Hier stellen wir ein Protokoll zur Beurteilung der Dynamik der Spindelbildung und der mitotischen Progression vor. Unsere Anwendung der Zeitraffer-Bildgebung ermöglicht es dem Anwender, Zellen in verschiedenen Stadien der Mitose zu identifizieren, mitotische Defekte zu verfolgen und zu identifizieren und die Spindeldynamik und das mitotische Zellschicksal bei Exposition gegenüber Anti-Mitotik-Medikamenten zu analysieren.
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Methodenartikel
Live Cell Imaging zur Bewertung der Dynamik von Metaphasen-Timing und Zellschicksal nach mitotischen Spindelstörungen
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Live-Zell-Zeitraffer-Bildgebung ist ein wichtiges Werkzeug in der Zellbiologie, das Einblicke in zelluläre Prozesse bietet, die andernfalls von der Fixed-Cell-Analyse übersehen, missverstanden oder falsch interpretiert werden könnten. Während die fixe Zellbildgebung und -analyse robust und ausreichend ist, um den zellulären Stationären Zustand zu beobachten, kann sie bei der Definition einer zeitlichen Reihenfolge der Ereignisse auf zellulärer Ebene eingeschränkt sein und ist schlecht gerüstet, um die transiente Natur dynamischer Prozesse einschließlich mitotische Progression. Im Gegensatz dazu ist die Live-Zell-Bildgebung ein eloquentes Werkzeug, das verwendet werden kann, um zelluläre Prozesse auf einzelzelliger Ebene im Laufe der Zeit zu beobachten, und hat die Fähigkeit, die Dynamik von Prozessen zu erfassen, die sonst in der Bildgebung fester Zellen schlecht dargestellt wären. Hier beschreiben wir einen Ansatz zur Erzeugung von Zellen, die fluoreszierend markierte Marker von Chromatin und Mikrotubuli tragen, und deren Verwendung in Live-Zell-Bildgebungsansätzen zur Überwachung der Metaphasenchromosomausrichtung und des mitotischen Austritts. Wir beschreiben bildgebende Techniken zur Beurteilung der Dynamik der Spindelbildung und der mitotischen Progression, einschließlich der Identifizierung von Zellen in verschiedenen Stadien der Mitose, der Identifizierung und Verfolgung von mitotischen Defekten und der Analyse der Spindeldynamik und mitotischezellliche semittizische Zellschicksale nach der Behandlung mit mitotischen Inhibitoren.
Einleitung
Die bildbasierte Analyse fester Zellen wird häufig verwendet, um die Veränderungen der Zellpopulationsebene als Reaktion auf verschiedene Störungen zu bewerten. In Kombination mit der Zellsynchronisierung, gefolgt von der Erfassung und Abbildung von seriellen Zeitpunkten, können solche Ansätze verwendet werden, um eine zelluläre Abfolge von Ereignissen vorzuschlagen. Dennoch ist die Bildgebung fester Zellen insofern begrenzt, als zeitliche Beziehungen für eine Population impliziert und nicht auf der Ebene einzelner Zellen nachgewiesen werden. Auf diese Weise reicht die Bildgebung und Analyse fester Zellen zwar aus, um robuste Phänotypen und stationäre Veränderungen zu beobachten, aber die Fähigkeit, vorübergehende Veränderungen im Laufe der Zeit zu erkennen und Veränderungen, die sich nur auf eine Teilpopulation der Zellen auswirken, ist unvollkommen. Im Gegensatz dazu ist die Live-Zell-Bildgebung ein eloquentes Werkzeug, das verwendet werden kann, um zelluläre und subzelluläre Prozesse innerhalb einer einzelnen Zelle oder Zellpopulation im Laufe der Zeit und ohne die Hilfe von Synchronisationsansätzen zu beobachten, die sich selbst auf das zelluläre Verhalten auswirken können. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6.
Die Bildung einer bipolaren mitotischen Spindel ist für die richtige Chromosomensegregation während der Zellteilung unerlässlich, was zu zwei genetisch identischen Tochterzellen führt. Defekte in der mitotischen Spindelstruktur, die die mitotische Progression korrumpieren und die Genauigkeit der Chromosomensegregation beeinträchtigen, können zu katastrophalen Zellteilungen und einer verminderten Zelllebensfähigkeit führen. Aus diesem Grund sind mitotische Gifte, die die Spindelbildung verändern, vielversprechende Therapeutika, um die schnelle Proliferation von Krebszellen7,8,9zu begrenzen. Dennoch ist die feste Zellanalyse der Spindelstruktur nach Zugabe von mitotischen Giften in ihrer Fähigkeit, den dynamischen Prozess der Spindelbildung zu beurteilen, begrenzt und kann nicht darauf hinweisen, ob beobachtete Veränderungen der Spindelstruktur dauerhaft sind oder stattdessen vorübergehend und kann überwunden werden, um eine erfolgreiche Zellteilung zu ermöglichen.
In diesem Protokoll beschreiben wir einen Ansatz zur Bewertung der Dynamik der Mitose nach Spindelstörungen durch Live-Zell-Bildgebung. Mit der hTERT verewigten RPE-1-Zelllinie, die entwickelt wurde, um ein Mit dem RFP-markiertes Histone 2B auszudrücken, um Chromatin zusammen mit einem EGFP-getaggten -Tubulin zu visualisieren, um Mikrotubuli, das Timing der Metaphasenchromosomausrichtung, den Anaphasenbeginn und letztlich Das mitotische Zellschicksal wird anhand visueller Hinweise auf Chromosomenbewegung, Verdichtung und kerntechnische Morphologie beurteilt.
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Protokoll
1. Erzeugung von hTERT-RPE-1-Zellen, die rFP-Histone 2B (RFP-H2B) und s-tubulin-EGFP (tub-EGFP) stabil exemiten
HINWEIS: Alle Schritte folgen aseptischen Techniken und finden in einem Sicherheitsschrank der Biosicherheitsstufe II+ (BSL2+) statt.
- Generieren Sie Retrovirus, das die Gene von Interesse (-Tubulin-EGFP und RFP-H2B) durch die Transfektion von 293T-Zellen mit den entsprechenden lentiviralen Plasmiden gemäß den Anweisungen des Herstellers des lipidbasierten Transfektionsabgabesystems trägt.
- Tag 1: Verwenden Sie eine Einwegglas Pasteur Pipette, um das Zellkulturmedium von einer Platte von sub-konfluenten 293T-Zellen zu aspirieren und das Restmedium mit Phosphat gepufferter Kochsaline (PBS) abzuwaschen, indem Sie 5 ml PBS hinzufügen. Wirbeln, um PBS über den Plattenboden zu verteilen, dann aspirieren Sie die PBS mit einer sterilen Einweg-Glas Pasteur Pipette.
- Fügen Sie 2 ml 0,05% Trypsin, das auf 37 °C vorgewärmt wurde, und geben Sie die Platte in einen befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5%CO2 für 2 bis 5 min zurück, damit anhantibe Zellen von der Zellkulturschale freigesetzt werden können.
- Fügen Sie 8 ml frisches Dulbecco es Modified Eagle Medium (DMEM) hinzu, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin/Streptomycin auf die Platte, die Trypsin enthält.
- Setzen Sie die Zellen durch sanftes Pipetieren wieder auf und übertragen Sie die Suspension in ein steriles 15 ml konisches Rohr. Das konische Rohr in eine ausgewogene Zentrifuge geben und bei 161 x g 5 min bei Raumtemperatur drehen, um die Zellen sanft zu pelleten.
- Aspirieren Sie die Mittlere/Trypsin-Lösung aus Pelletzellen und suspendieren Sie Zellen in 10 ml DMEM, ergänzt mit 10% FBS und 1% Penicillin/Streptomycin. Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die 293T Zellaufhängung und Platte 2 x 106 293T Zellen pro Brunnen einer 6-Well-Platte zu zählen.
- Kulturzellen in einem Gesamtvolumen von 2 ml von Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin/Streptomycin und halten in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5%CO2.
- Tag 2: Pipette 7 l lipidbasiertes Transfektions-Abgabe-Reagenz und 100 l reduziertes Serummedium in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr und lassen es bei Raumtemperatur für 5 min inkubieren (Rohr #1).
- In einem separaten 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr wird die Pipette 1 g RFP-H2B-Expressionsvektor (oder 1 g Tubulin-EGFP-Expressionsvektor) zusammen mit 5 l Enhancer-Reagenz (wie nach Herstellerrichtlinien erforderlich), 0,5 g pMD2.G und 1 Serummedium (Rohr #2).
- Kombinieren Sie den Inhalt von Schritt 1.1.7 und Schritt 1.1.8, indem Sie das Rohr sorgfältig #2 in die #1 in die Röhre leiten und 20 min bei Raumtemperatur inkubieren.
HINWEIS: Die Reaktion kann bei Bedarf für die Transfektion von Zellen in zusätzlichen Brunnen skaliert werden. - Pipette die Transfektionsreaktion tropfenweise auf den gewünschten Brunnen mit 293T Zellen in 2 ml Medium und geben Sie die Schale bei 37 °C mit 5%CO2an den befeuchteten Inkubator zurück.
ANMERKUNG: Um Zellen zu erzeugen, die sowohl RFP-H2B als auch S-Tubulin-EGFP exezieren, generieren Sie für jedes Expressionskonstrukt separate Viren (Schritte 1.1.7- 1.1.9). - Tag 3: Aspirieren und ersetzen Sie das Medium durch 2 ml frisches DMEM, ergänzt durch 10% FBS und 1% Penicillin/Streptomycin. Bringen Sie die Schale bei 37 °C mit 5%CO2in den befeuchteten Inkubator zurück.
- Tag 4: Sammeln Sie das Medium, das exprimierte Viruspartikel enthält, und sind Sie vorsichtig, 293T-Zellen nicht zu stören oder zu entfernen. Filtern Sie das Medium, das Viruspartikel enthält, indem Sie es durch einen 0,45 -M-Filter durcheine 5 ml Spritze durchqueren. Aliquot-Virus zur kurzfristigen Lagerung bei 4 °C oder Langzeitlagerung bei -80 °C.
HINWEIS: Virale Partikel, die auf diese Weise gewonnen werden, werden in einem Bereich von 1 x 107 bis 1 x 108 Transducing Units/ml vorhanden sein. Da die viral produzierenden Zellen und Zellen, die infiziert werden sollen, beide im selben Medium kultiviert werden, ist eine Viruskonzentration, um das Medium zu ersetzen, nicht erforderlich und gefilterte Viruspartikel können direkt zur Infektion von Zellen verwendet werden. - Samen 2 x 105 hTERT-RPE-1 Zellen pro Brunnen einer 6-Well-Schale zur Vorbereitung auf die Virusinfektion. Kulturzellen in 2 ml DMEM ergänzt mit 10% FBS und 1% Penicillin/Streptomycin und halten in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5%CO2.
- Tag 5: Hexadimethrinbromid (z.B. Polybren) zu den hTERT-RPE-1-Zellen zu einer Endkonzentration von 8 g/ml hinzufügen. Infizieren Sie Zellen mit einer Mischung von 500 l Virus verdünnt in 500 l Zellkulturmedium.
HINWEIS: Die Hexadimethrinbromid-Stammlösung wird in sterilem destilliertem Wasser hergestellt und dann durch einen 0,45 m-Filter gefiltert. - Tag 6: Mit einer Einwegglas Pasteur Pipette, aspirieren Sie das Medium aus Brunnen, die die Virus infizierten Zellen. Ersetzen Sie das Zellkulturmedium durch 2 ml DMEM mit 10% FBS, 1% Penicillin/Streptomycin und entsprechenden Konzentrationen von Antibiotika, die für die Plasmidintegration und -expression ausgewählt werden müssen.
ANMERKUNG: Das in den beschriebenen Experimenten verwendete Expressionsplasmid von A-Tubulin-EGFP trägt ein Puromycin-Resistenz-Gen und das RFP-H2B-Expressionsplasmid ein Blasticidin-Resistenzgen. Daher werden 10 g/ml Puromycin und 2 g/ml Blasticidin für die Auswahl von B-Tubulin-EGFP- , RFP-H2B-Exzessiv hTERT RPE-1-Zellen verwendet. Die Konzentrationen von Antibiotika, die für die Auswahl verwendet werden, können für verschiedene Zelllinien unterschiedlich sein. - Halten Sie Zellen unter Antibiotika-Auswahl für 5-7 Tage, ersetzen Sie das Medium alle 3 Tage mit frischem Medium mit geeigneten Selektionreagenzien.
HINWEIS: Zellen sollten während der Auswahl bei der Subkonfluzon erhalten und bei Bedarf erweitert werden, wie in den Schritten 1.1.1 bis 1.1.4 beschrieben. - Verwenden Sie Immunfluoreszenz-Bildgebung, um die Expression von markierten Konstrukten zu bestätigen.
HINWEIS: Wenn gewünscht, können Einzelzellklone abgeleitet werden, um gleichmäßige Expressionsebenen innerhalb der Zellpopulation zu erhalten. Sobald stabile Klone bestätigt sind, können Zellen ohne Antibiotikaauswahl unter den Standardkulturbedingungen gehalten werden.
2. Vorbereitung von Zellen für die Live-Zell-Bildgebung nach mitotischen Spindelstörungen
HINWEIS: Verwenden Sie aseptische Techniken und führen Sie die Schritte in einem BSL2-Sicherheitsschrank aus.
- Mit einer sterilen Einwegglas Pasteur Pipette, aspirieren Sie das Medium aus der Kulturplatte, die die Zelllinie enthält, die den Ausdruck Konstrukt(e) trägt (ab Schritt 1.7). Waschen Sie die Zellen kurz mit 10 ml sterilem PBS. Wirbeln, um PBS über den Plattenboden zu verteilen, dann aspirieren PBS mit einem sterilen Einweg-Glas Pasteur Pipette.
- 2 ml 0,05% Trypsin auf die 10 cm Platte geben. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 2-5 min oder bis sich die Zellen von der Plattenoberfläche gelöst haben.
- Fügen Sie 8 ml frisches Medium auf die Platte mit Trypsin. Setzen Sie die Zellen durch sanftes Pipetieren wieder auf und übertragen Sie die Suspension in ein steriles 15 ml konisches Rohr. Das konische Rohr in eine ausgewogene Zentrifuge geben und bei 161 x g 5 min bei Raumtemperatur drehen, um die Zellen sanft zu pelleten.
- Den Überstand vorsichtig ansaugen und in 10 ml PBS wieder aufhängen, indem man sanft mit einer 10 ml serologischen Pipette pipetiert. Das konische Rohr in eine ausgewogene Zentrifuge geben und bei 161 x g 5 min bei Raumtemperatur drehen, um die Zellen sanft zu pelleten.
- Den Überstand vorsichtig ansaugen und in 10 ml des frischen Mediums wieder auftragen, indem man sanft mit einer 10 ml serologischen Pipette pipetiert.
- Zählen Sie Zellen, berechnen Sie dann die Zellzahl mit einem Hemacytometer und verdünnen Sie auf eine Konzentration von 1-2 x 105 Zellen/ml im Zellkulturmedium. Samen 500 l der Zellsuspension zu jedem Brunnen einer sterilen 12-Well-Bild-Bodenplatte. Legen Sie die Platte in den Zellkultur-Inkubator und lassen Sie die Zellen an der Plattenoberfläche haften.
HINWEIS: Für die Live-Zell-Bildgebung müssen Zellen gut haften, damit sie während der Bildaufnahme mit der Bildebene verknüpft bleiben. Die Dauer der Zeit, die Zellen benötigen, um nach der Beschichtung zu haften, kann von einer Zelllinie zur nächsten variieren und sollte für die zu untersuchende Zelllinie optimiert werden. - Bis zu 30 min vor Beginn der Zeitraffer-Bildgebung, fügen Sie eine relevante Konzentration eines mitotischen Medikaments zu einem oder mehreren der Mittätsbrunnen mit Zellen. Um die möglichen Auswirkungen des organischen Lösungsmittels auf das zelluläre Verhalten zu berücksichtigen, fügen Sie den Zellen als Kontrollen ein gleiches Volumen des Verdünnungsmittels des Inhibitors hinzu. Stellen Sie beispielsweise sicher, dass die Zugabe von 100 nM des spezifischen Inhibitors der mitotischen Kinase Aurora A (z. B. Alisertib) mit einem gleichen Volumen von DMSO, dem Verdünnungsmittel für dieses Medikament, in einem Kontrollbrunnen von Zellen einhergeht.
ANMERKUNG: Die vergleichende Analyse dynamischer Veränderungen der mitotischen Progression erfordert, dass Inlagen von Zellen ohne Störungen vorbereitet werden, um die Bildgebung normaler Milben gleichzeitig mit experimentellen Bedingungen zu ermöglichen.
3. Mikroskop für die Zeitraffer-Bildgebung von RFP-H2B, b-Tubulin-GFP-exemitten Zellen eingerichtet (Abbildung 1, Abbildung 2)
- Platzieren Sie die Zellkulturplatte, die RFP-H2B, a-tubulin-GFP-exzessizierende hTERT-RPE-1-Zellen enthält, die in einem geeigneten Bühneneinsatz auf einem invertierten Epifluoreszenzmikroskop abgebildet werden sollen, das mit einer hochauflösenden Kamera (Pixelgröße 0,67 x 20x) Umweltkammer auf 37 °C vorgewärmt, und ein Abgabesystem für befeuchtete 5%CO2.
HINWEIS: Entweder geschlossene Umweltkammern oder temperaturgeregelte Stufeneinsätze können geeignet sein, sofern befeuchtete 5%CO2 geliefert und eine stabile Temperaturregelung erreicht werden kann. - Verwenden Sie ein 20-faches Luftobjektiv mit einer numerischen Blende von 0,5 und sind für die kontrastreiche Fluoreszenz und Phasenkontraste oder Hellfeld-Bildgebung ausgerüstet. Sehen Sie sich Zellen mit dem Phasenkontrast oder Hellfeld an und passen Sie den Verlauf an und fokussieren Sie sich auf das Mikroskop, um Zellen in den Fokus zu rücken.
- Identifizieren und legen Sie die optimalen Belichtungszeiten für die Bildaufnahme von Hellfeld, GFP und RFP fest, indem Sie den jeweiligen Filterwürfel mit entsprechender Anregung und Emission für die abgebildeten Fluorophore auswählen. Alternativ können Sie auf die Schaltfläche "Automatische Belichtung" klicken, um eine vorgegebene Belichtungszeit einzugeben. Wenn das Signal nicht intensiv genug ist, wählen Sie Pixel-Binning aus, um kürzere Belichtungszeiten zu ermöglichen, indem Sie auf die Registerkarte Binning klicken und 2 x 2 Pixel binning aus dem Dropdown-Menü auswählen.
HINWEIS: Phototoxizität kann die mitotische Progression und zellelige Lebensfähigkeit beeinträchtigen. Das Versagen von mitotischen Zellen in Kontrollpopulationen, normale Mitosen zu vervollständigen, kann ein Hinweis darauf sein, dass Die Expositionszeiten und/oder die Bildgebungsdauer weiter optimiert werden muss. - Verwenden Sie eine Erfassungs- und Analysesoftware, mit der gleichzeitig Multi-Koordinaten- und Multi-Well-Bildgebung erfasst und die Parameter für die Bildaufnahme definiert werden können.
- Wählen und kalibrieren Sie die Mikroskopstufe gemäß den Anweisungen des Herstellers auf die Multi-Well-Schale. Verwenden Sie die Bildaufnahme-Software, um die Brunnen hervorzuheben oder anderweitig auszuwählen, die abgebildet werden, indem Sie auf die entsprechenden Brunnen im Diagramm des verwendeten Plattenformats klicken.
- Definieren Sie im Bedienfeld "GeneratedPoints" (Abbildung 2) die Koordinaten innerhalb jeder Bohrung, die abgebildet werden soll, indem Sie auf die Registerkarte Punktplatzierung klicken und eine vordefinierte oder zufällige Koordinatenplatzierung aus das Dropdown-Menü. Wählen Sie die Registerkarte Arbeitsbereich aus, und wählen Sie im Dropdown-Menü eingeschränkt aus, um den Koordinatenauswahlbereich einzuschränken, um die Grenzen des Brunnens auszuschließen. Klicken Sie auf die Registerkarten Anzahl und Verteilung, um die Anzahl und Verteilung der Punkte auszuwählen, die pro Brunnen erfasst werden sollen.
HINWEIS: Die Anzahl der Koordinaten, die pro Bohrwert innerhalb des Zeitpunktinschritts von 5 minuten abgebildet werden können, wird durch die Anzahl der zu bebildernden Bohrungen sowie die Belichtungszeit für jeden Kanal begrenzt. In der Regel sind 5-8 Koordinaten pro Brunnen ausreichend, um mindestens 50 Zellen in jedem Zustandsfortschritt durch Mitose innerhalb von 4 h zu beobachten. - Wählen Sie das Zeitintervall und die Dauer aus, um Bilder zu sammeln, indem Sie auf die Werte im TimeSequence-Bedienfeld klicken und diese eingeben.
HINWEIS: Die Erfassung von Bildern alle 1 bis 5 Minuten ist geeignet, um die Dynamik des mitotischen Fortschreitens zu überwachen. Die Gesamtdauer der Bildgebung sollte den gewünschten Endpunkt und die Proliferationsrate der Zelllinie widerspiegeln. Zum Beispiel, 4 Stunden ist ausreichend, um zu sehen, viele Zellen Fortschritt durch Mitose, 16 Stunden ist ausreichend, um die meisten RPE-1-Zellen in einer asynchronen Population Fortschritt durch Mitose zu sehen.
4. Zeitraffer-Bildanalyse zur Bestimmung des Metaphasen-Timings und des mitotischen Zellschicksals nach mitotischen Spindelstörungen
HINWEIS: Führen Sie die Bildanalyse mit einer Bildaufnahmesoftware (Tabelle der Materialien), ImageJ oder einer vergleichbaren Bildanalysesoftware durch.
- Visualisieren Sie RFP-H2B mit Chromatin, indem Sie die Bilder auswählen, die mit dem RFP-Filterwürfel aufgenommen wurden. Identifizieren Sie eine Zelle, die mitosis eintritt, wie durch die anfängliche Chromatinverdichtung(Abbildung 2C, blaue Pfeilspitze) und die Kernhülle unterbrochen (wenn die Kerngrenze nicht mehr ausgeschlossen ist).
- Bestimmen des mitotischen Timings der Metaphasenausrichtung und des Anaphasenbeginns in einzelnen Zellen: Verfolgen Sie die Zelle durch aufeinander folgende Zeitpunkte im erworbenen Film, um die Anzahl der Zeitpunkte/Minuten vom mitotischen Eintrag bis zum RFP-H2B-markierten Chromatin zu bestimmen. vervollständigt die Ausrichtung am Zelläquator während der Metaphase(Abbildung 2C, gelbe Pfeilspitze).
- Um das mitotische Timing, die mitotische Treue und das Zellschicksal zu überwachen, verfolgen Sie die Zelle weiterhin durch aufeinander folgende Zeitpunkte, um die Zeitkoordinate zu identifizieren, bei der die Anaphasen-Chromosomensegregation sichtbar ist(Abbildung 2C, weiße Pfeilspitze) und/oder wo Chromatin-Dekomprimierung und Kernhüllen-Reformation (wie durch Tubulin-Ausschluss aus dem Kern angegeben) eingetreten ist.
HINWEIS: Störungen in der Spindelbaugruppe oder mitotischen Progression können als Funktion der Zeit beurteilt werden, die erforderlich ist, um eine bipolare mitotische Spindel zu erhalten und eine vollständige Chromosomenausrichtung zu erreichen oder die Anaphasen-Chromosomentrennung zu vollenden. - Visualisieren Sie RFP-H2B, um Zellen in jeder Population zu identifizieren, die mitotische Defekte aufweisen, einschließlich verzögerter Chromosomen und Chromatinbrücken während der Anaphasen-Chromosomensegregation.
HINWEIS: Kompromittierte mitotische Treue kann auch zu mehrninierten oder mikronukleierten Tochterzellen führen und kann in Zellen postmitotischen Austritt visualisiert werden, wie in Abbildung 3.
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Ergebnisse
Bewertung der mitotischen Progression in Gegenwart von Spindelstörungen
Die Regelung der Spindelpolfokussierung ist ein wesentlicher Schritt in der richtigen bipolaren Spindelbildung. Störung in diesem Prozess durch Proteinabbau, Medikamentenhemmung oder Veränderungen in der Zentromitenzahl korrupte Spindelstruktur und Verzögerung oder Stopp der mitotischen Progression10,11,12...
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Diskussion
Die zeitliche Auflösung der Zeitraffer-Bildgebung ermöglicht die Visualisierung und Bewertung sequenzieller zellulärer Ereignisse innerhalb einzelner Zellen. Ansätze, die die zelluläre Synchronisierung nutzen, gefolgt von der Erfassung und Fixierung von Zellen zu sequenziellen Zeitpunkten, sind insofern begrenzt, als Vergleiche zwischen Gruppen von Zellen durchgeführt werden. In Kontexten, in denen die zelluläre Reaktion auf Störungen ungleichmäßig sein kann oder in denen der zu visualisierte Prozess dynamisch ist, ist d...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
DLM wird von einem NSF-GRFP unterstützt. ALM wird durch fördermittelweise aus dem Smith Family Award for Excellence in Biomedical Research gefördert.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,05 % Trypsin | Gibo-Life sciences | 25-510 | Eine Serinprotease zur Freisetzung adhärenter Zellen aus Kulturschalen |
| 15 ml Zentrifugenröhrchen | Olympus Plastics | 28-101 | |
| 20x CFI Plan Fluor Objektiv | Nikon | Zur Verwendung in der Lebendzellbildgebung zur Visualisierung von Hellfeld- und Fluoreszenzzellen | |
| 293T Zellen | ATCC | CRL-3216 | Zur Verwendung in der retroviralen Transfektion; verwendet in Schritt 1.1 |
| a-Tubulin-EGFP | Addgene | verschiedene Nummern | Expressionsvektor für Alpha-Tubulin, das mit einem grün fluoreszierenden Protein-Tag fusioniert ist; zur Verwendung bei der Visualisierung von Tubulin in der Lebendzellbildgebung: kommerziell erhältlich über Addgene und andere Anbieter |
| Alisertib | Selleckchem | S1133 | Kleinmolekularer Inhibitor der mitotischen Kinase Aurora A. Die Stammkonzentration wird bei 10 mM in DMSO hergestellt und bei einer Endkonzentration von 100 nM verwendet. |
| Blasticidin | Invitrogen | A11139-03 | Antibiotika-Selektionsmittel; zur Selektion von a-tub-EGFP-exprimierenden Zellen |
| C02 | Airgas | Zur Verwendung in Zellkulturen und Lebendzell-Imaging | |
| Chroma ET-DS Rot (TRITC/Cy3) | Chroma | 49005 | Einband-Filterset; Anregungswellenlänge 545 nm mit 25 nm Bandbreite und Emission bei 605 nm Wellenlänge mit 70 nm Bandbreite; zur Visualisierung von H2B-RFP |
| Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2) | Chroma | 49002 | Einband-Filterset; Anregungswellenlänge 470nm mit 40nm Bandbreite und Emission bei 525nm Wellenlänge mit 50nm Bandbreite; zur Visualisierung von GFP-Tubulin |
| Einwegglas Pastuer-Pipetten, sterilisiert | Fisher Scientific | 13-678-6A | Zur Verwendung in aspirierenden Zellen |
| Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibo-Life sciences | 11965-084 | Zellkulturmedium für das Wachstum von RPE-1- und 293T-Zellen |
| Fetales Rinderserum (FBS) | Gibo-Life sciences | 10438-026 | Nahrungsergänzungsmittel für Zellkulturmedien |
| Lipofectamine 3000 und p3000 | Invitrogen | L3000-015 | Transfektionsreagenz auf Lipidbasis für die Transfektion von Plasmiden; verwendet in 1.1.4 |
| Multi-Well-Gewebekulturschalen | Corning | verschiedene | für den Einsatz in der Zellkultur, Transfektion/Infektion und Lebendzellbildgebung |
| Nikon Ti-E Mikroskop | Nikon | Inverses Epifluoreszenzmikroskop für den Einsatz in der Lebendzellbildgebung | |
| NIS Elements HC | Nikon | Version 4.51 | Software zur Bilderfassung und -analyse; verwendet in den Abschnitten 3 & 4 |
| OPTI-MEM | Gibo-Life sciences | 31985-070 | Reduziertes Serummedium für die Zelltransfektion; verwendet in Schritt 1.1.3 |
| Penicillin/Streptomycin | Gibo-Life Sciences | 15140-122 | Antibiotikum zur Verwendung in Zellkulturmedium |
| Phosphatpufferrote Kochsalzlösung (PBS) | Caisson Labs | PBP06-10X1LT | sterile Kochsalzlösung zur Verwendung mit Zellkulturen |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | Lentivirales VSV-G Hüllexpressionskonstrukt; verwendet in Schritt 1.1.4 |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | Kationisches Polymer zur Steigerung der Effizienz von Virusinfektionen; verwendet in Schritt 1.1.10 |
| psPAX | Addgene | 12260 | lentivirales Verpackungsplasmid der 2. Generation; verwendet in Schritt 1.1.4 |
| Puromycin | Invitrogen | ant-pr-1 | Antibiotikum-Auswahlmittel; verwendet zur Selektion für RFP-H2B-exprimierende Zellen |
| RFP-Histon 2B (H2B) | Addgen | verschiedene Zahlen | Expressionsvektor für rot fluoreszierendes Protein-markiertes Histon 2B; zur Verwendung bei der Visualisierung von Chromatin in der Bildgebung lebender Zellen: kommerziell erhältlich über Addgene und andere Anbieter |
| RNAi Max | Invitrogen | 13778-150 | Transfektionsreagenz auf Lipidbasis für die Transfektion von siRNA-Konstrukten |
| RPE-1-Zellen | ATCC | CRL-4000 | Menschliche retinale Pigmentepithelzelllinie |
| Gewebekulturschale 100x20mm | Corning | 353003 | zur Kultivierung adhärenter Zellen |
| Zyla sCMOS-Kamera | Nikon-Kamera | , die am Mikrofon befestigt ist und zum Aufnehmen von Bildern von Zellen verwendet wird |
Referenzen
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