Prospektion mikrobielle Stämme für Bioremediation und Probiotika Entwicklung für Metaorganismus Forschung und Konservierung

Die Umweltverschmutzung ist ein wichtiges Problem, das die Gesundheit von Mensch, Tier und Pflanze weltweit beeinträchtigt. Obwohl Verschmutzung natürlich sein kann, wie vulkanische Asche^1,sind menschliche Aktivitäten die Hauptursache für die meisten Verschmutzungen. Anthropogene Aktivitäten kontaminieren Boden, Wasser und Luft, die direkt oder indirekt zu fast 20 Millionen vorzeitigen Todesfällen bei Menschen^{führen 2} und jährlich Milliarden anderer Lebensformen dezimieren. Schadstoffe sind auch in den entlegensten Gebieten des Planeten vorhanden. So wurden beispielsweise Bei Wirbellosen und Polarsäugetieren in der Tiefsee schwereMetalle und persistente organische Verbindungen nachgewiesen.

Die Meeresumwelt wurde besonders von der Verschmutzung betroffen. Für eine lange Zeit wurde angenommen, dass der Ozean unberührt bleiben würde und eine endlose Quelle von Gütern wegen seiner massiven Wassermenge liefern würde⁵. Aus diesem Grund haben alle Arten von Industrie n. Chr. und Institutionen Abfälle in Gewässern seit Jahrhunderten frei freigesetzt^6,7. Mehrere Verunreinigungen aller Art, wie Kunststoff⁸, synthetische Hormone⁹, Pestizide¹⁰, Öl¹¹, Nährstoffe¹², Schwermetalle³und radioaktive Abfälle¹³ wurden als Auswirkungen gemeldet Ökosysteme der Ozeane. In diesem Zusammenhang gehören Korallenriffe zu den wichtigsten und empfindlichsten Ökosystemen in^{Meeresumwelten 14}. Riffe sind Küstenschützer, die für die Entwicklung Tausender Meeresarten von entscheidender Bedeutung sind, da sie eine wesentliche Rolle beim Nährstoffkreislauf und bei der Klimatisierung spielen. Riffe tragen auch zur Wirtschaft bei, indem sie unter anderem Fisch, Waren und Tourismus anbieten, unter anderem¹⁵. So sind beispielsweise 4,5 Milliarden Menschen von Meeresfischen als Hauptnahrungsquelle¹⁶abhängig, die stark von Korallenriffen unterstützt werden.

Ungeachtet ihrer ökologischen, sozialen und wirtschaftlichen Bedeutung werden Korallenriffe dezimiert^17,18. Anthropogene Aktivitäten sind in erster Linie dafür verantwortlich, zu den drei Hauptursachen des Korallensterbens beizutragen: Klimawandel, Überfischung und Wasserverschmutzung¹⁹. Auch wenn es wichtig ist, an der Eindämmung der globalen Erwärmung zu arbeiten, ist es auch wichtig, an der Minimierung der lokalen Kontamination, einschließlich der Wasserverschmutzung, zu arbeiten, die entscheidend zum Rückgang der Korallen beitragen kann²⁰. Daher ist es dringend erforderlich, Strategien zur Erhöhung der Lebensdauer von Korallen zu entwickeln, die ihnen zusätzliche Zeit zum Anpassen und Überleben verschaffen könnten.

In dieser Hinsicht ist es äußerst wichtig, Lösungen zu finden, um Kontamination zu minimieren und Strategien zu entwickeln, um die Fitness von Korallen zu erhöhen. Strategien zur Sanierung von Meeresschadstoffen sind sehr vielfältig und können in physikalische, chemische und biologische Ansätze eingeteilt werden. Physische Ansätze sind hilfreich. Sie sind jedoch nicht immer effizient. So können beispielsweise Kunststoffabfälle durch physikalische Entfernung minimiert werden, während wasserlösliche Verbindungen andere Methoden benötigen, um beseitigt zu werden. Beispiele für solche Verbindungen sind Rohöl, das durch Tätigkeiten der Ölindustrie freigesetzt wird und verschüttet wird, sowie andere Mikroverunreinigungen, wie synthetische Hormone, die normalerweise als östrogene Komponente in oralen Kontrazeptiva verwendet werden und in Abwasser²¹ vorhanden sind, ²². Die Verwendung chemischer Stoffe zur Verringerung der Kontamination kann ein spezifisches Problem lösen, aber sie kann auch eine zusätzliche Verschmutzungsquelle darstellen. Dies ist der Fall bei chemischen Dispergiermitteln zur Milderung der Ölkontamination, die als noch giftiger für marine Ökosysteme beschrieben wurden als die Ölkontamination selbst²³. Aus diesen Gründen bieten biologische Ansätze im Vergleich zu den anderen Methoden mehrere Vorteile. Bio-Remediation ist die Fähigkeit lebender Organismen oder ihrer Stoffwechselprodukte, Verunreinigungen in weniger toxische oder ungiftige Formen umzuwandeln²⁴. Die Hauptvorteile des Einsatzes biologischer Methoden sind Nachhaltigkeit, relativ niedrige Kosten, die Tatsache, dass sie umweltfreundlich sind, und dass sie in verschiedenen Ökosystemen angewendet werden können, was minimale oder weniger Auswirkungen auf die Umwelt verursacht^{21, 25,26,27}.

Darüber hinaus ermöglicht die Manipulation der mikrobiellen Gemeinschaft in einer Umgebung einen zusätzlichen potenziellen Vorteil. Es gibt Mikrobiome, die mit Wirten verbunden sind und für ihre Gesundheit unerlässlich sind. Es ist bekannt, dass diese zugehörigen symbiotischen Mikrobiome notwendig sind, um die Hosthomöostase¹⁹aufrechtzuerhalten. Die Manipulation dieser assoziierten Mikroorganismen wurde gut für Wirte wie Pflanzen und Säugetiere^{erforscht 28,29}, aber die Verwendung von Korallenprobiotika ist immer noch neu¹⁵. Korallen beherbergen auch, interagieren mit und sind auf große und spezifische Populationen von Mikroorganismen angewiesen, um¹⁹zu überleben. Die Rolle dieser mikrobiellen Gemeinschaften in der Gesundheit und Dysbiose von Korallen ist aktiv untersucht, aber es ist noch weit davon entfernt, vollständig verstanden werden³⁰. Eine der beliebtesten Hypothesen wird die Korallen probiotische Hypothese genannt. Es deutet auf eine dynamische Beziehung zwischen symbiotischen Mikroorganismen und Umweltbedingungen hin, die die Auswahl der vorteilhaftesten Korallenmetaorganismen^{31 bewirkt.} Basierend auf diesen Informationen, wichtige potenzielle probiotische Mechanismen, sowie die Strategien für die Isolierung, Manipulation, und Lieferung von nützlichen Mikroorganismen für Korallen (BMCs) für mehrere Zwecke, wurden^{vorgeschlagen 32} und getestet³³. Zu diesen potentiellen positiven Eigenschaften gehören die Widerstandsfähigkeit gegen Temperaturanstieg, der Schutz vor reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), die Stickstofffixierung, die Beständigkeit gegen Verunreinigungen und die biologische Bekämpfung gegen Krankheitserreger, unter anderem³².

Diese Studie konzentriert sich auf die Auswahl von BMCs und frei lebenden Mikroorganismen, die die Fähigkeit darstellen, zwei Schadstoffe zu abbauen, die häufig in Meeresumgebungen vorkommen: das synthetische Östrogen 17a-ethinylestradiol (EE2) und Rohöl. Schadstoffe, die Hormonwirkstoffe enthalten, sind oft in Gewässern^{vorhanden 34,35,36,37,38,39,40, 41,42}. Unter ihnen, synthetische östrogene endokrine Disruptor Verbindungen (EDCs) imitieren die Wirkung von Östrogenen auf Zielzellen, verursacht mehrere Auswirkungen auf Tiere, einschließlich Brustkrebs, Unfruchtbarkeit, und Hermaphroditism⁹. EE2 wird vom Menschen wegen der Verwendung oraler Kontrazeptiva ausgeschieden. Es wird von herkömmlichen Kläranlagen nicht aus dem Abwasser entfernt und hat auch bei sehr geringen Konzentrationen (z.B. ng/L oder g/L)^43,44,45negative Auswirkungen. Über die Auswirkungen von Östrogenen auf die Korallenphysiologie ist wenig bekannt^46,47. Bei anderen wirbellosen Meerestieren, wie Schwämmen, Krebstieren und Weichtieren, wurden jedoch Östrogene berichtet, die mehrere negative Auswirkungen verursachten, die hauptsächlich mit der Fortpflanzung zusammenhingen, wie entwicklung und/oder Stimulation von Gameten, Protein-Aktionen, Probleme in embryonalen Prozessen, und andere^{48,49,50,51,52}. Die negativen Folgen der EE2-Kontamination unterstreichen die Notwendigkeit, nachhaltige Ansätze zu entwickeln, um diese Verbindung aus der Umwelt zu entfernen, ohne die Meereslebewesen zu beeinträchtigen.

Parallel dazu, mit Öl derzeit fast 40% der weltweit verbrauchten Energiequellen⁵³, chronische Kontamination und Ölverschmutzungen häufig in der Nähe von Riffgebieten^{auftreten 11}. Ölkontamination wurde berichtet, negative Auswirkungen bei mehreren Arten von Meerestieren, Vögeln, Pflanzen und Menschen^{verursachen 54,55,56,57}. Auf Korallen verursacht es Bleichen, reduziert den Widerstand von Larven gegen thermischen Stress⁵⁸, stört die mikrobiellen assoziierten Gemeinschaften²¹, und verursacht Gewebenekrose. Darüber hinaus sind chemische Dispergiermittel, eine Ölsanierungstechnik, die häufig von Ölgesellschaften zur Behebung von Verschmutzungen verwendet wird, für Korallen noch giftiger als das Öl selbst²³. Günstige Mikroorganismen, die aus Korallen isoliert sind, sind dagegen dafür bekannt, eine entscheidende Rolle bei der Gesundheit des Wirts zu spielen. Jedoch, die Manipulation dieser potenziellen Probiotika müssen besser erforscht werden, um mögliche negative Nebenwirkungen und die metabolischen Kapazitäten zu untersuchen, die überprüft werden können, um die Fitness des Metaorganismus zu verbessern. In diesem Zusammenhang sind Merkmale wie die antimikrobielle Aktivität gegen Korallenpathogene, die Herstellung von Kataalase zur Bekämpfung von oxidativem Stress, die Fähigkeit, Harnstoff zu abbauen (der eine wichtige Rolle im Verkalkungsprozess spielen kann) und das Vorhandensein von Genen die unter anderem potenzielle positive Merkmale verleihen, muss im Mittelpunkt der Untersuchung stehen. Hier zeigen wir, wie Bio-Remediation und Probiotika verwendet werden können, um gleichzeitig die Auswirkungen der Verschmutzung zu mildern und die Gesundheit der Korallen zu verbessern. Die Entwicklung innovativer Ansätze, die als Interventionen zur Erhöhung der Persistenz von Meeresarten eingesetzt werden können, stellt einen Schritt hin zu einem nachhaltigeren und gesünderen Planeten dar.

1. Wasser- und Korallensammlung und -speicherung für mikrobielle Isolierung

HINWEIS: Es ist wichtig, die Koordinaten und die Temperatur der Probenahmestellen zu nehmen. Wenn möglich, können Metadaten wie Salzgehalt, pH-Wert, Tiefe und Lichtintensität auch bei der Suche nach fein abgestimmten Anbauansätzen und der zukünftigen Interpretation von Daten helfen. Für zuverlässige Ergebnisse lagern Sie die Proben so lange wie möglich. Die Wasser-/Korallenmikrobiome können sich erheblich ändern, wenn die Proben nicht auf der richtigen Temperatur gehalten und/oder über einen längeren Zeitraum gelagert werden. Wenn der Isolationsschritt nicht sofort nach der Entnahme durchgeführt wird, ist es wichtig, Proben bis zur Verarbeitung bei 4 °C zu halten. Je länger die Proben gelagert werden, auch bei 4 °C, desto mehr wird sich die mikrobielle Gemeinschaft verändern.

1. Probe und speichern Meerwasser.
   1. Sammeln Sie 500 ml Wasserproben mindestens dreifach von jeder gezielten Probenahmestelle. Verwenden Sie vorzugsweise sterile Flaschen mit Schraubverschlüssen.
   2. Wenn Sie das Wasser sofort nach der Abholung verarbeiten, halten Sie die Flaschen für ein kurzes Intervall bei RT auf. Wenn die Probenverarbeitung später erfolgt, halten Sie die Flaschen bei 4 °C.
2. Probieren und lagern Sie die Koralle.
   1. Verwenden Sie eine sterile Zange, um Korallenfragmente von der gleichen Probenahmestelle der Wasserproben zu schneiden. Um eine Kontamination zu vermeiden, berühren Sie Korallen nur mit sterilen Handschuhen.
   2. Spülen Sie das beprobte Korallenfragment mit 20 ml steriler Salzlösung (3% NaCl in destilliertem Wasser) oder künstlichem Meerwasser, um die lose befestigten frei lebenden Bakterien des Meerwassers loszuwerden.
   3. Mit Zangen jedes Korallenfragment in einen sterilen 250 x 500 ml Behälter mit einer Schraubkappe mit steriler Wäschelösung legen.
   4. Im Labor wiegen mit sterilen Zangen und Zangen 5 g Korallenfragmente mit sterilen 100 mm x 20 mm Petrischalen auf einer Waage.
   5. Übertragen Sie die 5 g Korallenprobe auf einen sterilen Mörtel und mazerieren Sie sie mit einem sterilen Stößel.
   6. Mit einem sterilen Spachtel, übertragen Sie die mazerierte Probe in einen sterilen Kulturkolben mit 45 ml 3% NaCl sterile Lösung und 10-15 Glasperlen von 5 mm. Verwenden Sie einige der 45 ml sterilen Saline-Lösung, um den Mörtel zu waschen und die maximale Menge des Mazerat sanieren.
   7. Halten Sie die Kolben unter ständiger Rührung (150 x g) 16 h bei der Wassertemperatur der Probenahmestelle auf.
      HINWEIS: Bei Flachwasserkorallen liegt die optimale Temperatur zwischen 24 und 28 °C. Dieser Schritt löst Mikroorganismen aus verschiedenen Korallenkompartimenten, wie z. B. denen, die an den Wirtszellen befestigt sind, oder von denen, die im Gewebe und im Skelett leben. Nach diesem Schritt sollten die Korallenmazerate nicht gespeichert werden, und der Isolationsschritt muss sofort durchgeführt werden.

2. Isolierung von EE2-abbauenden Bakterien aus Meerwasser und/oder Korallen

1. Wählen Sie Bakterien.
   HINWEIS: Nach den Schritten 1.1.2 und 1.2.7 ist die Konzentration von Mikroorganismen im Meerwasser, die sich von den verschiedenen Korallenmazeraten gelöst haben, unbekannt und variabel. Um die Isolierung einzelner mikrobieller Kolonien in Petrischalen mit Agarmedien zu gewährleisten, sind serielle Verdünnungen erforderlich.
   1. Führen Sie serielle Verdünnungen bis zu 10^-9 in steriler Salzlösung für Korallenproben und bis zu 10^-6 für Wasserproben durch. Pipette verdünnt 5x nach oben und unten, bevor die Spitze entsorgt wird. Vortex-Proben für 5 s jedes Mal vor der nächsten seriellen Verdünnung.
   2. Pipette 100 l jeder Verdünnung auf Petrischalen mit 3% NaCl Lysogeny Brühe (LB) Agar Medium, und Teller sie.
      HINWEIS: Verwenden Sie Marine-Agar (MA) als alternatives Medium. Für zuverlässige Ergebnisse sind Dreifache jeder Verdünnung erforderlich.
   3. Inkubieren Sie die Platten für 1 bis 3 Tage bei der Zieltemperatur (z. B. 26 °C). Überprüfen Sie die Platten einmal täglich.
   4. Wählen und isolieren Sie die Kolonien, die mit der Streifenplattentechnik unterschiedliche Wachstumsmorphologien auf neuen Platten präsentieren. Wiederholen Sie diesen Schritt so oft wie nötig, um reine Kolonien auf den Tellern wachsen zu lassen.
   5. Wenn das Verfahren nicht sofort fortgesetzt wird, Schritt 2.3.1, lagern Sie Isolate bei 4 °C oder in Glycerin, wie in Abschnitt 2.2 beschrieben.
2. Bereiten Sie Glycerin-Bestände vor.
   HINWEIS: Dieser Schritt ist optional und kann für die langfristige Lagerung von Bakterienbeständen verwendet werden.
   1. Wählen Sie einzelne Kolonien von der frischen Platte oder von den bei 4 °C gelagerten Platten und impfen Sie sie unabhängig voneinander in 2 ml sterilem LB-Medium.
   2. Rohre über Nacht (EIN) bei 24 bis 28 °C unter konstanter Rührung (150 x g)aufstellen.
   3. 1 ml der Bakterienkulturen ab Schritt 2.2.2 und steriles Glycerin zu einer Endkonzentration von 20% zu den 2 ml Kryovials hinzufügen.
   4. Lassen Sie die Kryovials bei 4 °C ein.
   5. Die Glyzerinbakterienbestände bis zum Bedarf auf -80 °C legen.
3. Führen Sie den EE2-Degradationsfähigkeitstest durch.
   1. Aktivieren Sie die Isolate in LB-Brühe oder alternativen Medien. Wählen Sie dazu eine einzelne Kolonie aus den frischen Platten oder der Platte, die bei 4 °C gelagert wird, und impfen Sie 2 ml steriles LB-Medium. Falls es sich um einen Glycerinbestand handelt, streift es zuerst auf LB-Agarplatten und brütet bei 24 bis 28 °C EIN, um einzelne Kolonien wachsen zu lassen. Legen Sie das Rohr mit LB-Medium unter konstanter Rührung geneigt (150 x g) bei 24 bis 28 °C ein.
   2. Nach bakteriellem Wachstum pellet die Zellen durch Zentrifugieren bei 8.000 x g für 8 min bei Raumtemperatur (RT). Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in einem gleichen Volumen (2 ml) Salzwasser, um die verbleibende LB-Brühe zu waschen.
   3. Wiederholen Sie Schritt 2.3.2 zweimal, um sicherzustellen, dass es keine Spuren von Kohlenstoffquelle gibt, und setzen Sie die Zellen in einem gleichen Volumen der Salinelösung wieder auf. Wenn sie z. B. mit einer 2-ml-Kultur gestartet wurde, setzen Sie die Zellen in einem Endvolumen von 2 ml-Salinelösung wieder aus.
   4. Impfen Sie die gewaschenen und resuspendierten Zellen im minimalen Bushnell Haas Kulturmedium (BH Broth), das EE2 als einzige Kohlenstoffquelle^{enthält 59}.
      HINWEIS: EE2 wird in Ethanol in einer Endkonzentration von 5 mg/L im Kulturmedium gelöst. Nehmen Sie bei Bedarf Änderungen an der Schadstoffart und/oder -konzentration vor.
   5. Bewerten Sie das Bakterienwachstum durch optische Dichte bei 600 nm und/oder Kolonien bildende Einheiten (CFU) auf LB Agar Medium³³, für 16-72 h Inkubation.
      HINWEIS: Alternativ können die Mikroorganismen direkt auf minimalen Medien isoliert werden, die EE2 oder andere Verbindungen als einzige Kohlenstoffquelle enthalten. Dieser Schritt würde die Auswahl lenken und unerwünschtes Wachstum vermeiden.

3. Isolierung ölabbauender Bakterien aus Meerwasser und/oder Korallen

1. Bereiten Sie minimale Medien vor, die eine ölwasserlösliche Fraktion (oWSF) und eine ölwasserunlösliche Fraktion (oWIF) als einzige Kohlenstoffquelle enthalten²¹.
   1. Fügen Sie 1 bis 2 % Rohöl zu 500 ml sterilem destilliertem Wasser hinzu. Verwenden Sie einen Filterkolben, der auf der Unterseite geöffnet ist, um die lösliche Fraktion herauszunehmen, ohne die obere Schicht der unlöslichen Fraktion zu stören.
   2. Halten Sie die Mischung bei 24 x 28 °C bei 150 x g für 48 h konstant.
   3. Legen Sie den Filterkolben, der die Rohölfraktionen enthält, auf eine stabile Oberfläche und warten Sie 10 bis 20 min, um eine lösliche und unlösliche Bruchtrennung zu ermöglichen.
   4. Übertragen Sie den oWSF in einen neuen sterilen Kolben, indem Sie den oWIF sparen, indem Sie den unteren Filterkolben öffnen und die lösliche Fraktion herausnehmen.
   5. Bereiten Sie mit allen oWSF, die im vorherigen Schritt wiederhergestellt wurden (ca. 400 ml), 1 L BH-Agar-Mindestmedium vor, das oWSF als einzige Kohlenstoffquelle enthält.
   6. Mit dem oWIF, der ab Schritt 3.1.4 im Kolben verbleibt, bereiten Sie 1 L BH-Agar-Mindestmedium vor, das oWIF als einzige Kohlenstoffquelle enthält.
2. Isolieren Sie oWSF- und oWIF-abbauende Bakterien.
   1. Mit Wasser und Korallenmazerat aus den Schritten 1.1.2 bzw. 1.2.7 die Proben bis^10-6 in steriler Salzlösung, wie in Schritt 2.1.1 beschrieben, verdünnen.
   2. Pipette 100 l jeder Verdünnung auf Petrischalen, die BH-oWSF und BH-oWIF Agarmedien enthalten, und platte.
   3. Wiederholen Sie die von Schritt 2.1.3 bis Schritt 2.1.5 beschriebenen Verfahren.

4. Mitgliederauswahl des Konsortiums

1. Extrahieren und Sequenzieren der DNA zur taxonomischen Identifizierung.
   1. Aktivieren Sie die in Glycerin gelagerten Isolate, wie in Schritt 2.3.1 beschrieben.
   2. Extrahieren Sie die DNA mit einem DNA-Extraktionskit (siehe Tabelle der Materialien).
   3. Verwenden Sie die Primer 27f (5-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3) und 1492r (5-GTT TAC CTT GTT GTT ACG ACT T-3)) für die Verstärkung des 16S rRNA-Gens.
   4. Führen Sie 50-L-PCR-Reaktionen nach folgendem Protokoll durch: 5 l 10x Polymerase-Puffer, 2 mM MgCl₂, 0,2 mM dNTPs, 5 mM jedes Primers, 10 ng genomische DNA und 2,5 U Taq-DNA-Polymerase. Fügen Sie negative Kontrollen (d. h. leere DNA-Extraktionen und PCR-Reaktionen ohne Vorlagen-DNA) hinzu, um sicherzustellen, dass es keine Kontamination gibt.
   5. Richten Sie die folgenden thermischen Radfahrschritte ein: einen ersten Denaturierungszyklus bei 94 °C für 4 min; 35 Zyklen bei 94 °C für 1 min, gefolgt von 50 °C für 1 min und 72 °C für 2,5 min; einen abschließenden Verlängerungszyklus für 10 min bei 72 °C.
   6. Überprüfen Sie die Amplikonintegrität in 1,2% Agarose-Gel mit 80 V.
   7. Gel reinigen die Proben mit einem Gel-Reinigungskit (siehe Materialtabelle).
   8. Quantifizieren Sie PCR-Produkte mit einem Fluorometer.
   9. Produkt zur Sequenzierung senden.
      HINWEIS: Für bessere taxonomische Klassifikationen wird die Sanger-Methode⁶⁰empfohlen, da sie lange Sequenzen bietet. Die universellen Primer 27f und 1492r können verwendet werden, um fast die gesamte Länge des 16S rRNA Gen⁶¹zu verstärken. Wenn Contigs nicht mit einem Paar Primer zusammengesetzt werden können, sollte ein zusätzliches Paar in der Mitte der Sequenz berücksichtigt werden.
2. Bestimmen Sie die Wachstumskurve.
   1. Aktivieren Sie die Isolate in Glycerinbeständen ab Schritt 2.2.5, wie in Schritt 2.3.1 beschrieben, jedoch mit 5 ml statt 2 ml.
   2. Fügen Sie 1% (v/v) der gewachsenen 5 ml Kultur von Schritt 4.2.1 in Triplicaten zu einem 250 ml Kolben hinzu, der 100 ml 3% LB-Medien enthält. Achten Sie darauf, Auch Triplicates einer Negativkontrolle (kein Inokulum) vorzubereiten.
   3. Die Kolben unter ständiger Rührung (150 x g)bei 24 bis 28 °C in einen Inkubator stellen.
   4. Nehmen Sie 1 ml Aliquots alle 4 h für 48 h. Wenn die Stämme eine hohe Wachstumsrate aufweisen, verringern Sie das 4-H-Intervall.
   5. Messen Sie die optische Dichte (OD) Schätzung bei 600 nm Wellenlänge und Koloniebildenden Einheiten (CFU) aus seriellen Verdünnungen, die auf Rich Media Platten plattiert sind (100 l sollten in jeder Platte geimpft und auf das Volumen von 1 ml normalisiert werden).
   6. Zeichnen Sie die OD- und CFU-Kurven auf und analysieren Sie die Korrelation von OD/CFU jeder einzelnen Sorte. Berechnen Sie von nun an die Anzahl der Zellen basierend auf den OD-Werten.
3. Führen Sie einen Antagonismustest durch.
   1. Aktivieren Sie die Isolate wie in Schritt 2.3.1 beschrieben.
   2. Impfen Sie eine Sorte nach der anderen entlang der Mitte von Platten, die Agarmedien enthalten, und die anderen senkrecht zum zentralen. Wiederholen Sie dies, bis jeder ausgewählte mikrobielle Stamm gegen alle anderen getestet wird.
   3. Inkubieren Sie die Platten bei 24 bis 28 °C und überwachen Sie sie täglich, um potenzielle Halos zu beobachten, die auf eine antagonistische Aktivität hinweisen. Wenn Halos beobachtet werden, die auf eine antagonistische Aktivität zwischen zwei Stämmen hinweisen, sollte eine davon ausgeschlossen werden.
4. Führen Sie die Konsortialmontage durch.
   1. Aktivieren Sie die Isolate wie in Schritt 2.3.1 beschrieben.
   2. Pellet die Zellen bei 3.500 x g und waschen Sie sie vorsichtig 2x in einem gleichen Volumen der Saline-Lösung. Unterbrechen Sie die Zellen in einem gleichen Volumen (d. h., wenn das Endvolumen 2 ml Zellen betrug, waschen Sie sie mit 2 ml Salinelösung und setzen Sie sie in einem Endvolumen von 2 ml wieder aus).
   3. 1 ml Kultur in 100 ml 3% NaCl LB medium impfen und ON bei 150 x g inkubieren.
   4. Wiederholen Sie Schritt 4.5.2, impfen Sie die 100 ml gewachsenen, gewaschenen und resuspendierten Kulturen in 10 L Kulturen. Inkubieren Sie ON in sterilen Luftbrücken-Bioreaktoren und empfangen Gefilterte Luft von einer Pumpe. Wenn mehr Kultur benötigt wird, impfen Sie immer 1% der erwachsenen Kultur in frischen Medien.
   5. Zentrifugenkulturen bei 8.000 x g für 8 min bei 4 °C. Überstand nach Zentrifugation entsorgen.
   6. Waschen Sie das Pellet, sanft die Zellen in 500 ml steriler Köchellösung wieder aufhängen.
   7. Wiederholen Sie die Schritte 4.5.5 und 4.5.6.
   8. Setzen Sie jede einzelne Kultur in 100 ml Salinelösung aus und messen Sie die OD, um die Anzahl der Zellen zu schätzen.
   9. Berechnen Sie das Volumen jeder Kultur, die notwendig ist, um eine Endkonzentration von 10⁷ Zellen ml^-1zu erreichen.
   10. Perform CFU zählt auf Rich Media für eine endgültige Bestätigung der Zelllebensfähigkeit und Konzentration.
   11. Mischen Sie ein gleiches Volumen jeder einzelnen Kultur in sterilen Kolben und aliquot das Konsortium in 50 ml sterile Rohre.
   12. Bei 4 °C bis zur Impfung aufbewahren.
       HINWEIS: Bereiten Sie die Konsortialversammlung so frisch wie möglich vor, um zu gewährleisten, dass die Zellen weiterhin lebensfähig sind. Alternativ können CFU-Zählungen vor der Impfung durchgeführt werden. Um ein ideales Konsortium zusammenzustellen, ist es notwendig, Isolate zu verwenden, die unterschiedliche und komplementäre metabolische Kapazitäten darstellen. In der Regel werden 6-10 Isolate verwendet, um Konsortien zu bilden, aber diese Zahl variiert je nach den Eigenschaften und Zwecken der Mitglieder.

5. Nachweis vermeintlicher vorteilhafter Eigenschaften für Korallen

1. Aktivieren Sie die Isolate aus den Glyzerinvorräten, indem Sie sie auf LB-Agarplatten ausspionieren und bei 24 bis 28 °C eins inkubieren, um einzelne Kolonien wachsen zu lassen. Wählen Sie eine einzelne Kolonie aus den Platten und impfen Sie sie in 2 ml sterilem LB-Medium. Rohre mit LB-Medium unter konstanter Rührung (150 x g)bei 24 bis 28 °C einneigen.
2. Führen Sie die DNA-Extraktion gemäß Abschnitt 4.1 durch, um potenziell vorteilhafte Gene per PCR zu detektieren.
   HINWEIS: PCR-Reaktionsbedingungen und Primer hängen vom Zielgen ab. Methoden zur Prüfung der BMC-Eigenschaften einzelner Stämme und des PCR-Nachweises auf potenziell vorteilhafte Gene sind in Tabelle 1beschrieben.

Basierend auf den hier beschriebenen Methoden war es möglich, Mikroorganismen aus verschiedenen Wasserquellen und Korallen-Nubbins zu isolieren, die vermeintliche BMC-Eigenschaften aufweisen und in der Lage sind, verschiedene Klassen von Verunreinigungen zu abbauen (Abbildung 1). Mit Wasserproben, die in einer Kläranlage entnommen wurden, die vom CESA-UFRJ (Experimental Center of Environmental Sanitation der Federal University of Rio de Janeiro) gewonnen wurden, und basierend auf dem hier vorgestellten Verfahren 33 Bakterienstämme, die EE2 eine Endkonzentration von 5mg/L isoliert wurden (Abbildung 2A). Zusätzlich wurden mit der Technik zur Auswahl ölabbauender Bakterien 20 Stämme isoliert, die sowohl oWSF (Abbildung 2B) als auch oWIF (Abbildung 2C) abbauen konnten.

Die vermeintlichen BMC-Eigenschaften wurden in Mikroorganismen untersucht, die von verschiedenen Korallenarten unter verschiedenen Bedingungen isoliert wurden. Darunter ein Stamm, der eine starke antagonistische Aktivität gegen den Korallenpathogen Vibrio coralliilyticus (Abbildung 3A), Stämme, die Harnstoff abbauen können (Abbildung 3B), ein guter Katasaseproduzent ( Abbildung3 C) und Mikroorganismen, die potenziell vorteilhafte Gene darstellen (Abbildung 3D) wurden gefunden.

Unter Verwendung der beiden kombinierten Ansätze (z. B. Biosanierung und BMC-Impfung) war es möglich, Korallen vor Ölexpositionseinwirkungen zu schützen. Dazu wurde ein ölbioremediator pBMC-Konsortium, isoliert von der Koralle Mussismilia harttii, auf Korallennubbins geimpft, die 1% Öl in Triplicaten ausgesetzt waren21. Die dem Öl ausgesetzten Behandlungen zeigten ab dem vierten Tag einen progressiven Rückgang von Fv/Fm und erreichten bis zum zehnten Tag Werte nahe Null. Variable Fluoreszenz/maximale Fluoreszenz (Fv/Fm) lieferte ein Maß für die maximale photosystem II (PSII) photochemische Effizienz der Zooxanthellen, die eine indirekte Messung der Korallengesundheit darstellen. Auf der anderen Seite zeigten Korallennubbine, die in den mit dem Konsortium geimpften Aquarien vorhanden sind, eine besser erhaltene photochemische Fähigkeit (Abbildung 4).

Abbildung 1: Zusammenfassung der wichtigsten Schritte der Auswahl und Montage eines Bioremediator-pBMC-Konsortiums. Schema der schadstoffabbauenden Mikroorganismen-Auswahlschritte (in Grau) und letzte Schritte, die für die mikrobielle Auswahl des Konsortiums verwendet werden (DNA-Sequenzierung, Wachstumskurve, Antagonismustest und Konsortienmontage in Rot). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Auswahl schadstoffabbauender Bakterien. (A) Bakterielle Isolate, die auf minimalen Medienplatten wachsen, die EE2 als einzige Kohlenstoffquelle enthalten. (B) Bakterienkolonien, die auf minimalen Medienplatten wachsen, die oWSF als einzige Kohlenstoffquelle enthalten. (C) Bakterienkolonien, die auf minimalen Medienplatten wachsen, die oWIF als einzige Kohlenstoffquelle enthalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Erkennung von pBMC-Eigenschaften. (A) Flecken in Triplicaten von Stämmen, die antagonistische Aktivität gegen den Korallenpathogen Vibrio coralliilyticus (in schwarz) und einen Kontrollstamm (in grün) darstellen. (B) Stämme, die auf Medien wachsen, die Harnstoff als einzige Kohlenstoffquelle enthalten. (C) Dehnung serprozissende Kataalase (+) und eine schlechte Kataalase-Erzeuger-Sorte (-). (D) Beispiel für die PCR-Erkennung des NirK-Gens (Spur 1 = 1kb Leiter; Spur 2 = leere DNA-Extraktion negativ control; Lane 3 = NirK-Erkennung; Spur 4 = PCR-Reaktionen ohne Vorlagen-DNA). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Fv/Fm-Messungen von M. harttii nubbins dunkel angepasst um 17.00 Uhr, mit einem Tauch-PAM-Chlorophyll-Fluorometer. Fv/Fm-Messungen des Behandlungskontrollkonsortiums, Öl und Öl mit Konsortium wurden täglich 10 Tage lang in Triplicaten durchgeführt. Standardabweichung wird angezeigt. Die Features des Diagramms wurden mit Genehmigung der vorherigen Ergebnisse21geändert, die unter https://www.nature.com/articles/srep18268 unter einer Creative Commons Attribution 4.0 verfügbar sind. Vollständige Konditionen bei http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Nachweis von vermeintlichen BMC-Eigenschaften, Wirkmechanismus (MOA), gemeldeten Mikroorganismen, die das Potenzial und die Technik zum Nachweis des Merkmals darstellen.

Die Autoren haben nichts zu verraten.