Zelltypspezifische Gene Expression Profiling in der Mausleber

Zusammenfassung

Die Übersetzung der Ribosomenaffinitätsreinigung (TRAP) ermöglicht eine schnelle und effiziente Isolierung der zelltypspezifischen mRNA. Hier zeigen wir eine Methode, die hydrodynamische Schwanzveneninjektion in einem Mausmodell der Leberrepopulation und TRAP kombiniert, um das Expressionsprofil von wiederbevölkerten Hepatozyten zu untersuchen.

Zusammenfassung

Die Wiederbesiedlung der Leber nach verletzungen ist ein entscheidendes Merkmal von Säugetieren, das sofortiges Organversagen und den Tod nach Exposition von Umweltgiften verhindert. Ein tieferes Verständnis der Veränderungen in der Genexpression, die während der Repopulation auftreten, könnte helfen, therapeutische Ziele zu identifizieren, um die Wiederherstellung der Leberfunktion bei der Einstellung von Verletzungen zu fördern. Nichtsdestotrotz werden Methoden, um speziell die wiederbevölkerten Hepatozyten zu isolieren, durch einen Mangel an Zellmarkern, begrenzte Zellzahlen und die Fragilität dieser Zellen gehemmt. Die Entwicklung der Übersetzung der Ribosomenaffinitätsreinigung (TRAP) Technologie in Verbindung mit dem Fah^-/- Mausmodell, um die Repopulation bei der Einstellung von Leberverletzungen zu rekapitulieren, ermöglicht die Genexpression-Profilierung der Repopulation Hepatozyten. Mit TRAP wird zelltypspezifische sendemRNA schnell und effizient isoliert. Wir haben eine Methode entwickelt, die TRAP mit Affinitäts-basierter Isolierung der Übersetzung von mRNA aus Hepatozyten verwendet, die selektiv das grüne fluoreszierende Protein (GFP)-getaggtes ribosomales Protein (RP), GFP:RPL10A ausdrücken. TRAP umgeht den langen Zeitraum, der für die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung erforderlich ist, die das Genexpressionsprofil verändern könnte. Da nur die wiederbevölkerten Hepatozyten das GFP:RPL10A-Fusionsprotein ausdrücken, ist die isolierte mRNA frei von Verunreinigungen durch die umliegenden verletzten Hepatozyten und andere Zelltypen in der Leber. Die affinitätsgereinigte mRNA ist von hoher Qualität und ermöglicht eine nachgeschaltete PCR- oder High-Throughput-Sequenzierungs-basierte Analyse der Genexpression.

Einleitung

Als wichtigstes Stoffwechselorgan bei Wirbeltieren ist die Leber für Glukosehomöostase, Serumproteinsynthese, Gallensäuresekretion und xenobiotischen Stoffwechsel und Entgiftung verantwortlich. Die Leber besitzt eine außergewöhnliche Fähigkeit, das verletzte Parenchym bei Exposition gegenüber Toxinen zu regenerieren, um sofortiges Leberversagen zu verhindern¹. Jedoch, Versagen der Regeneration kann bei der Einstellung von Acetaminophen oder Alkohol Überkonsum auftreten, die zu akutem Leberversagen führen kann². Darüber hinaus können chronische Leberschäden durch virale Hepatitis-Infektion, Fettleber-Krankheit und Steatohepatitis Leberfibrose, Zirrhose und hepatozelluläres Karzinom³verursachen. Die einzige verfügbare heilende Behandlung für Lebererkrankungen im Endstadium ist die Transplantation, wird aber durch Organmangel begrenzt, wodurch eine effiziente Behandlung für alle Patienten verhindert wird⁴. Ein besseres Verständnis des Genesungsprozesses nach toxischen Leberverletzungen ist daher entscheidend für die Entwicklung von Behandlungen zur Stimulierung der Regeneration ausreichend, um die Funktion im erkrankten Organ zu retten.

Das am weitesten verbreitete Modellsystem zur Untersuchung der Leberregeneration ist die partielle Hepatektomie bei Nagetieren, bei der ein großer Teil der Leber reseciert wird, um die schnelle Hepatozytenexpansion zu stimulieren⁵. Jedoch, partielle Hepatectomie rekapituliert Hepatozyten-Expansion nach toxischen Leberverletzungen aufgrund des Mangels an Immunzellinfiltration und Hepatozytenzellnekrose oft bei der Einstellung von akuten Leberverletzungen beim Menschen beobachtet⁶. Ein geeigneteres System zur Modellierung dieser Form der Organerneuerung ist die ^Fah-/- Maus, der es an funktionellem Fumarylacetoacetathydrolase (FAH) fehlt, das für den richtigen Tyrosinstoffwechsel erforderlich ist und schwere Leberschäden entwickelt, die zum Tod führen⁷. Diese Mäuse können in einem gesunden Zustand auf unbestimmte Zeit durch die Behandlung mit dem Medikament Nitisinon im Trinkwasser gehalten werden. Alternativ kann der FAH-Ausdruck durch Transgenabgabe an eine Teilmenge von Hepatozyten wiederhergestellt werden, die sich ausdehnen wird, um die Leber bei Nitisinonentfernung wieder zu bevölkern⁸.

Um die Genexpressionsänderungen von wiederbevölkerten Hepatozyten zu profilieren, ist ein Werkzeug erforderlich, um replizierende Hepatozyten in der Fah^-/- Maus ohne Kontamination durch die benachbarten verletzten Hepatozyten und andere Zelltypen gezielt zu isolieren. Leider ist die fluoreszenbasierte Zellsortierung (FACS) von Hepatozyten schwierig, da (1) die Fragilität der wiederbevölkerten Hepatozyten zu einer schlechten Erholung nach Leberperfusion führt, (2) die Replizieren von Hepatozyten sind sehr variabel in der Größe, was die Isolation einer reinen Population durch FACS schwierig ist, und (3) die Verfahrenszeit von der Leberperfusion bis zur RNA-Isolierung größer als 2 h ist, daher können Genexpressionsprofile erheblichen künstlichen Veränderungen unterzogen werden, bevor Proben erworben werden⁹.

Alternativ ermöglicht die Expression von Epitop-markierten Ribosomen speziell bei der Wiederbesiedlung von Hepatozyten die schnelle Isolierung der aktiv übersetzenden mRNA, die durch Ribosomen gebunden ist, indem sie unmittelbar nach der Organernte mit Bulk-Leber Gewebelysate. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Translating-Ribosome-Affinitätsreinigung (TRAP)^10, gefolgt von RNA-Sequenzierung mit hohem Durchsatz (TRAP-seq), um mRNA gezielt zu isolieren und zu profilieren, um Hepatozyten im Fah^-/- Maus⁹. Die Coexpression von grünem fluoreszierendem proteingetaggtem ribosomalem Protein (GFP:RPL10A) mit FAH ermöglicht die Affinitätsreinigung der Übersetzung von mRNA gebunden durch Polysomen, die GFP:RPL10A enthalten. Diese Methode vermeidet alle Zelldissoziationsschritte, wie Leberperfusion, um zerbrechliche wiederbevölkerende Hepatozyten zu isolieren. Stattdessen nutzt es die Lyse des gesamten Organgewebes und Antikörper, um die RNA schnell gezielt aus den Zielzellen zu extrahieren. Schließlich ermöglicht die Isolierung reichlich vorhandener, hochwertiger mRNA über TRAP-seq nachgeschaltete Anwendungen wie sequenziumierende Analysen, um die dynamische Veränderung der Genexpression während des Repopulation-Prozesses zu profilieren.

Protokoll

Alle Methoden, die die Verwendung von Mäusen beinhalten, stehen im Einklang mit den Richtlinien des IACUC des Penn Office of Animal Welfare an der University of Pennsylvania.

1. Reagenz-Vorbereitung

1. Cycloheximid
   1. Um 500 l mit 0,1 g/ml Cycloheximid herzustellen, 50 mg Cycloheximid in 500 l Methanol auszusetzen.
      ACHTUNG: Cycloheximid ist extrem umweltschädlich und kann angeborene Fehlbildungen verursachen. Alle Abfälle und Puffer, die Cycloheximid enthalten, sollten zur ordnungsgemäßen Entsorgung gesammelt werden.
      HINWEIS: Cycloheximid kann bis zu 1 Tag bei 4 °C gelagert werden. Cycloheximid hemmt die Übersetzung.
2. Dithiothreitol (DTT)
   1. Um 1 ml 1 M DTT zu machen, 0,15 g DTT-Pulver in RNase-freiem Wasser aussetzen.
      ACHTUNG: DTT kann Reizungen der Haut, des Auges und der Atemwege verursachen.
      HINWEIS: DTT ist ein Reinigungsmittel. DTT kann bei -20 °C gelagert werden. Es wird empfohlen, 1 M DTT in Einweg-Aliquots von 50 l zu speichern.
3. Deoxycholat (DOC)
   1. Um 10% DOC zu machen, 1 g DOC in einem 50 ml konischen Rohr aussetzen und RNase-freies Wasser bis zu 10 ml hinzufügen. Kräftig schütteln, bis sich das Pulver aufgelöst hat.
      HINWEIS: Die 10% DOC-Lösung ist leicht gelb und kann bis zu 1 Jahr bei Raumtemperatur (RT) gelagert werden. DOC wird für die Kernlyse verwendet.
4. GFP-Antikörper
   1. Aliquot GFP Antikörper bei der ersten Verwendung. Fangen Sie die Aliquots eineinfrieren und bei -80 °C lagern.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, 50 g GFP-Antikörper in Einweg-Aliquoten zu speichern.
5. B biotinyliertes Protein L
   1. Resuspend biotinyliertes Protein L in 1x phosphatgepufferter Saline (PBS), um die Endkonzentration von 1 g/l zu erreichen.
      HINWEIS: Die resuspendierte Lösung kann bis zu 6 Monate bei -20 °C gelagert werden.

2. Puffervorbereitung

1. Bovine Serum albumin (BSA) Puffer
   1. Um 50 ml 3% BSA-Puffer zu machen, fügen Sie 1,5 g IgG- und proteasefreies BSA-Pulver in 40 ml PBS gefolgt von Wirbel hinzu. Nachdem die BSA aufgelöst wurde, fügen Sie PBS zu einem Endvolumen von 50 ml hinzu.
      HINWEIS: Der BSA-Puffer kann bis zu sechs Monate bei 4 °C gelagert werden.
2. Sezierpuffer
   1. Um 50 ml Sezierpufferbestand herzustellen, kombinieren Sie 5 ml 10x Hanks symmetrische Salzlösung (HBSS), 125 l von 1 M 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethanesulfonsäure (HEPES), 1.750 'L mit 1 m Glucose und 200 l von 1 M NaHCO₃. RNasefreies Wasser zu einem Endvolumen von 50 ml hinzufügen.
      HINWEIS: Der Sezierpufferstock kann bis zu sechs Monate bei 4 °C gelagert werden.
   2. Unmittelbar vor der Anwendung 100 g/ml von 0,1 g/ml Cycloheximid hinzufügen und auf Eis halten.
3. Hochsalzpuffer
   1. Um 50 ml Hochsalzpufferzulage zu machen, fügen Sie 1 ml 1 M HEPES, 8,75 ml 2 M KCl, 500 l von 1 M MgCl₂und 500 l mit 100 % Nichtylphenylpolyethylenglykol(Materialtabelle)zu RNase-freiem Wasser hinzu.
      HINWEIS: Der Salzpufferstock kann bis zu sechs Monate bei 4 °C gelagert werden.
   2. Unmittelbar vor der Verwendung 0,5 l/ml von 1 M DTT und 1 l/ml mit 0,1 g/ml Cycloheximid hinzufügen. Den frischen Hochsalzpuffer auf Eis halten.
4. Salzarmer Puffer
   1. Um 50 ml Salzpufferzulage zu machen, fügen Sie 1 ml 1 M HEPES, 3,75 ml 2 M KCl, 500 l von 1 M MgCl₂und 500 l mit 100 % Nichtylphenylpolyethylenglykol zu 44,25 ml RNase-freiem Wasser hinzu.
      HINWEIS: Der salzarme Pufferbestand kann bis zu sechs Monate bei 4 °C gelagert werden.
   2. Vor der Verwendung werden 0,5 l/ml von 1 M DTT und 1 l/ml 0,1 g/ml Cycloheximid hinzugefügt. Den frischen salzarmen Puffer auf Eis halten.
5. Gewebelysepuffer
   1. Um 50 ml Gewebelysepufferzulage zu bilden, kombinieren Sie 1 ml 1 M HEPES, 3,75 ml von 2 M KCl und 500 l von 1 M MgCl₂. RNasefreies Wasser zu einem Finale von 50 ml hinzufügen.
      HINWEIS: Der Sezierpufferstock kann bis zu sechs Monate bei 4 °C gelagert werden.
   2. Fügen Sie 1 Tablette/10 ml EDTA-freier Protease-Inhibitor, 1 l/ml mit 0,1 g/ml Cycloheximid, 10 l/ml RNase-Inhibitoren jeweils unmittelbar vor der Anwendung hinzu. Den frischgewebelysepuffer auf Eis halten.

3. Konjugation von Antikörpern gegen magnetische Perlen

1. Antikörper
   1. Berechnen Sie die Menge an GFP-Antikörpern, die für alle Proben erforderlich sind, und bereiten Sie sich auf eine zusätzliche Probe vor.
      HINWEIS: Für jede Probe werden 50 g jedes GFP-Antikörper benötigt.
   2. GFP-Antikörper auf Eis auftauen und mit maximaler Geschwindigkeit (>13.000 x g)10 min bei 4 °C drehen und Überstand in ein neues Mikrozentrifugenrohr übertragen.
      HINWEIS: Der Antikörpervorbereitungsschritt kann vor der Perlenvorbereitung durchgeführt und die aufgetauten Antikörper auf Eis gehalten werden. Alternativ kann dieser Teil während der Inkubation der magnetischen Perle und des biotinylierten Proteins L durchgeführt werden.
2. Magnetische Perlen resuspendieren
   1. Magnetische Perlen (Materialtabelle) durch sanftes Pipettieren wieder aufsetzen.
   2. Verwenden Sie für jede Probe 150 l magnetische Perle. Berechnen Sie das Volumen der magnetischen Perle, die für alle Proben benötigt wird, und bereiten Sie ein zusätzliches vor. Übertragen Sie die resuspendierten Magnetperlen in ein 1,5 ml oder 2 ml Mikrozentrifugenrohr. Wenn für ein Experiment mehr als 1 ml erforderlich ist, teilen Sie den Gesamtbetrag in gleiche Volumina auf.
   3. Sammeln Sie Perlen auf einem magnetischen Ständer für >1 min und entfernen Sie den Überstand. Entfernen Sie das Mikrozentrifugenrohr aus dem magnetischen Ständer und fügen Sie 1 ml PBS hinzu, gefolgt von Pipetten nach oben und unten, um die Perlen zu waschen. Sammeln Sie Perlen auf einem magnetischen Ständer für >1 min und entfernen PBS.
3. Herstellung von Protein-L-beschichteten Perlen
   1. Verwenden Sie für jede Probe 60 l biotinyliertes Protein L. Wenn Protein L zuvor resuspendiert und bei -20 °C gelagert wird, das Protein L auf Eis auftauen. Wenn Protein L vor der Verwendung resuspendiert wird, nehmen Sie die für alle Proben benötigte Menge und bereiten Sie eine zusätzliche vor.
   2. Fügen Sie das berechnete Volumen des biotinylierten Proteins L zu den resuspendierten und gewaschenen Magnetperlen hinzu. Fügen Sie 1x PBS hinzu, um das Endvolumen 1 ml zu machen, wenn Sie ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr oder 1,5 ml bei Verwendung eines 2 ml Mikrozentrifugenrohrs verwenden. Inkubieren Sie magnetisch Perlen mit biotinyliertem Protein L für 35 min bei RT auf einem Rohrrotator.
      HINWEIS: Antikörper können bei diesem Schritt hergestellt werden, während die Perlen mit biotinyliertem Protein L inkubieren.
   3. Sammeln Sie Protein L-beschichtete Perlen auf einem magnetischen Ständer für >1 min und entfernen Sie den Überstand. Entfernen Sie das Mikrozentrifugenrohr aus dem magnetischen Ständer und fügen Sie 1 ml 3% BSA-Puffer hinzu, gefolgt von einer sanften Pipettierung für mindestens 5 Mal, um das Protein L-beschichtete Perlen zu waschen.
   4. Sammeln Sie beschichtete Perlen auf einem magnetischen Ständer für >1 min und entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie die Waschschritte mit 3% BSA für weitere 4 Mal (insgesamt 5 Mal).
4. Antikörperbindung
   1. Fügen Sie die berechnete Menge an GFP-Antikörpern in die Protein-L-beschichteten Perlen ein und brüten Sie 1 h bei 4 °C auf einem Rohrrotator.
      HINWEIS: Achten Sie nach der Antikörperinkubation besonders darauf, die Affinitätsmatrix nicht zu überwirbeln.
   2. Bereiten Sie während der Inkubation einen Salzpuffer vor, indem Sie das für alle Proben erforderliche Gesamtvolumen berechnen, und fügen Sie vor der Verwendung 0,5 l/ml von 1 M DTT und 1 l/ml 0,1 g/ml Cycloheximid zu einem Salzpufferstock hinzu.
      ANMERKUNG: Es sind 3 ml Salzpuffer zum Waschen jedes Rohres mit GFP-konjugierten Perlen und 200 l/Probe zur Resuspension der GFP-konjugierten Perlen erforderlich. Frischer Salzpuffer kann für ein paar Stunden auf Eis gehalten werden.
   3. Sammeln Sie die Affinitätsmatrix auf einem magnetischen Ständer für >1 min und entfernen Sie den Überstand. Fügen Sie 1 ml Salzpuffer und sanft Pipette nach oben und unten, um die Affinitätsmatrix zu waschen. Sammeln Sie die Affinitätsmatrix auf einem magnetischen Ständer für >1 min und entfernen Sie den Salzpuffer. Wiederholen Sie die Waschschritte mit salzarmem Puffer noch einmal 2 Mal (insgesamt 3 Mal).
   4. Setzen Sie die Perlen im Salzpuffer wieder aus, so dass jede Probe eine Affinitätsmatrix von 200 l hat.
      HINWEIS: Die Affinitätsmatrix kann bis zu 2 Wochen in 0,02% NaN₃ bei 4 °C gelagert werden. Die Affinitätsmatrix sollte schnell im Salzpuffer 3-mal gewaschen und bei 4 °C mindestens 10 min sanft auf einem Rohrrotator resuspendiert werden, wenn die Affinitätsmatrix innerhalb von 1 Woche oder über Nacht hergestellt wird, wenn die Affinitätsmatrix über 1 Woche gelagert wird. Das Protokoll kann nach diesem Schritt angehalten werden.
      ACHTUNG: Natriumazid ist extrem umweltgiftig. Der Kontakt mit Säuren erzeugt giftiges Gas. Alle Abfälle sollten zur ordnungsgemäßen Entsorgung gesammelt werden.

4. Lebergewebe Lyse

1. Puffervorbereitung und Geräteaufbau
   1. Berechnen Sie die Anzahl der benötigten Mikrozentrifugenrohre, etikettieren und kühlen Sie auf Eis.
      HINWEIS: In der Regel werden für jede Probe sieben 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen benötigt: 1 für die verbleibende sezierte Leber, 4 für 4 ml homogenisiertes Leberlysat und 2 für die Übertragung von Überresten.
   2. Bereiten Sie einen frischen Sezierpuffer vor, indem Sie das für alle Proben erforderliche Gesamtvolumen berechnen und 1 L/ml mit 0,1 g/ml Cycloheximid hinzufügen. Legen Sie den frischen Sezierpuffer auf Eis, um während des Experiments kalt zu bleiben.
      HINWEIS: Für jede Probe sind 10 ml Sezierpuffer erforderlich.
   3. Bereiten Sie einen frischen Lysepuffer vor, indem Sie das für alle Proben erforderliche Gesamtvolumen berechnen und 1 Tablette/10 ml EDTA-freier Proteaseinhibitor, 1 l/ml 0,1 g/ml Cycloheximid und jeweils 10 l/ml RNase-Inhibitoren hinzufügen. Halten Sie den Lysepuffer während des gesamten Experiments auf Eis.
      HINWEIS: Für jede Probe sind 4 ml Lysepuffer erforderlich.
   4. Richten Sie die Gewebemühle (Materialtabelle) so ein, dass die Polytetrafluorethylen (PTFE)-Glasröhren während der Homogenisierung von Leberstücken auf Eis gelegt werden können. 4 ml Kaltlysepuffer in die PTFE-Glasrohre geben.
2. Wiederbevölkerung der Leberhomogenisierung
   1. Euthanisieren Sie eine 8-12 Wochen alte ^Fah-/- Maus, die mit dem TRAP-Vektor injiziert und für 1 bis 4 Wochen mit Anästhesie und Zervixdislokation gemäß den anerkannten Tierversuchsrichtlinien wieder aufgefüllt wurde.
   2. Legen Sie die Maus auf eine Sezierplatte und sprühen Sie den Bauch mit 70% Ethanol. Zeltdie haut und peritoneum tief im Bauch mit Zangen und verwenden Sie eine Schere, um einen Querschnitt zu machen. Weiter mit der Schere zu schneiden, um eine breite U-förmige Peritonealklappe zu machen, mit Sorgfalt, um nicht die Eingeweide zu schneiden. Drehen Sie die Peritonealklappe über das Brustbein, um die Leber freizulegen.
   3. Entfernen Sie vorsichtig die Leber mit feiner Schere und Zange und legen Sie das Gewebe schnell in kalten Dissektionspuffer zu spülen. Um gefrorenegewebe zu homogenisieren, bewegen Sie schnell die gewünschte Menge an Lebergewebe in PTFE-Glasröhren mit kalter Lysepuffer, ohne das Gewebe aufzutauen.
      HINWEIS: Das sezierte Gewebe kann blitzgefroren und bei -80 °C gelagert werden, nachdem es mit Einem Sezierpuffer gewaschen wurde. Das Protokoll kann nach diesem Schritt angehalten werden.
   4. Wiegen Sie die Leber auf einer Petrischale und isolieren Sie 200 x 500 mg Leberstücke und bewegen Sie sich in die PTFE-Glasröhren. Legen Sie das restliche Lebergewebe in ein vorgekühltes Mikrozentrifugenrohr und blitzen Sie ein.
   5. Homogenisieren Sie die Proben in einem motorgetriebenen Homogenisator ab 300 U/min, um Hepatozyten für mindestens 5 Striche von der Leberstruktur zu trennen. Senken Sie das Glasrohr jedes Mal, aber achten Sie darauf, dass der Stößel nicht über die Lösung steigen lässt, um eine Belüftung zu verhindern, die eine Proteindenaturierung verursachen könnte.
   6. Erhöhen Sie die Geschwindigkeit auf 900 U/min, um das Lebergewebe für mindestens 12 volle Schlaganfälle vollständig zu homogenisieren.
   7. Das Lysat in die beschrifteten und vorgekühlten Rohre mit nicht mehr als 1 ml Lysat pro 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen geben. Wenn 4 ml Lysepuffer verwendet wird, halten Sie 1 Röhre und Blitz einfrieren die restlichen 3 Röhren.
      HINWEIS: Die Lysate können bis zu 1 h auf Eis gehalten werden, während das nächste Tier seziert und frische Lysate zubereitet werden. Die homogenisierte Leber kann nach dem Lyseschritt eingefroren und bei -80 °C gelagert werden. Es könnte eine 50%ige Abnahme der isolierten RNA geben, wenn gefrorene Lysate verwendet werden. Das Protokoll kann nach diesem Schritt angehalten werden.
3. Kernlyse
   1. Zentrifugieren Sie das Leberlysat bei 2.000 x g bei 4 °C für 10 min und übertragen Sie den Überstand auf ein neues, vorgekühltes Mikrozentrifugenrohr auf Eis.
   2. Fügen Sie 1/9 des Überstandvolumens von 10% Nonylphenyl-Polyethylenglycol hinzu, um die Endkonzentration 1% Nonylphenyl-Polyethylenglycol zu machen und durch sanfte invertierte Mikrozentrifugenrohre zu mischen.
   3. Drehen Sie die Mikrozentrifugenrohre schnell herunter und fügen Sie 1/9 des Probenvolumens von 10% DOC hinzu, um die Endkonzentration 1% DOC zu machen und durch sanftes Invertieren der Mikrozentrifugenrohre zu mischen. Drehen Sie die Mikrozentrifugenrohre schnell herunter und brüten sie 5 min auf Eis.
   4. Zentrifugieren Sie das Kernlysat bei 20.000 x g bei 4 °C für 10 min und übertragen Sie den Überstand auf ein neues, vorgekühltes Mikrozentrifugenrohr auf Eis.
      HINWEIS: Der mitochondriende Überstand kann für ein paar Stunden auf Eis gelegt werden, während die restlichen Proben gesammelt werden.

5. Immunitizipation

1. Nehmen Sie für jede Röhre 1% des Gesamtvolumens des Überstandes als Präimmunitizipationskontrolle heraus, um die Zielanreicherung nach der Inkubation mit der Affinitätsmatrix zu vergleichen. Platzieren Sie die Vorimmunitierstitierstifizipationskontrollen über Nacht bei 4 °C, so wie die immunpräzipierten Proben verarbeitet werden.
2. Fügen Sie jeder Probe 200 L Affinitätsmatrix hinzu. Achten Sie besonders darauf, die Perlen durch sanftes Pipettieren wieder auszusetzen, bevor Sie jeder Probe die Affinitätsmatrix hinzufügen. Inkubieren Sie die Lysate mit Affinitätsmatrix bei 4 °C über Nacht mit sanftem Mischen auf einem Rohrrotator.
   HINWEIS: Das Protokoll kann nach diesem Schritt bis zu einem Tag angehalten werden.

6. RNA-Isolation

1. Puffervorbereitung und Geräteaufbau
   1. Legen Sie das Magnetgestell mindestens 30 min bei 4 °C, um es vorzukühlen und halten Sie das Rack während des gesamten Experiments auf Eis.
   2. Berechnen Sie die Anzahl der benötigten Mikrozentrifugenrohre und vorchillen Sie auf Eis oder bei 4 °C.
      HINWEIS: In der Regel benötigt jede Probe 1 Mikrozentrifugenröhrchen für die endgültige gereinigte RNA.
   3. Drehen Sie die Rohre aus Schritt 5.2 schnell herunter und sammeln Sie die Perlen, indem Sie sie mindestens 1 Min. auf das Magnetgestell legen. Sammeln oder entsorgen Sie den Überstand in zusätzlichen Mikrozentrifugenrohren.
      HINWEIS: Der gesammelte Überstand, der einen ungebundenen Bruch enthält, kann blitzgefroren und bei -80 °C gelagert werden, um mit dem gebundenen Bruch zur Transkriptionanreicherung nach der Reinigung zu vergleichen. Das Protokoll kann nach diesem Schritt angehalten werden.
   4. Bereiten Sie den Hochsalzpuffer vor, indem Sie dem Hochsalzpufferbestand 0,5 l/ml von 1 M DTT und 1 l/ml 0,1 g/ml Cycloheximid zueinem geben.
      HINWEIS: Für jede Probe sind 5 ml Hochsalzpuffer erforderlich.
2. RNA-Isolierung
   1. Fügen Sie 1 ml frischen Hochsalzpuffer in jedes Rohr, gefolgt von einer sanften Pipettierung für mindestens 5 Mal, ohne Blasen einzuführen.
      HINWEIS: Unzureichendes Waschen könnte Hintergründe ungebundener Transkripte einführen, während die Einführung von Blasen den ABBAU der RNA beschleunigen könnte.
   2. Sammeln Sie Perlen auf einem magnetischen Ständer für >1 min und entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie die Waschschritte mit hohem Salzpuffer noch einmal 4 Mal (insgesamt 5 Mal).
   3. Entfernen Sie den verbleibenden Hochsalzpuffer und entfernen Sie Mikrozentrifugenrohre aus dem magnetischen Ständer und legen Sie sie 5 min bei RT zum Aufwärmen.
   4. Setzen Sie die Perlen in 100 l Lysepuffer (im RNA-Isolationskit enthalten) mit Deminatriethanol aus.
      HINWEIS: Jedes RNA-Isolations- und Reinigungskit, das das Denaturierungsguanidinthioyanat enthält, kann als Lysepuffer verwendet werden, um gebundene RNA aus der Affinitätsmatrix freizusetzen. Die RNA-Extraktion sollte bei RT verarbeitet werden, da Guanidinthiocyanat bei niedrigen Temperaturen kristallisieren kann.
   5. Wirbeln Sie die Perlen und puffer für mindestens 5 s bei der höchsten Geschwindigkeit, schnell nach unten drehen, um den Puffer auf der Seite des Mikrozentrifugenrohrs zu sammeln und die Perlen mit dem Puffer bei RT für 10 min zu inkubieren, um die perlengebundene RNA in den Lysepuffer freizusetzen.
   6. Sammeln Sie Perlen auf einem magnetischen Ständer für >1 min und sammeln Sie den Überstand, um sofort zur RNA-Reinigung gemäß dem RNA-Reinigungsprotokoll gemäß dem im Kit (Tabelle der Materialien) angegebenen Rna-Reinigungsprotokoll zu gehen.
      HINWEIS: Der Überstand, der die eluierte RNA im Lysepuffer enthält, kann auch bis zu 1 Monat vor der Aufräumarbeiten bei -80 °C gespeichert werden, indem er sich beim Auftauen auf RT erwärmt.
   7. Um eine maximale Qualität der isolierten RNA zu erreichen, führen Sie alle optionalen Schritte einschließlich der DNase-Verdauung und aller RNA-Elutionsschritte durch. Erhitzen Sie den Elutionspuffer des RNA-Isolationskits oder RNase-freies Wassers auf 60 °C für maximale RNA-Rückgewinnung.
      HINWEIS: Die isolierte RNA kann bei -20 °C für bis zu 1 Monat oder -80 °C für mehrere Jahre gelagert werden. Das Protokoll kann nach diesem Schritt angehalten werden.

7. Optionale RNA-Qualitätsanalyse (empfohlen)

1. Bewerten Sie die RNA-Qualität mit einem Bioanalysator¹¹ und die Menge mit einem Spektralphotometer^12, um festzustellen, ob eine Wiederholung des Immunpräzipitationsprozesses erforderlich ist, um eine ausreichende und qualitativ hochwertige RNA zu erhalten.
   HINWEIS: Die optimale RNA-Qualität für die Sequenzierung mit hohem Durchsatz sollte den Protokollen folgen, die von Bibliotheksvorbereitungskits und Sequenzierungsplattformen festgelegt werden.

8. Nachgelagerte Anwendungen

HINWEIS: Die durch das TRAP-Protokoll isolierte Gesamt-RNA kann in einer Reihe von nachgeschalteten Standardanwendungen verwendet werden, einschließlich RNA-seq (TRAP-seq). Standard-Reverse-Transkription und quantitative PCR-Protokolle können auch nach TRAP verwendet werden.

1. Führen Sie für TRAP-seq die RNA-seq-Bibliotheksvorbereitung nach den Standardmethoden¹³durch.
2. Für RNA-seq bereiten Sie cDNA-Sequenzierungsbibliotheken mit kommerziellen RNA-Seq-Kits mit oligo d(T)-basierter Anreicherung polyadenylierter Poly(A)-Transkripte vor. Wenn die rna-Gesamtqualität niedriger ist als für die Poly(A)-Anreicherung empfohlen, verwenden Sie rRNA-Erschöpfungsmodule. Erwarten Sie jedoch, dass nach der Sequenzierung mehr rRNA-Ausrichtung angezeigt wird.

Ergebnisse

Um die Genexpression in wiederbevölkerten Hepatozyten der Fah^-/- Maus, Gfp:Rpl10a-Fusion und Fah-Transgenes zu profilieren, werden sie innerhalb eines transposonhaltigen Plasmids⁸ (TRAP-Vektor) hydrodynamische Injektion (Abbildung 1A). Die Entfernung von Nitisinon induziert eine giftige Leberverletzung, die einen Selektionsdruck für Hepatozyten schafft, die STABIL FAH ausdrücken, u...

Diskussion

TRAP-seq ist eine Technik zur zelltypspezifischen Isolierung der Übersetzung von mRNA über epitopgetaggte Ribosomen und stellt eine Alternative zu FACS-Ansätzen dar, da sie Beschränkungen wie den Zeitbedarf von FACS⁹umgeht. Stattdessen ermöglicht TRAP eine schnelle und effiziente Isolierung von RNA direkt aus Schüttgewebe n. Chr. und hilft, Veränderungen in der Genexpression zu vermeiden. TRAP-seq eignet sich besonders gut für den Einsatz in der wiederbevölkernden Fah^-/- Mausl...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10 mL Tissue Grinder, Potter-Elv, beschichtet	DWK Life Sciences (Wheaton)	358007
Absolutely RNA Miniprep Kit	Agilent	400800
Anti-GFP Antikörper	Memorial Sloan-Kettering Antikörper & Bioresource Core	GFP Ab #19C8 und GFP Ab #19F7
Rinderserumalbumin, IgG-frei, Proteasefrei	Jackson ImmunoResearch	001-000-162
cOmplete, Mini, EDTA-freier Proteasehemmer Cocktail	Roche	11836170001
Cycloheximid	Millipore Sigma	C7698
Desoxycholsäure, DOC	Millipore Sigma	D2510
D-Glucose, Dextrose	Fisher Scientific	D16
DL-Dithiothreitol	Millipore Sigma	D9779
Dynabeads MyOne Streptavidin T1	Thermo Fisher Scientific	65602
Fisherbrand Petrischalen mit klarem Deckel	Fisher Scientific	FB0875712
HBSS (10x), Calcium, Magnesium, kein Phenolrot	Thermo Fisher Scientific	14065-056
HEPES, 1 M Lösung, pH 7,3, Molekularbiologie, Reinst, Thermo Scientific	Thermo Fisher	Scientific AAJ16924AE
Magnesiumchlorid, MgCl2	Millipore Sigma	M8266
Methanol	Fisher Scientific	A452
NanoDrop 2000/2000c Spektralphotometer	Thermo Fisher Scientific	VV-83061-00
NEBNext Poly(A) mRNA magnetisches Isolationsmodul	New England BioLabs	E7490S
NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit für Illumina	New England BioLabs	E7530S
Nonylphenylpolyethylenglykol, NP-40. IGEPAL CA-630	Millipore Sigma	I8896
Nukleasefreies Wasser, nicht DEPC-behandelt	Ambion	AM9932
Freikopfrührer	DWK Life Sciences (Wheaton)	903475 PBS-Puffer
(10x), pH 7,4	Ambion	AM9625
Pierce Rekombinantes Protein L, biotinyliert	Thermo Fisher Scientific	29997
Kaliumchlorid, KCl	Millipore Sigma	P4504
RNA 6000 Pico Kit & Reagenzien	Agilent	5067-1513
RNaseZap RNase Dekontaminationslösung	Invitrogen	AM9780
RNasin Ribonuklease-Inhibitoren	Promega	N2515
Natriumazid, NaN3	Millipore Sigma	S2002
Natriumbicarbonat, NaHCO3	Millipore Sigma	S6297
SUPERase· In RNase Inhibitor	Invitrogen	AM2694