkeit zu erreichen.

4. Kennzeichnung von späten Endosomen/Lysosomen mit fluoreszierenden Sonden

HINWEIS: Einige Ladungen können mit fluoreszierenden Farbstoffen mit hoher Affinität für ladungsspezifische Proteine gekennzeichnet werden. Das folgende Beispiel ermöglicht die Kennzeichnung von späten Endosomen/Lysosomen mit einer fluoreszierenden sinatropen Sonde.

  1. Verdünnen Sie die lysosomal-etikettierende Sonde (Materialtabelle) in 200 l Astrozytenkulturmedien auf eine Arbeitskonzentration von 1 m und gelten für Astrozyten ab Schritt 3.1 bei einer Dichte von 2 x 104 Zellen/Well. 30 min bei 37 °C inkubieren.
  2. Waschen Sie die Zellen einmal mit warmen Astrozytenkulturmedien und ersetzen Sie durch bildgebende Medien (Tabelle der Materialien). Fahren Sie sofort mit der Live-Bildgebung fort.

5. Bildaufnahme mit einem Zeitraffer-Bildgebungssystem

HINWEIS: Die Zeitraffer-Live-Bildgebung sollte mit einem Fluoreszenzmikroskop durchgeführt werden, das mit einer Hochgeschwindigkeitskamera, einem bestimmten Fokus, einer Inkubationskammer und einem 40-fachen Ölobjektiv mit einer hohen numerischen Blende (z. B. Plan-Apochromat 1.4NA) ausgestattet ist. Für die Zeitraffer-Bildgebung steht eine Vielzahl von Erfassungssoftware zur Verfügung. Die Auswahl des Mikroskopiesystems und der Erfassungssoftware sollte auf deren Verfügbarkeit und Eignung für die Ziele der jeweiligen Studie basieren. Im Folgenden finden Sie einige allgemeine Richtlinien.

  1. Legen Sie die Kulturkammer oder Schale in den richtigen Adapter auf der Mikroskopbühne. Wählen Sie mithilfe von Epifluoreszenzlicht die Zelle(n) aus, die fluoreszierende Proteine oder Sonden ausdrücken, um sie aufzuzeichnen. Passen Sie die fluoreszierende Probenbeleuchtung an, um die ausgewählten Zellen mit der Digitalkamera zu visualisieren. Vermeiden Sie hohe Beleuchtung, die Photobleichungen und Phototoxizität verursachen könnte. Passen Sie den Fokus und den Zoom an.
  2. Erfassen Sie einzelne Z-Stack-Zeitrafferserien mit einer Frequenz von 1 Frame alle 2 s für Zeitintervalle zwischen 300 s und 500 s mit den Zoom- und bestimmten Fokusfunktionen.
    ANMERKUNG: Die Handelsdynamik (Geschwindigkeit, Bewegungshäufigkeit usw.) variiert je nach Protein des Interesses, so dass der Zeitverlauf des Erwerbs angepasst werden muss. Zum Beispiel sind Mitochondrien weniger motil als Lysosomen und weisen häufige Pausen auf. In diesem Fall ist es besser, die Erfassungsparameter auf 1 Frame alle 5 s für 800 s einzustellen.
  3. Speichern Sie Zeitrafferbilder und exportieren Sie sie als AVI- oder TIFF-Stack-Dateien.

6. Bildanalyse

HINWEIS: Die Bildanalyse wurde mit dem KymoToolBox Plugin für ImageJ/Fiji16durchgeführt. Detaillierte Schritt-für-Schritt-Schriftliche Anweisungen sind online verfügbar17. Die folgenden abgekürzten Schritte sollten ausreichen, um die Kymographen zu erstellen und die Partikeltransportparameter zu extrahieren.

  1. Öffnen Sie die Zeitraffer-Bildsequenz in der ImageJ/Fiji-Software. Importieren Sie Bilder aus dem Menü Datei als AVI- oder TIFF-Stack-Dateien. Konvertieren Sie die Bilder in 8-Bit oder 16-Bit, indem Sie einen dieser Bildtypen mithilfe des Werkzeugs Typ im Menü Bild auswählen. Wenn Sie mit RGB-Dateien arbeiten, teilen Sie Kanäle mit dem Werkzeug "Kanal teilen", das unter der Funktion Farbe im Menü Bild verfügbar ist.
  2. Um einen Kymographen (Darstellung in Position und Zeit der Partikelbahnen) zu erzeugen, zeichnen Sie jede Spur, in der sich Partikel bewegen, indem Sie eine Linie entlang der Flugbahnen der Teilchen mit dem segmentierten Linienwerkzeug verfolgen. Um die Richtung der Bewegung korrekt zuzuweisen, zeichnen Sie die Polylinie mit der gleichen gewünschten Richtungskonvention für alle Filme, sodass die Polarität innerhalb und über alle untersuchten Zellen konsistent ist. Zeichnen Sie beispielsweise die Polylinie von der Mitte der Zelle in Richtung Peripherie oder umgekehrt. Passen Sie die Linienbreite an die Dicke der Spur an, indem Sie auf das Linienwerkzeug doppelklicken.
  3. Führen Sie das Draw Kymo-Makro des KymoToolBox-Plugins mit einer Linienbreite von 10 aus. Es wird eine Aufforderung angezeigt, das Bild in zeitweise (Anzahl der Frames, Bildrate) und Leerzeichen (x,y-Auflösung) zu kalibrieren. Nach der Kalibrierung werden die Kymographen generiert und können als TIFF-Dateien für die Datendarstellung oder weitere Partikelanalyse gespeichert werden.
  4. Weisen Sie Partikelbahnen zu, indem Sie jedes Partikel im Kymographen manuell mit dem segmentierten Linienwerkzeug für die gesamte Dauer der Erfassung verfolgen. Zeichnen Sie jede Partikelbahn als Region von Interesse (ROI) mit dem ROI-Manager-Tool auf, das Sie im Menü Analysieren/Tools finden. Speichern Sie alle ROIs pro Zeitraffervideo für weitere Analysen.
    HINWEIS: Es ist wichtig, die richtige Flugbahn für einzelne Teilchen auf dem Kymographen zuzuweisen, um die genaueste Berechnung der Transportparameter zu erreichen.
    1. Führen Sie das Analyze Kymo-Makro des KymoToolBox-Plugins aus. Im Dropdown-Menü wird ein Fenster geöffnet, in dem sie darum bittet, die "nach außen gerichtete" Richtung der Partikelbewegung (von links nach rechts oder umgekehrt) zu definieren. Diese Auswahl hängt von der Position der fluoreszierenden Ladungen ab, die relativ zum Kern oder zur Zellperipherie abgebildet sind, wie in Schritt 6.2 festgelegt. Wenn z. B. der Kern links von den Ladungen positioniert ist und die Polylinie in Schritt 6.2 vom Kern weggezogen wurde, definieren Sie die äußere Partikelbewegung als "von links nach rechts".
    2. Definieren Sie die Grenzgeschwindigkeit (Mindestgeschwindigkeit, mit der eine Ladung als motil betrachtet wird) im Fenster Kymo analysieren. Für Ladungen, die sich mit schnellen intrazellulären Transportgeschwindigkeiten bewegen, sind 0,1 m/Sekunde eine geeignete Wahl. Ändern Sie diesen Wert, um die Empfindlichkeit der Software für jede Ladung von Interesse anzupassen. Passen Sie die Linienbreite an die Dicke jeder Partikelbahn an.
    3. Wählen Sie im Fenster Kymo analysieren die Optionen Alle Daten protokollieren und extrapolierte Koordinaten protokollieren aus. Dadurch werden verschiedene Parameter für den Frachttransport berechnet, einschließlich mittlerer Geschwindigkeit, Nachinnengeschwindigkeit, Zuggeschwindigkeit, kumulierte zurückgelegte Strecke, zurückgelegte Strecke in Ein- oder Nachfahrtsrichtung, Anzahl der Schalter für jedes Teilchen, Prozentsatz der Zeit sich in jede Richtung bewegen oder angehalten usw. Die für einzelne Spuren berechneten Daten werden dann per Kymograph gepoolt und in Textdateien gespeichert, die für jedes Bild spezifisch sind.
      HINWEIS: Die Option Farbiges Kymo anzeigen des Kymo-Makros analysieren generiert eine farbcodierte Überlagerung des Pfads über den ursprünglichen Kymographen. Partikel, die nach außen reisen, sind in Grün, nach innen in Rot und stationäre Partikel in Blau gefärbt. Die Option "Berichtskoordinaten auf Originalstapel" des Makros Kymo analysieren generiert eine farbcodierte Überlagerung der Position des extrapolierten Objekts auf dem ursprünglichen Zeitraffervideo und Kymographen.

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Ergebnisse

Das oben beschriebene Protokoll zur Etablierung primärer Maus-MD-Astrozyten sollte reproduzierbare, hochwertige Kulturen liefern. Obwohl Kulturen zunächst eine Mischung aus Astrozyten, Fibroblasten und anderen Gliazellen, einschließlich Mikroglia und Oligodendrozyten enthalten (Abbildung 1Bi,Biv; rote Pfeilspitzen), minimiert die Zugabe von AraC zur Mischkultur zwischen DIV5-DIV7 die Proliferation dieser Schadstoffzellen. Die kombinierte AraC-Behandlungs- und Schüttelreinigu...

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Diskussion

Hier beschreiben wir einen experimentellen Ansatz, um fluoreszierend markierte Organellen und Membranproteine von Interesse mithilfe der Zeitraffer-Videomikroskopie in hochreinen primären Maus-Kortikus-Astrozyten auszudrücken, zu visualisieren und zu verfolgen. Wir skizzieren auch eine Methodik zur Messung der Partikeldynamik. Die direkte Visualisierung der Protein- und Organellendynamik in primären Astrozyten bietet ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Regulierung des intrazellulären Transports in diesen Zellen in vitr...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

DNL wurde von der University of North Carolina at Chapel Hill (UNC) School of Medicine als Simmons Scholar unterstützt. TWR wurde von UNC PREP Grant R25 GM089569 unterstützt. Die Arbeit mit der Kerneinrichtung des UNC Neuroscience Center Microscopy wurde teilweise durch Fördermittel des NIH-NINDS Neuroscience Center Support Grant P30 NS045892 und des NIH-NICHD Intellectual and Developmental Disabilities Research Center Support Grant U54 unterstützt. HD079124.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2,5 % Trypsin (10x)Gibco15090-046
TischzentrifugeThermo Scientific75-203-637Sorvall ST8 Zentrifuge Zellkultur-Zentrifuge
in ZellkulturqualitätWater Gen Clone25-511
ZellkulturmikroskopZeissWSN-AXIOVERT A1Vert.A1 Inverses Zielfernrohr, Inverses Gewebekulturmikroskop mit Fluoreszenzfunktion
Cytosin ArabinosidSigmaC1768-100MG(AraC) Lyophilisiertes Pulver in sterilem Wasser in Zellkulturqualität auflösen, um eine 10 mM Brühe herzustellen, aliquotieren und für die Langzeitlagerung einfrieren
DAPISigmaD9542-5MGLyophilisiertes Pulver in deionisiertem Wasser auf eine maximale Konzentration von 20 mg/ml auflösen, je nach Bedarf erhitzen oder beschallen. Bei 300 nM zum Gegenfärben verwenden.
PräpariermikroskopZeissStemi 305
PräparierschereF.S.T14558-09
Dulbecco's Modified Eagle MediumGen Clone25-500
Fötales RinderserumGemini100-106Hitzeinaktiviert
FIJI (Fiji ist nur Image J)NIHVersion 1.52i
Pinzette mit feiner SpitzeF.S.T11254-20Style #5
FluoreszenzlichtquelleExcelitas012-63000X-Cite 120Q
GFAP-AntikörperCell Signaling3670SGFAP (GA5) Maus monoklonaler Antikörper
GlasbodenschalenMattek CorporationP35G-1.5-14-C35 mm Schale | Nr. 1.5 Deckglas | 14 mm Glasdurchmesser | Unbeschichtete
Graefe PinzetteF.S.T11054-10Graefe Irispinzette mit gebogenen Spitzen
Grün fluoreszierender Farbstoff, der saure Kompartimente (späte Endosomen und Lysosomen) färbtTechnologiesL7526LysoTracker Grün DND 26. Voraufgelöst in DMSOS zu einer 1 mM Stammlösung. Auf die endgültige Arbeitskonzentration in dem Wachstumsmedium oder Puffer der Wahl verdünnen.
Hank's Balanced Salt Solution (10x)Gibco14065-056Magnesium- und kalziumfrei
Imaging MediaLife TechnologiesA14291DJLive Cell Imaging Solution
Inverses konfokales MikroskopZeissLSM 780
KymoToolBoxhttps://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox
Lipofection Enhancer ReagenzLife Technologies11514015Plus Reagenz
Lipofektion ReagenzLife Technologies15338100Lipofectamine LTX Reagenz
Orbitaler SchüttinkubatorNew Brunswick Scientific8261-30-1008Innova 4230 , orbitaler Schüttelinkubator mit Temperatur- und Drehzahlregelung
Penicillin/Strepomycin-Lösung (100x)Gen Clone25-512
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (10x)Gen Klon25-507x
Poly-D-LysinhydrobromidSigmaP7405In Tris-Puffer, pH 8,5, bei 1 mg/ml auflösen. Für die Langzeitlagerung einfrieren. Vermeiden Sie Gefrier- und Auftauzyklen
Reduziertes SerummediumGibco31985-062OPTI-MEM
GewebekulturflaschenOlympus Plastics25-20975 cm^2. 100 % abgewinkelter Halszugang, hydrophobe belüftete Filterkappe mit 0,22 μm
Gewebekultur-InkubatorThermo Scientific51030285HERAcell VIOS 160i, Gewebekultur-Inkubator mit Temperatur-, Feuchtigkeits- und CO2-Kontrolle
Tris-BaseSigmaT15038,402 g gelöst zu einem Liter in Wasser mit 4,829 g Tris HCl zu 0,1 M Tris-Puffer, pH 8,5
Tris-HClSigmaT32534,829 g gelöst zu einem Liter in Wasser mit 8,402 g Tris Base zu 0,1 M Tris-Puffer, pH 8,5
Trypsin-EDTA (0,25%), PhenolrotGibco25200072
VakuumfiltersystemeOlympus Plastics25-227500 ml, PES-Membran, 0,22 & Mikro; m
Vannas Schere geradeRobozRS-5620
Life

Referenzen

  1. Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
  2. Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner. Trends in Neurosciences. 22 (5), 208-215 (1999).
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