Intrathekale Lieferung von Antisense Oligonukleotiden im Zentralen Nervensystem der Ratte

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine Methode zur Abgabe von Medikamenten an das zentrale Nervensystem der Ratte, indem wir einen Katheter in den lendenintrathekalen Raum der Wirbelsäule implantieren. Wir konzentrieren uns auf die Lieferung von Antisense-Oligonukleotiden, obwohl diese Methode auch für die Lieferung anderer therapeutischer Modalitäten geeignet ist.

Zusammenfassung

Die Blut-Hirn-Schranke (BBB) ist eine wichtige Abwehr gegen den Eintritt potenziell toxischer oder pathogener Wirkstoffe aus dem Blut in das Zentralnervensystem (ZNS). Seine Existenz verringert jedoch auch die Zugänglichkeit systemisch verabreichter therapeutischer Wirkstoffe zum ZNS drastisch. Eine Methode, dies zu überwinden, besteht darin, diese Wirkstoffe direkt in die Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) zu injizieren und damit die BBB zu umgehen. Dies kann durch Implantation eines Katheters zur kontinuierlichen Infusion mit einer osmotischen Pumpe oder zur Einzelbolusabgabe erfolgen. In diesem Artikel beschreiben wir ein chirurgisches Protokoll zur Abgabe von CNS-targeting Antisense Oligonukleotiden (ASOs) über einen Katheter, der direkt in den Cauda-Equina-Raum der erwachsenen Rattenwirbelsäule implantiert wird. Als repräsentative Ergebnisse zeigen wir die Wirksamkeit einer einzelnen Bolus-ASO-Intrathekalinjektion (IT) über dieses Katheterisierungssystem bei der Abschlagsmenge der Ziel-RNA in verschiedenen Regionen des Ratten-ZNS. Das Verfahren ist sicher, effektiv und erfordert keine teure Ausrüstung oder chirurgische Werkzeuge. Die hier beschriebene Technik kann angepasst werden, um Medikamente auch in anderen Modalitäten zu liefern.

Einleitung

Das Gefäßsystem des Zentralnervensystems (ZNS) hat sich zu einem kritischen Regulator der Homöostase entwickelt, der den Handel mit Molekülen steuert, Nährstoffe liefert und Abfall loswird. Dieses System ist auch die erste Verteidigungslinie gegen Angriffe von externen Krankheitserregern, dank einer dichten Verteilung von engen Kreuzungen entlang der Wände der Endothelzellen. Diese engen Kreuzungen bilden einen Aspekt der Blut-Hirn-Schranke (BBB). Während das BBB den Transport von Molekülen ermöglicht, die zur Erfüllung des Nährstoff- und Energiebedarfs (z.B. Ionen, Glukose) erforderlich sind, begrenzt es auch selektiv den Durchgang von Krankheitserregern sowie toxisc....

Protokoll

Alle In-vivo-Verfahren wurden im Rahmen des vom Biogen Institutional Animal Use and Care Committee (IACUC) genehmigten Protokollen durchgeführt, die den Richtlinien des United States National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren entsprechen.

1. Material- und Instrumentenvorbereitung

1. Bereiten Sie die speziellen Führungskanülen vor.
   1. Verwenden Sie ein Drehwerkzeug mit Trennrad (oder einer scharfen Säge), um die beiden Enden einer 19 G Nadel abzuschneiden, was zu einer 1,5 x 2 cm langen Führungskanüle führt(Abbildung 1Aiii). Verwenden Sie die Sc....

Ergebnisse

Mit der hier beschriebenen Methode injizierten wir zwei Gruppen erwachsener weiblicher Ratten (250-300 g; n = 10/Gruppe) entweder mit einem einzigen Bolus phosphatgepufferter Saline-PBS oder 300 g ASO, die auf die lange nicht-kodierende (linc) RNA Malat1 abzielten; in unserem Labor verwenden wir routinemäßig die Malat1 ASO als Werkzeugverbindung, weil Malat1 allgegenwärtig und auf hohen Ebenen in allen Geweben¹⁴ausgedrückt wird, einschließlich Gehirn und Rückenmark.......

Diskussion

Der vorliegende Artikel zeigt eine leistungsfähige Methode, um therapeutische Wirkstoffe direkt in das CNS der Ratte zu liefern. Theoretisch kann eine ähnliche Technik auch bei Mäusen durchgeführt werden, obwohl aufgrund der kleineren Größe die Methode anspruchsvoller sein kann. Daher führt unsere Gruppe intracerebroventricular (ICV) Injektionen bei Mäusen für die CNS-Medikamentenabgabe durch, die die gleichen Ziele über einen anderen Verabreichungsweg erreichen. Diese Methode wurde in einer anderen Studie beschrieben

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
3M Steri-Drape Kleines Abdecktuch mit Klebeöffnung	3M		1020
70% Ethanol	Decon Laboratories, Inc		8416-160Z
Alkoholtupfer Stäbchen	Dynarex		NO 1204
BD Spritzen für den allgemeinen Gebrauch 1 mL Luer-Lok Spitze	BD	1ml TB Luer-Lok Spitze	BD 302830
BD Intramedic PE Schlauch	BD	Polyethylen Schlauch PE50 Durchmesser 0,023 Zoll	BD 427400 (10ft, Fischer Scientific 22-204008) oder 427401 (100ft, Fischer Scientific 14-170-12P)
BD Intramedic PE Schlauch	BD	Polyethylenschlauch PE10 Durchmesser 0,011 Zoll	BD 427410 (10ft, Fischer Scientific 14-170-11B) oder 4274011 (100ft, Fischer Scientific 14-170-12B)
BD Intramedic PE Schlauchadapter	BD	23 Gauge Intramedic Luer Stub Adaper	BD 427565 oder Fisher Scientific 14-826-19E
BD PrecisionGlide Einwegnadeln 30G	BD		BD 305128
Buprenorphin Sustained Release-Labor	ZooPharm	Verschreibungspflichtiger
Ethylenoxid-Sterilisator	Andersen Sterilizer INC.	AN 74i, Gassterilisator	AN 74i
Führungskanüle	BD	19G x 1 WT (1,1 mm x 25mm) Nadel	BD 305186
Hamilton Spritze 100ul	Hamilton Company	Hamilton Spritze 100ul
Heißperlensterilisator	Fine Science Tools		STERILISATOR MODELLNR FST 250
Augensalbe	Dechra Veterranery Produkt		17033-211-38
Pocket Pro Haustiertrimmer	Braintree Scientific		CLP-9931 B
Povidon-Peeling	PDI		S48050
Kochsalzlösung	Baxter	Natriumchlorid 0,9% Intravenöse Infusion BP 50 ml	FE1306G
Skalpell	Feder	Einweg-Skalpell	Nr. 10
Heizkissen für Kleintiere	K& H Herstellungsmodell		# 1060
Stilettdraht	McMaster-Carr	1749T14	LH-36233780
Chirurgie-Handtuchtuch	Dynarex		4410
Chirurgische Schere und Pinzette	FST und Fisher Scientific
Nähte	Ethicon		4-0 oder 5-0
Werkzeug zur Herstellung der Führungskanüle	Grainger	Rotationswerkzeug (Dremel)	14H446 (Hersteller: EZ456)
		EZ lock Trennscheibe	1PKX5 (Hersteller: 3000-1/24)
		Schleifscheibe, Aluminiumoxid	38EY44 (Hersteller: EZ541GR)
		EZ lock Dorn	1PKX8 (Hersteller: EZ402-01)
		Diamantscheibe Boden Fliese	3DRN4 (Hersteller: EZ545)
Alternative Quelle für vorgefertigte und sterilisierte Materialien für dieses Verfahren
Dosierkathetersystem	SAI Infusionssysteme		RIDC-01
Führungskanüle	SAI Infusionssysteme		RIDC-GCA
Interne Katheter	SAI Infusionssysteme		RIDC-INC
Stilettdraht	SAI Infusionssysteme		RIDC-STY