Die in diesem Protokoll vorgestellten Co-Kultur-Interaktions-Assays sind kostengünstig, hochdurchstöbet und einfach. Diese Assays können verwendet werden, um mikrobielle Wechselwirkungen in der Kokultur zu beobachten, Interaktionsmuster zu identifizieren und das hemmende Potenzial eines mikrobiellen Stammes von Interesse gegen menschliche und ökologische Krankheitserreger zu charakterisieren.
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Methodenartikel
High Throughput Co-Culture Assays für die Untersuchung mikrobieller Wechselwirkungen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Mikroorganismen hat zu zahlreichen Entdeckungen geführt, von neuartigen antimikrobiellen Mitteln bis hin zu Erkenntnissen in der mikrobiellen Ökologie. Viele Ansätze, die für die Untersuchung mikrobieller Wechselwirkungen verwendet werden, erfordern spezielle Ausrüstung und sind teuer und zeitintensiv. Dieses Dokument stellt ein Protokoll für Co-Kultur-Interaktionstests vor, die kostengünstig, skalierbar auf große Stichprobennummern sind und sich leicht an zahlreiche experimentelle Designs anpassen lassen. Mikroorganismen werden zusammen kultiviert, wobei jeder Brunnen eine paarweise Kombination von Mikroorganismen darstellt. Ein Testorganismus wird auf einer Seite jedes Brunnens kultiviert und zuerst in Monokultur inkubiert. Anschließend werden Zielorganismen gleichzeitig mit einem 3D-gedruckten Impfstempel auf die gegenüberliegende Seite jedes Brunnens geimpft. Nach der Co-Kultur werden die abgeschlossenen Assays für visuelle Phänotypen wie Wachstum oder Hemmung bewertet. Diese Assays können verwendet werden, um Phänotypen zu bestätigen oder Muster unter Isolaten von Interesse zu identifizieren. Mit dieser einfachen und effektiven Methode können Anwender Kombinationen von Mikroorganismen schnell und effizient analysieren. Dieser Co-Kultur-Ansatz gilt sowohl für die Entdeckung von Antibiotika als auch für die kulturbasierte Mikrobiomforschung und wurde bereits erfolgreich auf beide Anwendungen angewendet.
Einleitung
In der Natur existieren Mikroorganismen selten isoliert; folglich interagieren sie ständig mit anderen Organismen. Daher ist es wichtig, zu untersuchen, wie Mikroorganismen miteinander interagieren, um eine Vielzahl von mikrobiellen Verhaltensweisen zu verstehen1. Mikrobielle Wechselwirkungen können gegenseitigkeits-, kominsiver oder antagonistischer sein. Diese In-teractions können nicht nur die Mikroorganismen selbst beeinflussen, sondern auch die Umgebungen und Wirte, die die Mikroorganismen besiedeln1,2.
Viele Wissenschaftler untersuchen mikrobielle Wechselwirkungen, um neue antimikrobielle Moleküle zu identifizieren. Eines der ersten klinisch wichtigen antimikrobiellen Moleküle wurde durch die Untersuchung von mikrobiellen Wechselwirkungen gefunden. Sir Alexander Fleming beobachtete ein kontaminierendes Penicillium spp. Isolat, das das Wachstum eines Staphylococcus-Stamms hemmte, was zur Entdeckung des häufig verwendeten Antibiotikums Penicillin3führte. Die Charakterisierung der Mechanismen, die Mikroorganismen verwenden, um ihre Konkurrenten zu verärgern, bleibt eine fruchtbare Ressource für die Entdeckung antimikrobieller Moleküle. Zum Beispiel wurde kürzlich gezeigt, dass Streptomyces sp. Stamm Mg1 antibiotische Linearmycine produziert, die eine lytische und abbauende Wirkung gegen Bacillus subtilis4haben.
Darüber hinaus wurde kürzlich ein nicht-ribosomal synthetisiertes Peptid namens Lugdunin entdeckt, nachdem festgestellt wurde, dass der nasale Commensal Staphylococcus lugdunensis Staphylococcus aureus5hemmt. Studien haben auch gezeigt, dass mutualistische Wechselwirkungen zwischen Mikroorganismen ebenso stark sind wie antagonistische Wechselwirkungen für die Entdeckung antimikrobieller Moleküle. Zum Beispiel beherbergen viele pilzbewirtschaftende Ameisen im Stamm Attini symbiotische Bakterien namens Pseudonokardie auf ihrem Exoskelett, das antimykotische Moleküle produziert, um einen obligaten Erreger ihrer Pilzernte zu hemmen6. Da die Untersuchung mikrobieller Wechselwirkungen für die Entdeckung antimikrobieller Moleküle von Vorteil war, kann die Verwendung von Bildschirmen mit hohem Durchsatz zur Entdeckung neuer antimikrobieller Moleküle führen.
In Bezug auf die Kosten und die Leichtigkeit der Leistung reichen die Methoden zur Untersuchung mikrobieller Wechselwirkungen von einfach bis komplex. Zum Beispiel ist ein Agar-Plug-Assay eine kostengünstige und einfache Methode, die verwendet werden kann, um Antagonismus zwischen mehreren Mikroorganismen zu untersuchen7. Ein Agar-Plug-Assay ist jedoch kein effizientes Verfahren und kann für viele paarweise Kombinationen arbeitsintensiv sein. Um die Auswirkungen mikrobiell hergestellter Produkte auf Zielisolate mit hohem Durchsatz zu bewerten, verwenden viele Laboratorien Plattendiffusionstests8. Diese Assays sind einfach und kostengünstig und können auf eine höhere Anzahl von Probenskalierbarsein 7 . Dieser Test erfordert jedoch die Erzeugung von mikrobiellen Extrakten und kann irreführende Ergebnisse für bestimmte Kombinationen von Zielorganismen und Antibiotika wie Salmonellen und Cephalosporinen9produzieren.
Die vorhergehenden Ansätze basieren auf isolierten Komponenten, um eine Reaktion in einem Zielorganismus auszulösen, anstatt Mikroorganismen die Interaktion miteinander zu ermöglichen. Dies ist bemerkenswert, da Wechselwirkungen zwischen Mikroben die Produktion von "kryptischen" antimikrobiellen Molekülen auslösen können, die nicht in monokultural produziert werden. So wurde kürzlich gezeigt, dass das antimikrobielle Keyicin nur von einem Micromonospora sp. produziert wird, wenn es mit einem Rhodococcus sp. kokultiviert wird, der aus dem gleichen Schwammmikrobiom10isoliert ist. Komplexere Interaktionsmethoden umgehen dieses potenzielle Monokulturhindernis. Zum Beispiel ist der iChip nützlich für die Isolierung seltener und schwer zu kultivierender Bakterien aus Umweltproben und ermöglicht die Beobachtung mikrobieller Wechselwirkungen durch Wachstum in situ11. Um Wechselwirkungen im Detail zu untersuchen, kann eine matrixgestützte Laser-Desorption/Ionisationszeit-of-Flight-Bildgebungs-Massenspektrometrie (MALDI-TOF-IMS) verwendet werden. Dieser Ansatz liefert detaillierte Informationen über die Zusammensetzung und Verteilung von kleinen Molekülen und Peptiden, die durch interagierende mikrobielle Kolonien mit hoher räumlicher Auflösung erzeugt werden. MALDI-TOF-IMS wurde auch in mehreren Studien von bakteriellen Wechselwirkungen verwendet, um die Mechanismen des Wettbewerbs12,13,14,15zu charakterisieren. MALDI-TOF-IMS erfordert jedoch oft eine aufwendige Probenvorbereitung, spezielles Know-how für den Betrieb der Geräte sowie teure und spezialisierte Massenspektrometer. Aus diesen Gründen ist es eine schwierige Technik für Studien mit hohem Durchsatz zu verwenden. Daher wäre ein einfacher, skalierbarer und hoher Durchsatz-Co-Kultur-Assay für mikrobielle Wechselwirkungen, der viele Einschränkungen der oben genannten Ansätze überwindet, von Vorteil.
Hier wird ein Protokoll für die mikrobielle Kokultur mit hohem Durchsatz vorgestellt. Dieser Test ist einfach und leicht in bereits bestehende Studien über mikrobielle Wechselwirkungen integriert. Im Gegensatz zu vielen häufig verwendeten Methoden zur Untersuchung mikrobieller Wechselwirkungen ist unsere Methode einfach, kostengünstig und kann eine große Anzahl von Wechselwirkungen untersuchen. Diese Assays sind nicht nur einfach durchzuführen, sondern die Materialien sind bei den meisten Laborlieferanten oder öffentlichen Ressourcen (z. B. Bibliotheken und Makerspaces) weit verbreitet. Folglich ist dieser Test als erste Untersuchungslinie vorteilhaft, um interessante Muster unter vielen paarweisen Kombinationen von Mikroorganismen zu identifizieren und zu analysieren, was besonders für die Untersuchung der mikrobiellen Ökologie nützlich sein kann.
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Protokoll
Die Eltern des Spenders erhielten die Zustimmung, und das Human Subjects Committee der University of Wisconsin-Madison genehmigte die Studie (Institutional Review Board [IRB] Zulassungsnummer H-2013-1044).
1. Beispielkultur
HINWEIS: Dieses Verfahren wird hier für die Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen Bakterienisolaten aus der menschlichen Nasenhöhle verwendet. Grundsätzlich gelten die folgenden Methoden für jede Kulturbedingung. Gehirn-Herz-Infusionsbrühe (BHI) wird zur allgemeinen Ausbreitung von Nasenbakterien verwendet. Alle Platten werden mit 1,5% Agar verfestigt. Für diese Studie werden Proben aus salzbildender Lösung entnommen, die in die Nase eines Spenders gespült (Nasenspülung), in Mikrozentrifugenröhren übertragen und bei -80 °C eingefroren wird.
- Verwenden Sie Standardkulturtechniken, um 100 l jeder aufgetauten Lavage-Proben auf BHI-Platten zu blechen.
- Die Platten 1 Woche lang aberisch bei 37 °C bebrüten.
- Nach der Inkubation wählen Sie 2 Kolonien jedes einzelnen Morphotyps pro Platte aus und durchleiten die Isolate aerob auf BHI-Platten, indem Sie eine Kolonie von der anfangsplatte auf eine neue BHI-Platte streichen und die Platte bei 37 °C bebrüten. Wiederholen Sie dies, bis die Bakterienkulturen rein sind.
HINWEIS: Bakterielle Isolate können durch Koloniemorphologie, Gram-Färbung, 16S rRNA-Gensequenzierung oder eine andere Methode identifiziert werden. Die Kenntnis der Identität des Isolats ist jedoch nicht erforderlich, um das Protokoll fortzusetzen. - Cryopreserve alle bakteriellen Isolate bei -80 °C nach der Kombination von 1 ml 50% Glycerin mit 1 ml bakterielle n-Nachtkultur (siehe Abschnitt 3) in Kryoröhren.
2. 3D-Druckstempel
HINWEIS: Polycarbonat wurde aufgrund seiner hohen Glasübergangstemperatur (147 °C), die die Standard-Autoklaventemperaturen (121 °C) überschreitet, als Stanzmaterial ausgewählt, wodurch das Verformungspotenzial nach wiederholten Verwendungen minimiert wird.
- Laden Sie den 3D-Drucker mit Polycarbonat-Filament.
- Tragen Sie weißen Schulkleber (Polyvinylacetat) auf das Druckbett auf, um die Haftung zu unterstützen und die Verformung des Impfstempels während des Drucks zu minimieren.
- Laden Sie die . STL-Modelldatei (Ergänzende Datendatei) für den Impfstempel (Abbildung 1) in die 3D-Druckersoftware.
- Drucken Sie den Impfstempel bei einer Düsentemperatur von 290 °C, einer Betttemperatur von 60 °C und einer Schichthöhe von 0,38 mm.
- Wickeln Sie den Stempel in die Aluminiumfolie und sterilisieren Sie durch Autoklavieren für 1,5 h auf einem Schwerkraftzyklus mit 15 min Trocknung.
HINWEIS: Obwohl Polycarbonat hygroskopisch ist, behalten die Marken nach dem Autoklavieren nur etwa 0,5% Wassergewicht.
3. Vorbereitung von Nachtkulturen
- Mit einer serologischen Pipette, Pipette 3 ml sterile BHI-Brühe in 14 ml Kulturröhren.
- Mit einer sterilen 1 L-Impfschleife, impfen Sie eine Bakterienkolonie in die Brühe. Wirbeln Sie die Schleife, um sicherzustellen, dass sich der Klumpen in die Brühe verteilt. Wirbeln Sie die Kulturröhren kurz vor der Inkubation.
- Die Kulturröhren bei 37 °C über Nacht (ca. 16 h) auf einem Shaker bei 250 U/min inkubieren.
- Wirbel, um die Klumpen von Zellen aufzubrechen, sobald die Bakterienkulturen genügend Trübung erreichen (OD600 x 1).
4. Herstellung von Bioassay-Platten
HINWEIS: Bioassay-Platten werden in einer laminaren Durchflusshaube hergestellt, um die Sterilität aufrechtzuerhalten.
- Bereiten Sie BHI-Medien mit 1,5% Agar vor und sterilisieren Sie durch Autoklavieren gemäß Herstelleranweisungen.
- Nach dem Autoklavieren die BHI-Medien in einem temperaturgeregelten Wasserbad auf 55 °C abkühlen.
- Mit einer serologischen Pipette, Pipette 3 ml geschmolzene BHI-Medien in jeden der 12 Brunnen auf einer 12 Brunnenplatte. Stellen Sie sicher, dass die Brunnen so genau und gleichmäßig wie möglich sind. Ein Liter Medien ergibt 27 Bioassay-Platten.
- Lassen Sie den Agar über Nacht setzen.
5. Impfung von Bioassay-Platten mit dem Testorganismus
HINWEIS: Ein Testorganismus bezieht sich auf den Organismus, für den die Produktion von hemmender Aktivität (z.B. Antibiotikaproduktion) mittels des Co-Kultur-Interaktionstests bestimmt wird. Für dieses Experiment sind die Testorganismen Actinobacteria, die aus Nasenspülproben isoliert werden.
- Impfen Sie den Testorganismus auf einer Bioassayplatte, indem Sie eine sterile 10-L-Impfschleife in die Nachtkultur einfügen und ein Kulturtröpfchen über das linke Drittel eines Plattenbrunnens streifen.
HINWEIS: Es wird empfohlen, nur ein Drittel des Brunnens zu streifen, da das Überwuchern des Brunnens die spätere Impfung von Zielorganismen verbietet. - Wiederholen Sie dies, bis alle 12 Brunnen auf der Platte mit dem Testorganismus geimpft wurden.
- Inkubieren Sie Platten bei der entsprechenden Temperatur für 7 Tage auf den Kopf. Bei höheren Temperaturen (ca. 37 °C) oder in trockeneren Klimazonen die Platten in einem feuchten Behälter aufbewahren, um ein Austrocknen der Platten zu verhindern.
6. Vorbereitung von Zielorganismen
HINWEIS: Ein Zielorganismus bezieht sich auf den Organismus, dessen Hemmungsstatus mit dem Co-Kultur-Interaktionstest bestimmt wird. Für dieses Experiment sind die Zielorganismen Staphylococcus spp. isoliert aus Nasenlavagesproben.
- Nach der Inkubation der Bioassayplatten für 6 Tage, bereiten Sie Übernachtkulturen der angegebenen Zielorganismen, wie oben getan (siehe Abschnitt 3).
7. Zielorganismus-Impfung
HINWEIS: Achten Sie nach der nächtlichen Inkubation darauf, dass die Kulturen trübe sind (OD600 x 1). Einige Bakterienkulturen können am Boden der Kulturröhre flockulieren. Wirbel die Kultur röhren, um Klumpen zu zerstreuen und die Kultur Trübung zu bewerten.
- Bereiten Sie die Zielplatte vor, indem Sie jeden Brunnen einer leeren 12-Well-Platte mit 1,8 ml BHI und 200 l der Ziel-Übernachtungskultur füllen.
- Auspacken und einen sterilen Impfstempel in die Zielplatte legen. Wirbeln Sie die Kulturen in den Brunnen sanft umher und achten Sie darauf, dass die Kulturen die benachbarten Brunnen nicht verunreinigen.
- Heben Sie den Impfstempel an und stellen Sie sicher, dass sich auf jeder Stempelspitze ein Tröpfchen verdünnter Zielkultur befindet.
-
Bereiten Sie eine Monokultur-Kontrollplatte vor, indem Sie den Impfstempel auf eine uninokulierte Bioassay-Platte legen und den Stempel sanft schaukeln, so dass jeder Brunnen durch einen Kulturabfall geimpft wird. Sobald der Impfstempel entfernt ist, sollte ein Tröpfchen Kultur in den Brunnen der Bioassayplatte sichtbar sein.
- Wenn Brunnen aufgrund ungleichmäßiger Medienwerte nicht mit dem Impfstempel geimpft werden, erkennen Sie mit einer Pipette 3 l verdünnte Nachtkultur auf der rechten Seite der Brunnen.
- Impfen Sie die Bioassay-Platten wie oben (siehe Schritt 7.4.1), richten Sie den Stempel jedoch so aus, dass sich die Spitzen an der rechten Seite der 12-Well-Platte ausrichten. Stellen Sie sicher, dass der Stempel bei der Impfung der Brunnen nicht mit der vorhandenen Bakterienkolonie in Kontakt tritt.
- Entfernen Sie den Stempel vorsichtig und legen Sie ihn wieder in die Zielplatte.
- Wiederholen Sie die Impfung für jede Bioassayplatte, bis alle Platten geimpft sind.
- Bioassay-Platten 7 Tage lang bei entsprechender Temperatur auf den Kopf stellen.
8. Scoring
-
Nachdem Sie die Test- und Zielorganismen 1 Woche lang mitgeprägt haben, bewerten Sie die Wechselwirkungen anhand der folgenden visuellen Bewertung:
- Bewerten Sie die Brunnen mit einem Zielorganismuswachstum, das ein Wachstum aufweist, das von der Monokulturkontrolle nicht zu unterscheiden ist, als "0" (keine Hemmung) (Abbildung 2A,B).
- Bewerten Sie die Brunnen mit Zielorganismus, der ein vermindertes Wachstum im Vergleich zur Kontrolle aufweist, als "1" (schwache Hemmung) (Abbildung 2C).
- Notieren Sie die Brunnen, in denen der Zielorganismus nicht wuchs, als "2" (starke Hemmung) (Abbildung 2D).
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Ergebnisse
Co-Kultur-Interaktions-Assays können verwendet werden, um mikrobielle Wechselwirkungen zu verstehen, Interessenmuster zu identifizieren und mikrobielle Isolate mit faszinierenden Aktivitäten aufzudecken. In diesen Tests wird ein Testorganismus auf einer Seite einer 12 Well-Agar-Platte monokultiviert und für 7 Tage inkubiert. Anschließend wird ein Zielorganismus neben dem Testorganismus gesichtet und die beiden Mikroben wurden 7 Tage lang gemeinsam kultiviert, bevor sie den Wachstumsphänot...
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Diskussion
Antibiotika und andere sekundäre Metaboliten, die mikrobielle Wechselwirkungen vermitteln, sind für eine Vielzahl von Anwendungen nützlich, einschließlich der Entdeckung von Arzneimitteln. Hierin wird ein Protokoll für Co-Kultur-Assays zur Bewertung einer großen Anzahl von mikrobiellen Wechselwirkungen vorgestellt. Diese Co-Kultur-Interaktions-Assays sind ein einfaches, erschwingliches, skalierbares und hohes Durchsatzmittel, um viele paarweise Kombinationen von Mikroorganismen im Tandem zu untersuchen. Zielorganismen we...
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Offenlegungen
Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.
Danksagungen
Wir danken Daniel May, Marc Chevrette und Don Hoang für die kritische Lektüre des Manuskripts. Diese Arbeit, einschließlich der Bemühungen von Cameron R. Currie, wurde von der University of Wisconsin-Madison, Office of the Vice Chancellor for Research and Graduate Education, mit Mitteln der Wisconsin Alumni Research Foundation unterstützt. National Institutes of Health Centers for Excellence for Translational Research (U19-AI109673-01). Reed M. Stubbendieck wurde von einem Ausbildungsstipendium der National Library of Medicine für das Computation and Informatics in Biology and Medicine Training Program (NLM 5T15LM007359) unterstützt. Die Geldgeber spielten keine Rolle bei der Studiengestaltung, Datenerhebung und -interpretation oder bei der Entscheidung, das Werk zur Veröffentlichung einzureichen.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1 μ L Einweg-Impfösen aus Polystyrol, blau | VWR | 12000-806 | |
| 10 μ L Einweg-Impfösen aus Polystyrol, gelb | VWR | 12000-810 | |
| 12-Well-Zellkulturplatte, steril mit Deckel | Greiner bio-one | 665 180 | |
| 14 mL Polystyrol-Rundbodenröhrchen, 17 x 100 mm 2style, nicht pyrogen, steril | Falcon | 352057 | |
| 2.0 selbststehende Schraubverschlussröhrchen mit Kappen, steril | USA scientific | 1420-9710 | |
| 25 mL serologische Pipette | Cell Treat | 229225B | |
| Agar, bakteriologisch | VWR | J637 | |
| Gehirn Herz Infusion Bouillon | Dot Scientific | DSB11000-5000 | |
| Polycarbonat Filament, weiß, 3 mm Durchmesser | Keene Village Plastics | 12.1-3MM-WH-581.2-1KG-R | |
| School Glue | Elmer's | EPIE304 | |
| Taz 6 3D-Drucker | Lulzbot |
Referenzen
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