Hier stellen wir ein Protokoll zur Beurteilung der Dynamik der Spindelbildung und der mitotischen Progression vor. Unsere Anwendung der Zeitraffer-Bildgebung ermöglicht es dem Anwender, Zellen in verschiedenen Stadien der Mitose zu identifizieren, mitotische Defekte zu verfolgen und zu identifizieren und die Spindeldynamik und das mitotische Zellschicksal bei Exposition gegenüber Anti-Mitotik-Medikamenten zu analysieren.
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Methodenartikel
Live Cell Imaging zur Bewertung der Dynamik von Metaphasen-Timing und Zellschicksal nach mitotischen Spindelstörungen
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Live-Zell-Zeitraffer-Bildgebung ist ein wichtiges Werkzeug in der Zellbiologie, das Einblicke in zelluläre Prozesse bietet, die andernfalls von der Fixed-Cell-Analyse übersehen, missverstanden oder falsch interpretiert werden könnten. Während die fixe Zellbildgebung und -analyse robust und ausreichend ist, um den zellulären Stationären Zustand zu beobachten, kann sie bei der Definition einer zeitlichen Reihenfolge der Ereignisse auf zellulärer Ebene eingeschränkt sein und ist schlecht gerüstet, um die transiente Natur dynamischer Prozesse einschließlich mitotische Progression. Im Gegensatz dazu ist die Live-Zell-Bildgebung ein eloquentes Werkzeug, das verwendet werden kann, um zelluläre Prozesse auf einzelzelliger Ebene im Laufe der Zeit zu beobachten, und hat die Fähigkeit, die Dynamik von Prozessen zu erfassen, die sonst in der Bildgebung fester Zellen schlecht dargestellt wären. Hier beschreiben wir einen Ansatz zur Erzeugung von Zellen, die fluoreszierend markierte Marker von Chromatin und Mikrotubuli tragen, und deren Verwendung in Live-Zell-Bildgebungsansätzen zur Überwachung der Metaphasenchromosomausrichtung und des mitotischen Austritts. Wir beschreiben bildgebende Techniken zur Beurteilung der Dynamik der Spindelbildung und der mitotischen Progression, einschließlich der Identifizierung von Zellen in verschiedenen Stadien der Mitose, der Identifizierung und Verfolgung von mitotischen Defekten und der Analyse der Spindeldynamik und mitotischezellliche semittizische Zellschicksale nach der Behandlung mit mitotischen Inhibitoren.
Einleitung
Die bildbasierte Analyse fester Zellen wird häufig verwendet, um die Veränderungen der Zellpopulationsebene als Reaktion auf verschiedene Störungen zu bewerten. In Kombination mit der Zellsynchronisierung, gefolgt von der Erfassung und Abbildung von seriellen Zeitpunkten, können solche Ansätze verwendet werden, um eine zelluläre Abfolge von Ereignissen vorzuschlagen. Dennoch ist die Bildgebung fester Zellen insofern begrenzt, als zeitliche Beziehungen für eine Population impliziert und nicht auf der Ebene einzelner Zellen nachgewiesen werden. Auf diese Weise reicht die Bildgebung und Analyse fester Zellen zwar aus, um robuste Phänotypen und stationäre Veränderungen zu....
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Protokoll
1. Erzeugung von hTERT-RPE-1-Zellen, die rFP-Histone 2B (RFP-H2B) und s-tubulin-EGFP (tub-EGFP) stabil exemiten
HINWEIS: Alle Schritte folgen aseptischen Techniken und finden in einem Sicherheitsschrank der Biosicherheitsstufe II+ (BSL2+) statt.
- Generieren Sie Retrovirus, das die Gene von Interesse (-Tubulin-EGFP und RFP-H2B) durch die Transfektion von 293T-Zellen mit den entsprechenden lentiviralen Plasmiden gemäß den Anweisungen des Herstellers des lipidbasierten Transfektionsabgabesystems trägt.
- Tag 1: Verwenden Sie eine Einwegglas Pasteur Pipette, um das Zellkulturmedium von einer Platte von sub-konfluenten 293T-Zellen....
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Ergebnisse
Bewertung der mitotischen Progression in Gegenwart von Spindelstörungen
Die Regelung der Spindelpolfokussierung ist ein wesentlicher Schritt in der richtigen bipolaren Spindelbildung. Störung in diesem Prozess durch Proteinabbau, Medikamentenhemmung oder Veränderungen in der Zentromitenzahl korrupte Spindelstruktur und Verzögerung oder Stopp der mitotischen Progression10,11,12.......
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Diskussion
Die zeitliche Auflösung der Zeitraffer-Bildgebung ermöglicht die Visualisierung und Bewertung sequenzieller zellulärer Ereignisse innerhalb einzelner Zellen. Ansätze, die die zelluläre Synchronisierung nutzen, gefolgt von der Erfassung und Fixierung von Zellen zu sequenziellen Zeitpunkten, sind insofern begrenzt, als Vergleiche zwischen Gruppen von Zellen durchgeführt werden. In Kontexten, in denen die zelluläre Reaktion auf Störungen ungleichmäßig sein kann oder in denen der zu visualisierte Prozess dynamisch ist, ist d.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
DLM wird von einem NSF-GRFP unterstützt. ALM wird durch fördermittelweise aus dem Smith Family Award for Excellence in Biomedical Research gefördert.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,05 % Trypsin | Gibo-Life sciences | 25-510 | Eine Serinprotease zur Freisetzung adhärenter Zellen aus Kulturschalen |
| 15 ml Zentrifugenröhrchen | Olympus Plastics | 28-101 | |
| 20x CFI Plan Fluor Objektiv | Nikon | Zur Verwendung in der Lebendzellbildgebung zur Visualisierung von Hellfeld- und Fluoreszenzzellen | |
| 293T Zellen | ATCC | CRL-3216 | Zur Verwendung in der retroviralen Transfektion; verwendet in Schritt 1.1 |
| a-Tubulin-EGFP | Addgene | verschiedene Nummern | Expressionsvektor für Alpha-Tubulin, das mit einem grün fluoreszierenden Protein-Tag fusioniert ist; zur Verwendung bei der Visualisierung von Tubulin in der Lebendzellbildgebung: kommerziell erhältlich über Addgene und andere Anbieter |
| Alisertib | Selleckchem | S1133 | Kleinmolekularer Inhibitor der mitotischen Kinase Aurora A. Die Stammkonzentration wird bei 10 mM in DMSO hergestellt und bei einer Endkonzentration von 100 nM verwendet. |
| Blasticidin | Invitrogen | A11139-03 | Antibiotika-Selektionsmittel; zur Selektion von a-tub-EGFP-exprimierenden Zellen |
| C02 | Airgas | Zur Verwendung in Zellkulturen und Lebendzell-Imaging | |
| Chroma ET-DS Rot (TRITC/Cy3) | Chroma | 49005 | Einband-Filterset; Anregungswellenlänge 545 nm mit 25 nm Bandbreite und Emission bei 605 nm Wellenlänge mit 70 nm Bandbreite; zur Visualisierung von H2B-RFP |
| Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2) | Chroma | 49002 | Einband-Filterset; Anregungswellenlänge 470nm mit 40nm Bandbreite und Emission bei 525nm Wellenlänge mit 50nm Bandbreite; zur Visualisierung von GFP-Tubulin |
| Einwegglas Pastuer-Pipetten, sterilisiert | Fisher Scientific | 13-678-6A | Zur Verwendung in aspirierenden Zellen |
| Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibo-Life sciences | 11965-084 | Zellkulturmedium für das Wachstum von RPE-1- und 293T-Zellen |
| Fetales Rinderserum (FBS) | Gibo-Life sciences | 10438-026 | Nahrungsergänzungsmittel für Zellkulturmedien |
| Lipofectamine 3000 und p3000 | Invitrogen | L3000-015 | Transfektionsreagenz auf Lipidbasis für die Transfektion von Plasmiden; verwendet in 1.1.4 |
| Multi-Well-Gewebekulturschalen | Corning | verschiedene | für den Einsatz in der Zellkultur, Transfektion/Infektion und Lebendzellbildgebung |
| Nikon Ti-E Mikroskop | Nikon | Inverses Epifluoreszenzmikroskop für den Einsatz in der Lebendzellbildgebung | |
| NIS Elements HC | Nikon | Version 4.51 | Software zur Bilderfassung und -analyse; verwendet in den Abschnitten 3 & 4 |
| OPTI-MEM | Gibo-Life sciences | 31985-070 | Reduziertes Serummedium für die Zelltransfektion; verwendet in Schritt 1.1.3 |
| Penicillin/Streptomycin | Gibo-Life Sciences | 15140-122 | Antibiotikum zur Verwendung in Zellkulturmedium |
| Phosphatpufferrote Kochsalzlösung (PBS) | Caisson Labs | PBP06-10X1LT | sterile Kochsalzlösung zur Verwendung mit Zellkulturen |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | Lentivirales VSV-G Hüllexpressionskonstrukt; verwendet in Schritt 1.1.4 |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | Kationisches Polymer zur Steigerung der Effizienz von Virusinfektionen; verwendet in Schritt 1.1.10 |
| psPAX | Addgene | 12260 | lentivirales Verpackungsplasmid der 2. Generation; verwendet in Schritt 1.1.4 |
| Puromycin | Invitrogen | ant-pr-1 | Antibiotikum-Auswahlmittel; verwendet zur Selektion für RFP-H2B-exprimierende Zellen |
| RFP-Histon 2B (H2B) | Addgen | verschiedene Zahlen | Expressionsvektor für rot fluoreszierendes Protein-markiertes Histon 2B; zur Verwendung bei der Visualisierung von Chromatin in der Bildgebung lebender Zellen: kommerziell erhältlich über Addgene und andere Anbieter |
| RNAi Max | Invitrogen | 13778-150 | Transfektionsreagenz auf Lipidbasis für die Transfektion von siRNA-Konstrukten |
| RPE-1-Zellen | ATCC | CRL-4000 | Menschliche retinale Pigmentepithelzelllinie |
| Gewebekulturschale 100x20mm | Corning | 353003 | zur Kultivierung adhärenter Zellen |
| Zyla sCMOS-Kamera | Nikon-Kamera | , die am Mikrofon befestigt ist und zum Aufnehmen von Bildern von Zellen verwendet wird |
Referenzen
- Szuts, D., Krude, T. Cell cycle arrest at the initiation step of human chromosomal DNA replication causes DNA damage. Journal of Cell Science. 117, 4897-4908 (2004).
- Gayek, A. S., Ohi, R. CDK-1 Inhibition in G2 Stabilizes Kinetochor....
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Nachdrucke und Genehmigungen
