Ein Protokoll wird vorgestellt, um zirkulierende Eierstocktumorzellen unter Verwendung eines maßgeschneiderten photoakustischen Strömungssystems und gezielter Folsäure-capped Kupfersulfid-Nanopartikel zu detektieren.
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Methodenartikel
Ovarialkrebs-Erkennung mit photoakustischer Durchflusszytometrie
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Viele Studien deuten darauf hin, dass die Aufzählung von zirkulierenden Tumorzellen (CTCs) als prognostisches Werkzeug für Eierstockkrebs vielversprechend sein könnte. Aktuelle Strategien für den Nachweis von CTCs umfassen Durchflusszytometrie, mikrofluidische Geräte und Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR). Trotz der jüngsten Fortschritte fehlt es den Methoden zur Erkennung von frühen Ovarialkarzinastasen noch immer an der Empfindlichkeit und Spezifität, die für die klinische Übersetzung erforderlich sind. Hier wird eine neuartige Methode zum Nachweis von zellaren zirkulierenden Tumorzellen durch photoakustische Durchflusszytometrie (PAFC) unter Verwendung eines benutzerdefinierten dreidimensionalen (3D) gedruckten Systems, einschließlich einer Durchflusskammer und Spritzenpumpe, vorgestellt. Diese Methode verwendet Folsäure-capped Kupfersulfid-Nanopartikel (FA-CuS NPs), um SKOV-3 Eierstockkrebszellen durch PAFC zu zielen. Diese Arbeit zeigt die Affinität dieser Kontrastmittel für Eierstockkrebszellen. Die Ergebnisse zeigen NP-Charakterisierung, PAFC-Detektion und NP-Aufnahme durch Fluoreszenzmikroskopie und zeigen damit das Potenzial dieses neuartigen Systems, Eierstock-CTCs in physiologisch relevanten Konzentrationen zu detektieren.
Einleitung
Eierstockkrebs ist eine der tödlichsten gynäkologischen Erkrankungen und führte 2018 weltweit zu schätzungsweise 184.800 Todesfällen1. Mehrere Studien haben die Korrelation zwischen der Progression von Eierstockkrebs (d. h. Metastasierung) und dem Vorhandensein von CTCs2,3,4gezeigt. Die gängigste Methode zur Detektion und Isolierung von CTCs nutzt das Cellsearch-System, das auf den EpCam-Rezeptor5abzielt. EpCam-Expression ist jedoch im epitheliale bis mesenchymalen Übergang, der in Krebsmetastasen verwickelt ist, downreguliert
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Protokoll
1. Nanopartikelsynthese und Funktionalisierung
ANMERKUNG: Die Synthese der FA-CuS NPs wird mit einer Ein-Topf-Synthesemethode erreicht, die an ein zuvor veröffentlichtes Protokoll21angepasst wurde.
VORSICHT: Die gesamte Synthese sollte in einer belüfteten chemischen Rauchhaube erfolgen.
- Vor der Synthese etwa 300 ml deionisiertes (DI) Wasser durch einen 0,2 m sterilen Filter filtern.
- Reinigen Sie einen 250 ml Glaskolben mit einer Waschmittellösung und spülen Sie ihn mit DI-Wasser ab. Fügen Sie 0,0134 g CuCl2 in 100 ml DI-Wasser hinzu, um eine 1 mM Lösung zu erstellen.
- 0,015 ....
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Ergebnisse
Abbildung 1A zeigt ein typisches TEM-Bild der synthetisierten Nanopartikel. Die durchschnittliche Größe des typischen Nanopartikels beträgt ca. 8,6 nm bei 2,5 nm. Die Nanopartikelmessung wurde in ImageJ durchgeführt. Schwellen- und Wassereinzugsgebietsfunktionen wurden angewendet, um die Partikel für die Messung zu trennen. Die horizontalen und vertikalen Durchmesser jedes Teilchens wurden senkrecht zueinander gemessen und weiter gemittelt. F.......
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Diskussion
Dieses Protokoll ist eine einfache Methode zur Erkennung von Eierstock-CTCs unter Verwendung von PAFC und einem gezielten CuS-Kontrastmittel. Viele Methoden wurden für den Nachweis von Eierstock-CTCs erforscht, einschließlich mikrofluidischer Geräte, RT-PCR und Fluoreszenz-Flow-Zytometrie23,24,25. Diese reichen von Komplexität, Kosten und Genauigkeit, wodurch ihre Wirksamkeit in klinischen Umgebungen eingeschränkt wird. PAFC bie.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Die Autoren würdigen Madeleine Howell für ihre Hilfe bei der Synthese, Matthew Chest für seine Hilfe bei der Entwicklung des Strömungssystems und Ethan Marschall für die Unterstützung bei SolidWorks.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,025 % Trypsin mit EDTA | Corning | 25-053-Cl | |
| 0,2 & Mikro; m 1.000 mL Vakuumfiltrationseinheit | VWR | 10040-440 | Zur Filtration größerer Mengen an VE-Wasser. |
| 0,2 &Mikro; m steriler Spritzenvorsatzfilter | VWR | 28145-477 | |
| 3D-gedruckter Tank | Maßgeschneiderte | ||
| Erfassungskarte | National Instruments | PXIe-5170R | 250 MS/s, 8-Kanal, 14-Bit |
| Alconox | Sigma-Aldrich | 242985-1.8KG | Reinigungsmittel für die Reinigung von Glaswaren. |
| Amicon Ultra-15 Zentrifugalfilter | Millipore | UFC903024 | |
| Amicon Ultra-4 Zentrifugalfilter | Millipore | UFC803024 | |
| Bright-Line Hämatozytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| Kupfer(II)-chlorid | ACROS ORGANICS | 206532500 | |
| Kupplungsobjektiv | Thorlabs | LMH-10x-532 | Zum Ankoppeln gepulstes Licht auf optische Fasern. |
| Koppeltisch | Newport | F-91-C1-T | Tisch zur Einkopplung von gepulstem Licht an das Objektiv. Geeignet für digitale Ultraschall-Reinigungsbäder der CPX-Serie FP-1A und LMH-10x-532 |
| NI LabVIEW 2017 (32 Bit) | LabVIEW zur Synchronisierung von Laserpulsen und Datenerfassung. | ||
| Datenverarbeitungssoftware | Mathworks | Matlab R2016a | Rekonstruktionen und Diagramme, die mit der Matlab-Software erstellt wurden. |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
| Faserfutter | Newport | FPH-DJ | Wird verwendet, um die blanke Faser zu halten. |
| Faserkoppler | Newport | FP-1A | 3-Achsen-Tisch zur Positionierung von Faserfutter und optischer Faser im Fokus des Objektivs. |
| Folsäure | Sigma-Aldrich | F7876-10G | |
| Formvar Beschichtete TEM-Gitter | Elektronenmikroskopie Wissenschaften | FCF300-CU-SB | |
| Masterflex Schlauch | Cole Parmer | EW-96420-14 | |
| McCoy's 5A Medium | ATCC | 30-2007 | |
| Norm-Ject 10 mL Spritzen | HENKE SASS WOLF | 4100-X00V0 | |
| Optische Faser | Thorlabs | FG550LEC | Wird verwendet, um Proben gepulstem Licht auszusetzen. |
| PBS | Alfa Aesar | J62036 | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Gepulster Laser | RPMC Lasers Inc | Quantus-Q1D-1053 | Gepulste Laserquelle mit Spezifikationen 1053 nm, 8 ns Puls, 10 Hz maximal. |
| Impulsgeber/Empfänger | Olympus | 5077PR | Empfängt, filtert und verstärkt photoakustische Signale. Betrieben mit 59 dB Gain. |
| Quarz-Kapillarrohr | Sutter Instrument | QF150-75-10 | |
| RPMI Midum 1640 (1x) Folsäurefrei | Gibco | 27016-021 | |
| Silikon | Momentive Performance Materials, Inc. | GE284 | |
| SKOV-3 Zellen | ATCC | HTB-77 | |
| Natriumbicarbonat | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Natriumcarbonat | Sigma-Aldrich | S7795-500G | |
| Natriumhydroxid-Kügelchen | BDH | BDH9292-500G | |
| Natriumsulfid-Nonahydrat | Sigma-Aldrich | 431648-50G | |
| Spritzenpumpen | New Era Pump Systems Inc | DUAL-1000 | |
| Texas Red-X-Succinimydl Ester | Invitrogen | 1949071 | |
| Wandler | Olynmpus | V214-BB-RM | Ultraschalldetektor mit einer Zentralfrequenz von 50 MHz und einer fraktionierten Bandbreite von -6 dB von 82%. |
| Trypanblau-Lösung 0,4% | Amresco | K940-100ML | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML | |
| Ultraschallgel | Parker Laboratories Inc. | Aquasonic 100 | Ultraschallgel zur Schallkopfkopplung |
Referenzen
- Ferlay, J., et al. Estimating the global cancer incidence and mortality in 2018: GLOBOCAN sources and methods. International Journal of Cancer. 144 (8), 1941-1953 (2019).
- Zhang, X., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
