Hier beschreiben wir eine In-vitro-Live-Imaging-Methode zur Visualisierung des intrazellulären Transports von Organellen und des Handels mit Plasmamembranproteinen in murinen Astrozyten. Dieses Protokoll stellt auch eine Bildanalysemethodik zur Bestimmung von Frachttransportrouten und Kinetik dar.
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Methodenartikel
Visualisierung und Analyse des intrazellulären Transports von Organellen und anderen Ladungen in Astrozyten
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Astrozyten gehören zu den häufigsten Zelltypen im erwachsenen Gehirn, wo sie eine Schlüsselrolle in einer Vielzahl von Funktionen spielen. Als zentraler Akteur bei der Homöostase des Gehirns versorgen Astrozyten Neuronen mit lebenswichtigen Metaboliten und puffern extrazelluläres Wasser, Ionen und Glutamat. Astrozyten sind ein integraler Bestandteil der "Tripartiten"-Synapse und sind auch entscheidend für die Bildung, Beschnitt, Wartung und Modulation von Synapsen. Um diese hochinteraktiven Funktionen zu ermöglichen, kommunizieren Astrozyten untereinander und mit anderen Gliazellen, Neuronen, der Gehirnvaskulatur und der extrazellulären Umgebung durch eine Vielzahl von spezialisierten Membranproteinen, die Zell Adhäsionsmoleküle, Aquaporine, Ionenkanäle, Neurotransmitter-Transporter und Spaltknotenmoleküle. Um diesen dynamischen Fluss zu unterstützen, verlassen sich Astrozyten, wie Neuronen, auf eng koordinierten und effizienten intrazellulären Transport. Im Gegensatz zu Neuronen, wo der intrazelluläre Handel umfassend abgegrenzt wurde, wurde der mikrotubulierbasierte Transport in Astrozyten weniger untersucht. Nichtsdestotrotz orchestriert der exo- und endozytische Handel mit Zellmembranproteinen und intrazellulären Organellentransporten die normale Biologie von Astrozyten, und diese Prozesse sind oft bei Krankheiten oder als Reaktion auf Verletzungen betroffen. Hier präsentieren wir ein einfaches Protokoll zur Kultur hochwertiger muriner Astrozyten, zur fluoreszierenden Kennzeichnung von astrozytären Proteinen und Organellen von Interesse und zur Aufzeichnung ihrer intrazellulären Transportdynamik mittels zeitrafferkonfokaler Mikroskopie. Wir zeigen auch, wie man relevante Transportparameter aus den aufgenommenen Filmen mit verfügbaren Bildanalyse-Software (d.h. ImageJ/FIJI) Plugins extrahiert und quantifiziert.
Einleitung
Astrozyten sind die am häufigsten vorkommenden Zellen im erwachsenen Zentralnervensystem, wo sie einzigartige entwicklungs- und heimostatische Funktionen ausführen1. Astrozyten modulieren synaptische Entwicklung durch direkten Kontakt mit prä- und postsynaptischen Terminals als Teil der Tripartit-Synapse, die Neurotransmitter-Rezeptoren, Transporter und Zelladhäsionsmoleküle enthält, die die Synapsenbildung erleichtern und Neuron-Astrozyten-Kommunikation2. Darüber hinaus steuern Astrozyten aktiv die synaptische Übertragung und verhindern neuronale Exzitotoxizität, indem sie exzitatorische Neurotransmitter schnell aus dem....
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Protokoll
Alle tierischen Eingriffe wurden mit Genehmigung der University of North Carolina im Chapel Hill Animal Care and Use Committee (IACUC) durchgeführt.
1. Hirnsektion und Kultur der primären Mausastrozyten
HINWEIS: Das folgende Protokoll wurde von veröffentlichten Methoden angepasst, die dem ursprünglichen Verfahren folgen, das von McCarthy und deVellis13,14,15entwickelt wurde. Gemischte Zellkulturen von McCarthy/deVellis (MD)-Astrozyten werden aus postnatalen Tag 2-4 (P2-P4) Mauskortika hergestellt, mit einem anti-mitotische....
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Ergebnisse
Das oben beschriebene Protokoll zur Etablierung primärer Maus-MD-Astrozyten sollte reproduzierbare, hochwertige Kulturen liefern. Obwohl Kulturen zunächst eine Mischung aus Astrozyten, Fibroblasten und anderen Gliazellen, einschließlich Mikroglia und Oligodendrozyten enthalten (Abbildung 1Bi,Biv; rote Pfeilspitzen), minimiert die Zugabe von AraC zur Mischkultur zwischen DIV5-DIV7 die Proliferation dieser Schadstoffzellen. Die kombinierte AraC-Behandlungs- und Schüttelreinigu.......
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Diskussion
Hier beschreiben wir einen experimentellen Ansatz, um fluoreszierend markierte Organellen und Membranproteine von Interesse mithilfe der Zeitraffer-Videomikroskopie in hochreinen primären Maus-Kortikus-Astrozyten auszudrücken, zu visualisieren und zu verfolgen. Wir skizzieren auch eine Methodik zur Messung der Partikeldynamik. Die direkte Visualisierung der Protein- und Organellendynamik in primären Astrozyten bietet ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Regulierung des intrazellulären Transports in diesen Zellen in vitr.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
DNL wurde von der University of North Carolina at Chapel Hill (UNC) School of Medicine als Simmons Scholar unterstützt. TWR wurde von UNC PREP Grant R25 GM089569 unterstützt. Die Arbeit mit der Kerneinrichtung des UNC Neuroscience Center Microscopy wurde teilweise durch Fördermittel des NIH-NINDS Neuroscience Center Support Grant P30 NS045892 und des NIH-NICHD Intellectual and Developmental Disabilities Research Center Support Grant U54 unterstützt. HD079124.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 2,5 % Trypsin (10x) | Gibco | 15090-046 | |
| Tischzentrifuge | Thermo Scientific | 75-203-637 | Sorvall ST8 Zentrifuge Zellkultur-Zentrifuge |
| in Zellkulturqualität | Water Gen Clone | 25-511 | |
| Zellkulturmikroskop | Zeiss | WSN-AXIOVERT A1 | Vert.A1 Inverses Zielfernrohr, Inverses Gewebekulturmikroskop mit Fluoreszenzfunktion |
| Cytosin Arabinosid | Sigma | C1768-100MG | (AraC) Lyophilisiertes Pulver in sterilem Wasser in Zellkulturqualität auflösen, um eine 10 mM Brühe herzustellen, aliquotieren und für die Langzeitlagerung einfrieren |
| DAPI | Sigma | D9542-5MG | Lyophilisiertes Pulver in deionisiertem Wasser auf eine maximale Konzentration von 20 mg/ml auflösen, je nach Bedarf erhitzen oder beschallen. Bei 300 nM zum Gegenfärben verwenden. |
| Präpariermikroskop | Zeiss | Stemi 305 | |
| Präparierschere | F.S.T | 14558-09 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gen Clone | 25-500 | |
| Fötales Rinderserum | Gemini | 100-106 | Hitzeinaktiviert |
| FIJI (Fiji ist nur Image J) | NIH | Version 1.52i | |
| Pinzette mit feiner Spitze | F.S.T | 11254-20 | Style #5 |
| Fluoreszenzlichtquelle | Excelitas | 012-63000 | X-Cite 120Q |
| GFAP-Antikörper | Cell Signaling | 3670S | GFAP (GA5) Maus monoklonaler Antikörper |
| Glasbodenschalen | Mattek Corporation | P35G-1.5-14-C | 35 mm Schale | Nr. 1.5 Deckglas | 14 mm Glasdurchmesser | Unbeschichtete |
| Graefe Pinzette | F.S.T | 11054-10 | Graefe Irispinzette mit gebogenen Spitzen |
| Grün fluoreszierender Farbstoff, der saure Kompartimente (späte Endosomen und Lysosomen) färbt | Technologies | L7526 | LysoTracker Grün DND 26. Voraufgelöst in DMSOS zu einer 1 mM Stammlösung. Auf die endgültige Arbeitskonzentration in dem Wachstumsmedium oder Puffer der Wahl verdünnen. |
| Hank's Balanced Salt Solution (10x) | Gibco | 14065-056 | Magnesium- und kalziumfrei |
| Imaging Media | Life Technologies | A14291DJ | Live Cell Imaging Solution |
| Inverses konfokales Mikroskop | Zeiss | LSM 780 | |
| KymoToolBox | https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox | ||
| Lipofection Enhancer Reagenz | Life Technologies | 11514015 | Plus Reagenz |
| Lipofektion Reagenz | Life Technologies | 15338100 | Lipofectamine LTX Reagenz |
| Orbitaler Schüttinkubator | New Brunswick Scientific | 8261-30-1008 | Innova 4230 , orbitaler Schüttelinkubator mit Temperatur- und Drehzahlregelung |
| Penicillin/Strepomycin-Lösung (100x) | Gen Clone | 25-512 | |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (10x) | Gen Klon | 25-507x | |
| Poly-D-Lysinhydrobromid | Sigma | P7405 | In Tris-Puffer, pH 8,5, bei 1 mg/ml auflösen. Für die Langzeitlagerung einfrieren. Vermeiden Sie Gefrier- und Auftauzyklen |
| Reduziertes Serummedium | Gibco | 31985-062 | OPTI-MEM |
| Gewebekulturflaschen | Olympus Plastics | 25-209 | 75 cm^2. 100 % abgewinkelter Halszugang, hydrophobe belüftete Filterkappe mit 0,22 μm |
| Gewebekultur-Inkubator | Thermo Scientific | 51030285 | HERAcell VIOS 160i, Gewebekultur-Inkubator mit Temperatur-, Feuchtigkeits- und CO2-Kontrolle |
| Tris-Base | Sigma | T1503 | 8,402 g gelöst zu einem Liter in Wasser mit 4,829 g Tris HCl zu 0,1 M Tris-Puffer, pH 8,5 |
| Tris-HCl | Sigma | T3253 | 4,829 g gelöst zu einem Liter in Wasser mit 8,402 g Tris Base zu 0,1 M Tris-Puffer, pH 8,5 |
| Trypsin-EDTA (0,25%), Phenolrot | Gibco | 25200072 | |
| Vakuumfiltersysteme | Olympus Plastics | 25-227 | 500 ml, PES-Membran, 0,22 & Mikro; m |
| Vannas Schere gerade | Roboz | RS-5620 |
Referenzen
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner. Trends in Neurosciences<....
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Nachdrucke und Genehmigungen
