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Methodenartikel

Biomechanische Prüfung von Murine tendons

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⸱

DOI:

10.3791/60280

⸱

15. Oktober 2019

 ,  ,  , 
1Department of Orthopedic Surgery, Columbia University, 2Department of Biomedical Engineering, Columbia University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das Protokoll beschreibt effiziente und reproduzierbare zahnfeste biomechanische Prüfverfahren für murine Sehnen durch die Verwendung von kundenspezifischen 3D-gedruckten Vorrichtungen.

Zusammenfassung

Sehnenerkrankungen sind häufig, betreffen Menschen jeden Alters und sind oft schwächend. Standardbehandlungen, wie entzündungshemmende Medikamente, Rehabilitation und chirurgische Reparatur, scheitern oft. Um die Sehnenfunktion zu definieren und die Wirksamkeit neuer Behandlungen nachzuweisen, müssen die mechanischen Eigenschaften von Sehnen aus Tiermodellen genau bestimmt werden. Murine Tiermodelle sind heute weit verbreitet, um Sehnenerkrankungen zu studieren und neuartige Behandlungen für Tendinopathien zu bewerten; Die Bestimmung der mechanischen Eigenschaften von Maussehnen war jedoch eine Herausforderung. In dieser Studie wurde ein neues System für die mechanische Nehneprüfung entwickelt, das 3D-gedruckte Vorrichtungen enthält, die genau mit den Anatomien des Humerus und calcaneus übereinstimmen, um supraspinatus Sehnen bzw. Achillessehnen mechanisch zu testen. Diese Vorrichtungen wurden mit 3D-Rekonstruktionen der nativen Knochenanatomie, Feststoffmodellierung und additiver Fertigung entwickelt. Der neue Ansatz eliminierte artefaktische Greiffehler (z. B. Versagen am Ausfall der Wachstumsplatte anstelle der Sehne), verringerte die Gesamttestzeit und erhöhte Reproduzierbarkeit. Darüber hinaus ist diese neue Methode leicht anpassbar, um andere murine Sehnen und Sehnen von anderen Tieren zu testen.

Einleitung

Sehnenerkrankungen sind häufig und weit verbreitet unter den alternden, athletischen und aktiven Populationen1,2,3. In den Vereinigten Staaten werden jährlich 16,4 Millionen Bindegewebsverletzungen gemeldet4 und machen 30 % aller verletzungsbedingten Arztbesuche3,5,6,7, 8. Die am häufigsten betroffenen Stellen sind die Rotatormanschette, Achillessehne und Patellasehne9. Obwohl eine Vielzahl von nicht-operativen und operativen Behandlungen erforscht wurden, einschließlich entzündungshemmender Medikamente, Rehabilitation und chirurgische Reparatur, die Ergebnisse bleiben schlecht, mit begrenzter Rückkehr zur Funktion und hohe Ausfallraten5, 6. Diese schlechten klinischen Ergebnisse haben grundlegende und translationale Studien motiviert, die darauf abzielen, die Teninopathie zu verstehen und neue Behandlungsansätze zu entwickeln.

Zug-biomechanische Eigenschaften sind die primären quantitativen Ergebnisse, die die Sehnenfunktion definieren. Daher muss die Laborcharakterisierung der Tendinopathie und die Wirksamkeit der Behandlung eine strenge Prüfung der Sehnenzugeigenschaften umfassen. Zahlreiche Studien haben Methoden beschrieben, um die biomechanischen Eigenschaften von Sehnen von Tiermodellen wie Ratten, Schafe, Hunde und Kaninchen10,11,12zu bestimmen. Jedoch, wenige Studien haben die biomechanischen Eigenschaften der murinen Sehnen getestet, vor allem aufgrund der Schwierigkeiten beim Greifen der kleinen Gewebe für Zugtests. Da murine Modelle zahlreiche Vorteile für die mechanistische Untersuchung der Tendinopathie haben, einschließlich genetischer Manipulation, umfangreiche Reagenzoptionen und kostengünstiger Kosten, ist die Entwicklung präziser und effizienter Methoden zur biomechanischen Prüfung von murinen Geweben erforderlich.

Um die mechanischen Eigenschaften von Sehnen richtig zu testen, muss das Gewebe effektiv gegriffen werden, ohne zu rutschen oder Artefakt an der Griffschnittstelle zu reißen oder die Wachstumsplatte zu zerbrechen. In vielen Fällen, insbesondere bei kurzen Sehnen, wird der Knochen an einem Ende und die Sehne am anderen Ende gegriffen. Knochen werden in der Regel durch Einbettung in Materialien wie Epoxidharz13 und Polymethylmethacrylat14,15gesichert. Sehnen werden oft zwischen zwei Schichten Schleifpapier platziert, mit Cyanoacrylat geklebt und mit Kompressionsklemmen gesichert (wenn der Querschnitt flach ist) oder in einem gefrorenen Medium (wenn der Querschnitt groß ist)15,16,17 . Diese Methoden wurden auf biomechanisch getestetmurine Sehnen angewendet, aber Herausforderungen entstehen aufgrund der geringen Größe der Proben und der Übereinstimmung der Wachstumsplatte, die nie ossifies18. Zum Beispiel beträgt der Durchmesser des murinen Humeralkopfes nur wenige Millimeter, was das Greifen des Knochens erschwert. Insbesondere führt die Zugprüfung von murinen supraspinatus Sehnen-Knochen-Proben oft zu einem Versagen an der Wachstumsplatte und nicht an der Sehne oder an der Sehnenenenthese. Ebenso ist die biomechanische Prüfung der Achillessehne eine Herausforderung. Obwohl die Achillessehne größer ist als andere murine Sehnen, ist der Calcaneus klein, was das Greifen dieses Knochens erschwert. Der Knochen kann entfernt werden, gefolgt von Greifer der beiden Sehnenenden; Dies schließt jedoch die Prüfung der Sehnen-Knochen-Befestigung aus. Andere Gruppen berichten, dass der Kalkknochen mit maßgefertigten Vorrichtungen19,20, Verankerung durch Klemmen21, Fixierung in selbsthärtenden Kunststoffzement22 oder mit einem konischen Formschlitz22, aber diese Frühere Methoden bleiben durch geringe Reproduzierbarkeit, hohe Greiffehlerraten und mühsame Vorbereitungsanforderungen begrenzt.

Ziel der aktuellen Studie war es, eine genaue und effiziente Methode zur zugfesten biomechanischen Prüfung von murinen Sehnen zu entwickeln, wobei der Schwerpunkt auf den Supraspinatus- und Achillessehnen als Beispiel lag. Mit einer Kombination aus 3D-Rekonstruktionen aus nativer Knochenanatomie, Solid-Modellierung und additiver Fertigung wurde eine neuartige Methode entwickelt, um die Knochen zu greifen. Diese Vorrichtungen sicherten effektiv die Knochen, verhinderten Wachstumsplattenversagen, verkürzten die Probenvorbereitungszeit und erhöhten die Reproduzierbarkeit der Tests. Die neue Methode ist leicht anpassbar, um andere murine Sehnen sowie Sehnen bei Ratten und anderen Tieren zu testen.

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Protokoll

Tierstudien wurden vom Columbia University Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt. Mäuse, die in dieser Studie verwendet wurden, hatten einen C57BL/6J-Hintergrund und wurden vom Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) gekauft. Sie wurden unter pathogenfreien Barrierebedingungen untergebracht und mit Nahrung und Wasser ad libitum versorgt.

1. Entwicklung von kundenspezifischen 3D-gedruckten Vorrichtungen zum Greifen von Knochen

  1. Knochenbildaufnahme und 3D-Knochenmodellbau
    1. Sezieren Sie den Knochen von Interesse in Vorbereitung für 3D-Modellerstellung und 3D-Knochen-Griff-Druck; Humerus und Calcaneus werden als Beispiele im aktuellen Protokoll verwendet.
      HINWEIS: Detaillierte Anweisungen zur Sezieren von Knochen-Tendon-Muskelproben für mechanische Tests sind in Schritt 2.1.1 vorgesehen. Die folgenden Schritte sollten befolgt werden, um Knochen zu isolieren, um 3D-gedruckte Knochengriffe zu erstellen.
      1. Zerlegung des Humerus: Euthanisieren Sie eine Maus nach IACUC-zugelassenem Verfahren. Entfernen Sie die Haut der oberen Extremität, entfernen Sie alle Muskeln über dem Humerus, disartikulieren Sie den Ellenbogen und die Glenohumeralgelenke und entfernen Sie sorgfältig alle am Humerus befestigten Bindegewebe.
      2. Zerlegung des Calcaneus: Euthanisieren sie eine Maus nach IACUC-zugelassenem Verfahren. Entfernen Sie die Haut der unteren Extremität, entfernen Sie das Achillessehnen-Calcaneus-Gelenk und die Gelenke zwischen Calcaneus und anderen Fußknochen und entfernen Sie sorgfältig alle Amkandgewebe, die am Calcaneus befestigt sind.
    2. Führen Sie einen mikroberechneten Tomographie-Scan des gesamten Knochens durch, z. B. scannen Sie die Humerus- und Calcaneus-Proben.
      HINWEIS: Je nach verwendetem Scanner sind die Einstellungen unterschiedlich. Für den in der aktuellen Studie verwendeten Scanner (Materialtabelle) sind die empfohlenen Einstellungen: Scan bei einer Energie von 55 kVP, Al 0,25 Filter, mit einer Auflösung von 6 m.
      1. Agarosepulver in Reinstwasser und Mikrowelle 1-3 min mischen, bis die Agarose vollständig gelöst ist. Es ist hilfreich, Mikrowelle für 30-45 s, anhalten und wirbeln, und dann weiter in Richtung eines Kochens. Füllen Sie Kryoröhren bis zu drei Viertel voll mit Agarose. Lassen Sie die Agarose ca. 5-10 min abkühlen.
      2. Fügen Sie Knochen in das Agarose-Gel ein (dies verhindert Bewegungsartefakte während des Scannens). Legen Sie ein Kryotube mit Knochen in den Scanner ein.
        HINWEIS: Für den in der aktuellen Studie verwendeten Scanner wurde für alle Scans ein automatischer 16-Positionen-Probenwechsler verwendet. Dieser Scanner kann die Vergrößerung automatisch entsprechend der Größe und Form einer Stichprobe auswählen.
    3. Rekonstruieren Sie mikrocomputerische Tomographie-Scan-Projektionsbilder in Querschnittsbilder. Verwenden Sie empfohlene Parameter für die Scanner-Software-Kombination des Experimentierers.
      HINWEIS: Für das in der aktuellen Studie verwendete Programm (Materialtabelle) wird empfohlen, die folgenden Rekonstruktionsparameter zu verwenden: Glättung: 0-2, Strahlhärtekorrektur: 45, Ring artefaktreduktion: 4-9 und Scheiben in 16-Bit TIFF zu rekonstruieren format.
    4. Erstellen Sie ein 3D-Modell und speichern Sie es in einem Standard-STL-Format, das mit den meisten 3D-Druckern und Rapid Prototyping kompatibel ist. Führen Sie für das in der aktuellen Studie verwendete Programm (Tabelle der Materialien)folgendes aus:
      1. Wählen Sie den Befehl Datei > Öffnen, um das Datei-Dataset zu öffnen. Öffnen Sie das Dialogfeld Datei > Einstellungen, und wählen Sie die Registerkarte Erweitert aus.
      2. Verwenden Sie den adaptiven Renderingalgorithmus, um die 3D-Modelle zu erstellen. Dieser Algorithmus minimiert die Anzahl der Facettendreiecke und sorgt für glattere Oberflächendetails. Verwenden Sie 10 als Lokalitätsparameter; Dieser Parameter definiert den Abstand in Pixel nxen zum benachbarten Punkt, der zum Suchen des Objektrahmens verwendet wird. Minimieren Sie die Toleranz auf 0,1, um die Dateigröße zu verringern.
        HINWEIS: Nach dem Öffnen des Datasets werden die Bilder auf der Seite "Rohbilder" angezeigt.
      3. Um das Volumen von Interesse (VOI) anzugeben, wählen Sie manuell zwei Bilder aus, die als Ober- und Unterseite des ausgewählten VOI-Bereichs festgelegt werden sollen.
      4. Wechseln zur zweiten Seite, Region of Interest. Wählen Sie den Interessenbereich manuell auf einem einzelnen Querschnittsbild aus.
        HINWEIS: Der ausgewählte Bereich wird rot hervorgehoben (d. h. der Humerusquerschnitt).
      5. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt alle 10–15 Querschnittsbilder.
      6. Wechseln Zur dritten Seite Binäre Auswahl. Klicken Sie im Histogrammmenü auf Von Dataset. Die Histogrammverteilung der Helligkeit aus allen Bildern des Datasets wird angezeigt. Klicken Sie auch im Histogrammmenü auf das Menü 3D-Modelldatei erstellen.
    5. Speichern Sie ein 3D-Modell des Bones im STL-Dateiformat.
    6. Verfeinern Sie das Netz: Bearbeiten Sie das Netz, um die Größe der STL-Datei zu reduzieren und sie mit jedem computergestützten Designprogramm kompatibel zu machen. Führen Sie für das in der aktuellen Studie verwendete Programm (Tabelle der Materialien) die folgenden Schritte aus:
      1. Importieren Sie das Netz, und wählen Sie alle zum Bearbeiten aus. Wählen Sie Aus dem Toolset Bearbeitenreduzieren aus. Wählen Sie dann Triangle Budget aus dem Toolset Ziel reduzieren aus. Reduzieren Sie die Tri-Anzahl und akzeptieren Sie Änderungen. Speichern Sie die neu reduzierte Datei im STL-Format, indem Sie Exportieren als...
  2. Design von kundenspezifischen Knochenbefestigungen
    1. Supraspinatus Sehnen-Humeralknochen
      1. Verwenden Sie ein solides Modellierungsprogramm mit computergestütztem Design, um ein maßgeschneidertes Modell für Humerusgreifvorrichtungen zu erstellen(Abbildung 1, Ergänzende Dateien).
        HINWEIS: Das in der aktuellen Studie verwendete Programm ist in der Tabelle der Materialienaufgeführt.
      2. Öffnen Sie die STL-Formatdatei des Humerusknochens in einem soliden Modellierungsprogramm, und speichern Sie sie als Teiledatei.
        HINWEIS: Für die in der aktuellen Studie verwendete Software (Materialtabelle) wurde das 3D-Knochenobjekt im SLDPRT-Format gespeichert.
      3. Öffnen Sie die Bauteildatei, und erstellen Sie manuell drei anatomisch relevante Ebenen (d. h. sagittal, koronal, quer).
        1. Definieren Sie manuell die sagittale Ebene, um die supraspinatus Sehnenbefestigung bei der größeren Tuberosität zu durchschneiden. Stellen Sie sicher, dass der 3D-Block die sagittale Ebene als Symmetrieebene enthält. Um dies zu erreichen, fügen Sie bei Bedarf Material aus dem Block hinzu oder schneiden Sie es aus.
          HINWEIS: Diese Symmetrieebene stellt sicher, dass sich beim Einsetzen der Probe in die Vorrichtungen die Sehnen- und Sehnenbefestigung in der Mittelachse der Vorrichtung befindet.
      4. Messen Sie die Abmessungen des Knochens entlang jeder der drei Ebenen (z. B. Höhe, Breite, Länge).
      5. Messen Sie die Abmessungen der mechanischen Prüfgriffe, an denen die 3D-gedruckte Vorrichtung befestigt wird.
      6. Beginnen Sie mit dem Entwerfen eines festen Blockteils (z. B. eines Volumenzylinders).
        1. Stellen Sie sicher, dass jede Dimension des Blocks mindestens 5 mm größer ist als die Abmessungen des Humerus.
        2. Berücksichtigen Sie Konstruktionseinschränkungen aus mechanischen Prüfgriffen (d.h. stellen Sie sicher, dass die 3D-gedruckte Vorrichtung in den mechanischen Prüfgriffen frei montiert und demontiert werden kann).
      7. Erstellen Sie ein Baugruppenmodell mit zwei Komponenten: dem Volumenkörperblock und dem rechten oder linken Humerusknochen. Definieren Sie die Ausrichtung des Knochens innerhalb des Blocks (d. h. den Winkel zwischen Sehne und Knochen). Stellen Sie sicher, dass das gesamte Knochenvolumen in den Block passt.
      8. Erstellen Sie einen Hohlraum im Block mit dem Humerusknochen als Schimmel. Wenn Sie die in der Tabelle der Materialienangegebene Software verwenden, führen Sie die folgenden Schritte aus:
        1. Legen Sie das Konstruktionsteil (Humerus) und den Formboden (Zylinderblock) in eine Zwischenbaugruppe ein. Wählen Sie im Baugruppenfenster den Block aus, und klicken Sie auf der Symbolleiste Baugruppe auf Komponente bearbeiten.
        2. Klicken Sie auf Einfügen > Features > Kavität. Wählen Sie Uniform Scaling aus, und geben Sie 0 % als Wert ein, der in alle Richtungen skaliert werden soll.
      9. Unterdrücken Sie das Bone-Teil, und speichern Sie die Baugruppe als Teil.
      10. Offener Teil (Zylinder mit Hohlraum). Schneiden Sie das Teil entlang der sagittalen Ebene, um zwei symmetrische Komponenten zu erstellen, die anterior und nachträbig in den Knochen passen (z. B. zwei halbe Zylinder, wie in Abbildung 1dargestellt).
        HINWEIS: Zwei Komponenten sind so konzipiert, dass sie anterior und nachträbe in den Knochen passen. Die vordere Komponente enthält einen halb kugelförmigen Hohlraum, der von der vorderen Seite des Humeralkopfes bis zur supraspinatus Sehnenbefestigung verlängert wird. Die hintere Komponente Hohlraum ist wie der hintere Teil des Humerus geformt (d. h. hintere Seite des Humeralkopfes, Delta-Tuberosität, und mediale und laterale Epicondyle).
      11. Speichern Sie jede Komponente als separates Dateiteil.
      12. Stellen Sie für die vordere Komponente sicher, dass der Humeralkopf in den Hohlraum des Teils eingebettet ist, indem Sie geeignete Toleranzen definieren.
        ANMERKUNG: In der aktuellen Studie wird vorgeschlagen, die folgenden Schritte auszuführen:
        1. Erstellen Sie einen gedrehten Schnitt, um die Netzgeometrie des Hohlraums zu glätten. Erstellen Sie eine Skizze für den Schnitt, indem Sie die Hohlraumgeometrie emulieren und einen Positionsabstand hinzufügen.
          HINWEIS: Der Abstand ermöglicht eine freie Montage und Demontage zwischen dem Knochen und der vorderen Komponente.
      13. Ändern Sie die hintere Komponente, um die Hohlraumgeometrie zu imitieren, um einen Schnitt zu erstellen, der frei wird, wie oben für die vordere Komponente beschrieben.
      14. Machen Sie einen Schnitt in der Querebene von der Oberseite der hinteren Komponente bis zum Kamm des größeren/kleineren Tuberkels.
        HINWEIS: Wie in Abbildung 1 und Abbildung 2zu sehen, enthält die hintere Komponente einen Schnitt, der eine Öffnung am Sehnenaufsatz erzeugt.
      15. Erstellen Sie eine enge Passform zwischen den beiden Komponenten, um eine freie Montage und Demontage zu ermöglichen.
        HINWEIS: In der aktuellen Studie wurde für die Vorrichtungen eine Lochwellenpassung mit einem lockeren Laufabstand erstellt.
      16. Erstellen Sie 3D-Spiegelmodelle für jede Komponente der Halterung für die gegenüberliegende Extremität (d. h. links oder rechts).
      17. Fügen Sie eine Ätze auf der Unterseite der Vorrichtungen hinzu, um zwischen der linken und rechten Seite zu unterscheiden.
      18. Speichern Sie alle Befestigungsteile im STL-Standarddateiformat zur Vorbereitung auf den 3D-Druck.
    2. Achillessehnen-Calcaneus-Knochen
      1. Befolgen Sie die oben beschriebenen Schritte für supraspinatus-humerale Kopfbefestigung.
        HINWEIS: Für die Achilleskalkung ist nur ein Satz von Vorrichtungen erforderlich, da die Anatomie der linken und rechten Calcaneus-Knochen nahezu symmetrisch ist.

2. Biomechanische Prüfung von murinen Sehnen

  1. Probenvorbereitung und Querschnittsflächenmessung
    1. Sezieren Sie den Muskel-Tendon-Knochen von Interesse in vorbereitung für Zugmechanische Tests. In der aktuellen Studie wurden supraspinatus muscle - tendon - humerus bone specimens (N=10, 5 male, 5 female) und gastrocnemius muscle - Achilles sehnenkalcaneus Knochenproben (N=12, 6 männlich, 6 weiblich) von 8 Wochen alten C57BL/6J Mäusen isoliert.
      1. Zerlegung des supraspinatus Muskels - Sehne - HumerusKnochen Probe
        1. Euthanisieren Sie eine Maus pro IACUC-zugelassenem Verfahren. Positionieren Sie die Maus in einer anfälligen Position. Machen Sie einen Schnitt in der Haut von oberhalb des Ellenbogens der Vorderpfote in Richtung Schulter.
        2. Entfernen Sie vorsichtig die Haut mit stumpfer Sezierung, so dass die Muskulatur der Schulter sichtbar ist. Entfernen Sie das Gewebe, das den Humerus umgibt, bis der Knochen freigelegt ist und mit Zangen sicher gehalten werden kann.
        3. Halten Sie den Humerus mit Derpalle und entfernen Sie vorsichtig die Deltoid- und Trapezmuskeln, um den korakokomromialen Bogen freizulegen. Identifizieren Sie das akromioklavikuläre Gelenk und trennen Sie das Schlüsselbein vorsichtig mit einer Skalpellklinge vom Akromion.
        4. Achten Sie darauf, die supraspinatus Sehne und ihre knöcherne Befestigung nicht zu beschädigen, entfernen Sie den Muskel aus seiner skapitulären Befestigung mit einem Skalpellklinge. Achten Sie darauf, die supraspinatus Sehne und ihre knöcherne Befestigung nicht zu beschädigen, lösen Sie den Humeralkopf vom Glenoid; mit einer Skalpellklinge die Gelenkkapsel und den Infraspinatus, subscapularis und teres kleinere Sehnen schnüren.
        5. Disarticulate das Ellenbogengelenk, um den Humerus von der Ulna und Radius zu trennen. Isolieren Sie den Humerus - supraspinatus Sehne - Muskelprobe und reinigen Sie überschüssige Sweichgewebe auf dem Humerus und Humeralkopf.
      2. Zerlegung der Achillessehne - Calcaneus Knochenprobe
        1. Euthanisieren Sie eine Maus pro IACUC-zugelassenem Verfahren. Positionieren Sie die Maus in einer anfälligen Position. Achten Sie darauf, die Achillessehne und ihre knöcherne Anhaftung nicht zu beschädigen, entfernen Sie die Haut mit stumpfer Sektion, so dass die Muskulatur um die Knöchel- und Kniegelenke freigelegt wird.
        2. Mit einem Skalpellklinge, beginnend an der Achillessehne - Calcaneus-Anhaftung, lösen Sie den Magen-Darm-Muskel vorsichtig von seinen proximalen Anhaftungen.
        3. Die Calcaneus werden vorsichtig von den verschiedenen angrenzenden Knochen entfernt. Isolieren Sie die Achillessehne - Calcaneus Probe und reinigen Sie überschüssiges Weichgewebe.
    2. Bestimmen Sie den Querschnittsbereich der Sehne mittels Mikrotomographie.
      HINWEIS: Für den scanner, der in der aktuellen Studie (Tabelle der Materialien) verwendet wird, sind die empfohlenen Einstellungen: Scan bei einer Energie von 55 kVP, Al 0.25 Filter, mit einer Auflösung von 5 'm.
      1. Agarosepulver in Reinstwasser und Mikrowelle 1-3 min mischen, bis die Agarose vollständig gelöst ist. Es ist hilfreich, Mikrowelle für 30-45 s, anhalten und wirbeln, und dann weiter in Richtung eines Kochens. Füllen Sie Kryoröhren bis zu drei Viertel voll mit Agarose. Lassen Sie die Agarose ca. 5-10 min abkühlen.
      2. Setzen Sie die Probe im Kryotube auf, indem Sie den Knochen auf den Kopf stellen.
        HINWEIS: Nur der Knochen sollte sich im Agarose-Gel begeben. Die Sehne und der Muskel sollten außen suspendiert werden.
    3. Nach dem Scan, entfernen Sie vorsichtig Muskel von der Sehne mit Skalpellklinge. Setzen Sie die Probe in die 3D-gedruckte Leuchte ein.
      HINWEIS: Die Griffe sind für jeden Test wiederverwendbar. Verwenden Sie keinen Kleber oder Epoxid in der Vorrichtung; der Knochen wird in einer Presseform gehalten.
    4. Setzen und kleben Sie die Sehne zwischen einem gefalteten dünnen Tissuepapier (2 cm x 1 cm) und klemmen Sie das Konstrukt mit dünnen Foliengriffen. Befestigen Sie die 3D-gedruckte Halterung mit dem Muster in die Prüfgriffe.
    5. Setzen Sie die Probe und die Griffe in ein Prüfbad mit Phosphatgepufferter Saline (PBS) bei 37 °C (d. h. Mauskörpertemperatur23) ein.
  2. Zugprüfung
    1. Führen Sie eine zugmechanische Prüfung an einem Materialprüfrahmen durch.
      ANMERKUNG: Für den in der aktuellen Studie verwendeten Testrahmen (Tabelle der Werkstoffe) ist das empfohlene Protokoll:
      1. Definieren Sie die Spurweite als Abstand von der Sehnenbefestigung zum oberen Griff.
      2. Voraussetzung mit 5 Zyklen zwischen 0,05 N und 0,2 N.
      3. Halten Sie für 120 s.
      4. Verwenden Sie eine Spannung bis zum Ausfall von 0,2%/s.
    2. Sammeln Sie Lastverformungsdaten.
    3. Berechnen Sie die Dehnung als Verschiebung relativ zur Anfangsspurlänge der Sehne.
    4. Berechnen Sie die Spannung als Kraft geteilt durch den anfänglichen Sehnenquerschnitt (gemessen von microCT).
    5. Wenn Sie an viskoelastischem Verhalten interessiert sind, führen Sie eine Spannungsentspannung vor dem Spannungstest durch, um einen Fehler zu verursachen, und verwenden Sie die Daten, um Parameter wie A, B, C, Tau1 und tau2 aus dem quasilinearen viskoelastischen Modell24zu berechnen.
    6. Berechnen Sie aus der Lastverformungskurve die Steifigkeit (Neigung des linearen Teils der Kurve), die maximale Kraft und die zu erlegende Arbeit (die Fläche unter der Kurve bis zur Streckgrenze).
      1. Identifizieren Sie den linearen Teil, indem Sie ein Fenster mit Punkten in der Last-Verformungskurve auswählen, das denR2-Wert für eine lineare Regression mit den kleinsten Quadraten25maximiert.
      2. Bestimmen Sie die Steifigkeit als Steigung des linearen Teils der Lastverschiebungskurve25,26.
    7. Berechnen Sie aus der Spannungsdehnungskurve den Modul (Neigung des linearen Teils der Kurve), die Festigkeit (maximale Spannung) und die Widerstandsfähigkeit (Bereich unter der Kurve bis zur Streckgrenze).
      ANMERKUNG: Mit dem RANSAC-Algorithmus wird der Ertragsstamm (x-Wert) als erster Punkt definiert, an dem die y-Anpassung mehr als 0,5 % des erwarteten Spannungswerts (y-Wert) abgewichen ist. Die Ertragsspannung ist der entsprechende y-Wert der Ertragsspannung.
      HINWEIS: Zusätzlich zu der in der aktuellen Studie beschriebenen monotonen Zugbelastung bis zum Ausfall kann die zyklische Belastung wichtige Informationen über Sehnenermüdung und/oder viskoelastische Eigenschaften liefern. Zum Beispiel berichteten Freedman et al. Über Ermüdungserscheinungen der murinen Achillessehnen27.
    8. Führen Sie nach Abschluss der Zugprüfung einen mikroberechneten Tomographie-Scan des gesamten Knochens durch, z. B. scannen Sie die Humerus- und Calcaneus-Proben.
      HINWEIS: Für den scanner, der in der aktuellen Studie (Tabelle der Materialien) verwendet wird, sind die empfohlenen Einstellungen: Scan bei einer Energie von 55 kVP, Al 0.25 Filter, mit einer Auflösung von 6 'm.
      1. Wiederholen Sie die Schritte 1.1.2.1–1.1.2.2.
    9. Wiederholen Sie Schritt 1.1.3.
    10. Verwenden Sie ein 3D-Visualisierungsprogramm, das mit dem Scanner kompatibel ist, um ein volumengerendertes 3D-Modell des gescannten Objekts zu erstellen.
      HINWEIS: Das in der aktuellen Studie verwendete Programm ist in der Tabelle der Materialienaufgeführt.
    11. Bestimmen Sie den Fehlermodus und den Fehlerstellenbereich, indem Sie das 3D-Objekt überprüfen.
  3. Statistische Auswertung: Zeigen Sie alle Stichprobenergebnisse als Mittelwert an, Standardabweichung (SD). Vergleichen Sie Gruppen mit T-Tests von Schülern (zweischwänzige und ungepaarte). Signifikanz als p < 0,05 festlegen.
    HINWEIS: Die in der aktuellen Studie verwendete statistische Software ist in der Tabelle der Materialienaufgeführt.

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Ergebnisse

3D-gedruckte Vorrichtungen wurden verwendet, um 8 Wochen alte murine supraspinatus und Achillessehnen zu testen. Alle mechanisch getesteten Proben scheiterten an der Enthese, die durch MikroCT-Scans, visuelle Inspektion und Videoanalyse nach Zugversuchen gekennzeichnet ist. Abbildung 3zeigt einen 1:1-Vergleich der bisherigen und aktuellen Methoden zur supraspinatus-Sehnenprüfung in unserem Labor . Bei der vorherigen Methode28,29...

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Diskussion

Murine Tiermodelle werden häufig verwendet, um Sehnenstörungen zu studieren, aber die Charakterisierung ihrer mechanischen Eigenschaften ist eine Herausforderung und in der Literatur ungewöhnlich. Der Zweck dieses Protokolls ist es, eine zeiteffiziente und reproduzierbare Methode zur Zugprüfung von murinen Sehnen zu beschreiben. Die neuen Methoden reduzierten die Zeit, die zum Testen einer Probe erforderlich war, von Stunden auf Minuten und eliminierten ein wichtiges Greifartefakt, das in früheren Methoden ein häufiges P...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Die Studie wurde vom NIH / NIAMS (R01 AR055580, R01 AR057836) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AgaroseFisher ScientificBP160-100Dissovle 1g in 100 ml Reinstwasser zur Herstellung von 1% Agarose 
Bruker microCT Bruker BioSpin CorpSkyscan 1272 Von Autoren verwendet
ElectroForce TA Instruments3200Prüfplattform
Ethanol 200 ProofFisher ScientificA409470% verdünnen und wie im Protokoll empfohlen
verwenden Halterung zum Anbringen von GriffenSonderanfertigungVerwendet von den Autoren
KimwipesKimberly-Clark  S-8115Wie im Protokoll
vorgeschlagen MicroCT CT-Analyser (Ctan)Bruker BioSpin CorpWird von Autoren zur Visualisierung und Analyse von Mikro-CT-Scans verwendet 
MilliQ Wasser (Reinstwasser)Millipore SigmaQGARD00R1 (oder verwandter Reiniger)100 ml 
MeshmixerAutodeskKostenlose Engineering-Software, die von Autoren zur Verfeinerung des Netzes verwendet
Objet EDEN 260VS Stratasys LTDPrecision Prototyping
Objet StudioStratasys LTDWird von Autoren mit dem 3D-Drucker
PBS - Phosphatgepufferte KochsalzlösungThermoFisher Scientific100100312,5 l von 10% PBS verwendet;
S& T ForcepsFine Science Tools00108-11Von Autoren verwendet
Skalpellklinge - #11Fine Science Tools10011-00Von Autoren verwendet
Scalpel Handle - #3Fine Science Tools10003-12Von Autoren verwendet SkyScan
1272Bruker BioSpin CorpWird von Autoren zur Visualisierung und Analyse von Mikro-CT-Scans verwendet 
Skyscan CT-VoxBruker BioSpin CorpWird von Autoren zur Visualisierung und Analyse von Mikro-CT-Scans verwendet 
SkyScan NReconBruker BioSpin CorpWird von Autoren zur Visualisierung und Analyse von Mikro-CT-Scans verwendet 
SolidWorks CADDassault Systè mesSolidWorks Research SubsriptionFestkörpermodellierung computergestützte Konstruktion, die von Autoren verwendet wird
SuperGlueLoctite234790Wie im Protokoll vorgeschlagen
PrüfbadSonderanfertigungVon Autoren verwendet
Dünnschichtgriffe SonderanfertigungVerwendet von Autoren
VeroWhitePlusStratasys LTD NA3D-Druckmaterial verwendet von Autoren
WinTest WinTest-SoftwareWird von Autoren verwendet, um Daten zu sammeln
Auf http://www.meshmixer.com/ wird

Referenzen

  1. Girish, N., Ramachandra, K., Arun, G. M., Asha, K. Prevalence of Musculoskeletal Disorders Among Cashew Factory Workers. Archives of Environmental & Occupational Health. 67, 37-42 (2012).
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