Methodenartikel

Zelltypspezifische Gene Expression Profiling in der Mausleber

DOI:

10.3791/60242

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17. September 2019

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1Department of Genetics, University of Pennsylvania, 2Department of Medicine, University of Pennsylvania

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Die Übersetzung der Ribosomenaffinitätsreinigung (TRAP) ermöglicht eine schnelle und effiziente Isolierung der zelltypspezifischen mRNA. Hier zeigen wir eine Methode, die hydrodynamische Schwanzveneninjektion in einem Mausmodell der Leberrepopulation und TRAP kombiniert, um das Expressionsprofil von wiederbevölkerten Hepatozyten zu untersuchen.

Zusammenfassung

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Die Wiederbesiedlung der Leber nach verletzungen ist ein entscheidendes Merkmal von Säugetieren, das sofortiges Organversagen und den Tod nach Exposition von Umweltgiften verhindert. Ein tieferes Verständnis der Veränderungen in der Genexpression, die während der Repopulation auftreten, könnte helfen, therapeutische Ziele zu identifizieren, um die Wiederherstellung der Leberfunktion bei der Einstellung von Verletzungen zu fördern. Nichtsdestotrotz werden Methoden, um speziell die wiederbevölkerten Hepatozyten zu isolieren, durch einen Mangel an Zellmarkern, begrenzte Zellzahlen und die Fragilität dieser Zellen gehemmt. Die Entwicklung der Übersetzung der Ribosomenaffinitätsreinigung (TRAP) Technologie in Verbindung mit dem Fah-/- Mausmodell, um die Repopulation bei der Einstellung von Leberverletzungen zu rekapitulieren, ermöglicht die Genexpression-Profilierung der Repopulation Hepatozyten. Mit TRAP wird zelltypspezifische sendemRNA schnell und effizient isoliert. Wir haben eine Methode entwickelt, die TRAP mit Affinitäts-basierter Isolierung der Übersetzung von mRNA aus Hepatozyten verwendet, die selektiv das grüne fluoreszierende Protein (GFP)-getaggtes ribosomales Protein (RP), GFP:RPL10A ausdrücken. TRAP umgeht den langen Zeitraum, der für die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung erforderlich ist, die das Genexpressionsprofil verändern könnte. Da nur die wiederbevölkerten Hepatozyten das GFP:RPL10A-Fusionsprotein ausdrücken, ist die isolierte mRNA frei von Verunreinigungen durch die umliegenden verletzten Hepatozyten und andere Zelltypen in der Leber. Die affinitätsgereinigte mRNA ist von hoher Qualität und ermöglicht eine nachgeschaltete PCR- oder High-Throughput-Sequenzierungs-basierte Analyse der Genexpression.

Einleitung

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Als wichtigstes Stoffwechselorgan bei Wirbeltieren ist die Leber für Glukosehomöostase, Serumproteinsynthese, Gallensäuresekretion und xenobiotischen Stoffwechsel und Entgiftung verantwortlich. Die Leber besitzt eine außergewöhnliche Fähigkeit, das verletzte Parenchym bei Exposition gegenüber Toxinen zu regenerieren, um sofortiges Leberversagen zu verhindern1. Jedoch, Versagen der Regeneration kann bei der Einstellung von Acetaminophen oder Alkohol Überkonsum auftreten, die zu akutem Leberversagen führen kann2. Darüber hinaus können chronische Leberschäden durch virale Hepatitis-Infektion, Fettleber-Krankheit und Steatoh....

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Protokoll

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Alle Methoden, die die Verwendung von Mäusen beinhalten, stehen im Einklang mit den Richtlinien des IACUC des Penn Office of Animal Welfare an der University of Pennsylvania.

1. Reagenz-Vorbereitung

  1. Cycloheximid
    1. Um 500 l mit 0,1 g/ml Cycloheximid herzustellen, 50 mg Cycloheximid in 500 l Methanol auszusetzen.
      ACHTUNG: Cycloheximid ist extrem umweltschädlich und kann angeborene Fehlbildungen verursachen. Alle Abfälle und Puffer, die Cycloheximid enthalten, sollten zur ordnungsgemäßen Entsorgung gesammelt werden.
      HINWEIS: Cycloheximid kann bis zu 1 Tag bei 4 °C gela....

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Ergebnisse

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Um die Genexpression in wiederbevölkerten Hepatozyten der Fah-/- Maus, Gfp:Rpl10a-Fusion und Fah-Transgenes zu profilieren, werden sie innerhalb eines transposonhaltigen Plasmids8 (TRAP-Vektor) hydrodynamische Injektion (Abbildung 1A). Die Entfernung von Nitisinon induziert eine giftige Leberverletzung, die einen Selektionsdruck für Hepatozyten schafft, die STABIL FAH ausdrücken, u.......

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Diskussion

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TRAP-seq ist eine Technik zur zelltypspezifischen Isolierung der Übersetzung von mRNA über epitopgetaggte Ribosomen und stellt eine Alternative zu FACS-Ansätzen dar, da sie Beschränkungen wie den Zeitbedarf von FACS9umgeht. Stattdessen ermöglicht TRAP eine schnelle und effiziente Isolierung von RNA direkt aus Schüttgewebe n. Chr. und hilft, Veränderungen in der Genexpression zu vermeiden. TRAP-seq eignet sich besonders gut für den Einsatz in der wiederbevölkernden Fah-/- Mausl.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde durch folgende Stipendien unterstützt: F31-DK113666 (AWW), K01-DK102868 (AMZ), K08-DK106478 (KJW) und P30-DK050306 (Pilotzuschuss an KJW).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
10 mL Tissue Grinder, Potter-Elv, beschichtetDWK Life Sciences (Wheaton)358007
Absolutely RNA Miniprep KitAgilent400800
Anti-GFP AntikörperMemorial Sloan-Kettering Antikörper & Bioresource CoreGFP Ab #19C8 und GFP Ab #19F7
Rinderserumalbumin, IgG-frei, ProteasefreiJackson ImmunoResearch001-000-162
cOmplete, Mini, EDTA-freier Proteasehemmer CocktailRoche11836170001
CycloheximidMillipore SigmaC7698
Desoxycholsäure, DOCMillipore SigmaD2510
D-Glucose, DextroseFisher ScientificD16
DL-DithiothreitolMillipore SigmaD9779
Dynabeads MyOne Streptavidin T1Thermo Fisher Scientific65602
Fisherbrand Petrischalen mit klarem DeckelFisher ScientificFB0875712
HBSS (10x), Calcium, Magnesium, kein PhenolrotThermo Fisher Scientific14065-056
HEPES, 1 M Lösung, pH 7,3, Molekularbiologie, Reinst, Thermo ScientificThermo FisherScientific AAJ16924AE
Magnesiumchlorid, MgCl2 Millipore SigmaM8266
MethanolFisher ScientificA452
NanoDrop 2000/2000c SpektralphotometerThermo Fisher ScientificVV-83061-00
NEBNext Poly(A) mRNA magnetisches IsolationsmodulNew England BioLabsE7490S
NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit für IlluminaNew England BioLabsE7530S
Nonylphenylpolyethylenglykol, NP-40. IGEPAL CA-630Millipore SigmaI8896
Nukleasefreies Wasser, nicht DEPC-behandeltAmbionAM9932
FreikopfrührerDWK Life Sciences (Wheaton)903475 PBS-Puffer
(10x), pH 7,4AmbionAM9625
Pierce Rekombinantes Protein L, biotinyliertThermo Fisher Scientific29997
Kaliumchlorid, KClMillipore SigmaP4504
RNA 6000 Pico Kit & ReagenzienAgilent5067-1513
RNaseZap RNase DekontaminationslösungInvitrogenAM9780
RNasin Ribonuklease-InhibitorenPromegaN2515
Natriumazid, NaN3Millipore SigmaS2002
Natriumbicarbonat, NaHCO3Millipore SigmaS6297
SUPERase· In RNase InhibitorInvitrogenAM2694

Referenzen

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  1. Taub, R. Liver regeneration: from myth to mechanism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).
  2. Lee, W. M. Etiologies of acute liver failure. Seminars in Liver Disease. 28 (2), 142-152 (2008).
  3. Sanyal, A. J., Yoon, S. K., Lencioni, R.

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Schlagwörter

Translating Ribosome Affinity PurificationTRAP seqGene Expression ProfilingHepatocyte IsolationLiver RepopulationGFP L10A Fusion ProteinMagnetic Bead IsolationNuclear Lysate PreparationRNA Cleanup ProtocolHigh throughput Sequencing

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