In Vivo Optische Calcium-Bildgebung der lerninduzierten synaptischen Plastizität bei Drosophila melanogaster

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, mit dem vor- und/oder postsynaptisches Kalzium im Kontext des Drosophila-Lernens und -Gedächtnisses visualisiert werden kann. In vivo Kalzium-Bildgebung mit synaptisch lokalisierten Kalziumsensoren wird mit einem klassischen olfaktorischen Konditionierungsparadigma kombiniert, so dass die synaptische Plastizität, die dieser Art des assoziativen Lernens zugrunde liegt, bestimmt werden kann.

Zusammenfassung

Jahrzehntelange Forschung in vielen Modellorganismen hat zu dem aktuellen Konzept der synaptischen Plastizität geführt, die dem Lernen und der Gedächtnisbildung zugrunde liegt. Lerninduzierte Veränderungen in der synaptischen Übertragung sind oft auf viele Neuronen und Ebenen der Verarbeitung im Gehirn verteilt. Daher sind Methoden zur Visualisierung lernabhängiger synaptischer Plastizität über Neuronen hinweg erforderlich. Die Fruchtfliege Drosophila melanogaster stellt einen besonders günstigen Modellorganismus dar, um neuronale Schaltkreise zu untersuchen, die dem Lernen zugrunde liegen. Das hier vorgestellte Protokoll zeigt, wie die Prozesse, die der Bildung assoziativer olfaktorischer Erinnerungen zugrunde liegen, d.h. synaptische Aktivität und deren Veränderungen, in vivo überwacht werden können. Mit hilfe der breiten Palette genetischer Werkzeuge, die in Drosophilaverfügbar sind, ist es möglich, genetisch kodierte Kalziumindikatoren in bestimmten Zellpopulationen und sogar Einzelzellen gezielt auszudrücken. Durch die Fixierung einer Fliege an Ort und Stelle und das Öffnen der Kopfkapsel ist es möglich, die Kalziumdynamik in diesen Zellen zu visualisieren und gleichzeitig olfaktorische Reize zu liefern. Zusätzlich zeigen wir eine Einrichtung, bei der die Fliege gleichzeitig elektrischen Stößen auf den Körper ausgesetzt werden kann. Dies bietet ein System, in dem Fliegen klassische olfaktorische Konditionierung enden können - wobei ein zuvor naiver Geruch gelernt wird, mit Elektroschock-Strafe in Verbindung gebracht zu werden - zur gleichen Zeit wie die Darstellung dieses Geruchs (und anderer ungeübter Gerüche) im Gehirn mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie beobachtet. Unser Labor hat bereits über die Erzeugung synaptisch lokalisierter Kalziumsensoren berichtet, die es ermöglichen, die fluoreszierenden Calciumsignale auf prä- oder postsynaptische Kompartimente zu beschränken. Die Zwei-Photonen-Mikroskopie bietet eine Möglichkeit, feine Strukturen räumlich aufzulösen. Wir veranschaulichen dies, indem wir uns auf Neuronen konzentrieren, die Informationen aus dem Pilzkörper integrieren, einem Zentrum höherer Ordnung des Insektenhirns. Insgesamt bietet dieses Protokoll eine Methode, um die synaptischen Verbindungen zwischen Neuronen zu untersuchen, deren Aktivität als Ergebnis des olfaktorischen Lernens moduliert wird.

Einleitung

Die Entschlüsselung, wo und wie die Informationen durch Lernen im Gehirn erfasst und anschließend als Gedächtnis gespeichert werden, stellt eine der schwierigsten Aufgaben in der Neurowissenschaft¹dar. Neurowissenschaftliche Forschung hat zum Konzept einer Veränderung der synaptischen Übertragung als neuronales Substrat geführt, das dem Lernen und der Gedächtnisbildung zugrunde liegt^2,3. Es wird vermutet, dass während des Lernens synaptische Verbindungen zwischen neuronalen Ensembles, die während der Wahrnehmung eines Stimulus aktiv sind, so verändert werden, dass ihr kombiniertes Aktivitätsmuster während des Gedächtnisabrufs abgerufen werden kann, wodurch zukünftige Verhaltensaktion⁴. Diese "Engrammzellen" und ihre Synapsen sind oft über Hirnregionen und Verarbeitungsebenen verteilt, was es schwierig macht, beobachtete Veränderungen in der synaptischen Übertragung dem Erlernen einer Aufgabe oder eines Stimulus zuzuordnen. Um die synaptischen Veränderungen zu lokalisieren und zu visualisieren, die kausal mit einer bestimmten Lernaufgabe verbunden sind, braucht man ein geeignetes Modellsystem, das es ermöglicht, diese Synapsen präzise einzubeschränken.

Für ein solches Unterfangen eignet sich Drosophila melanogaster besonders, weil es relative Einfachheit des Gehirns, Verhaltensreichtum und experimentelle Zugänglichkeit kombiniert. Unter den etablierten Modellorganismen liegt Drosophila zwischen dem Nematoden C. elegans und genetisch beweglichen Säugetieren wie Mäusen in Bezug auf die neuronale Komplexität. Die stereotype Anzahl der Neuronen (300) und das begrenzte Verhaltensrepertoire werden in C. elegansbeobachtet. Säugetiere hingegen haben Millionen von Neuronen und eine erstaunliche Verhaltenskomplexität. Das Gehirn der Fruchtfliege ist mit seinen 100.000 Us-Litern deutlich kleiner als die Gehirne der meisten Wirbeltiere, und viele der Neuronen sind individuell identifizierbar⁵. Dennoch zeigt Drosophila ein breites Spektrum komplexer Verhaltensweisen, einschließlich der Fähigkeit, robustes assoziatives olfaktorisches Lernen und Gedächtnisbildung zu zeigen, das erstmals vor über 40 Jahren beschrieben wurde⁶. Im Rahmen dieses klassischen Konditionierungsverfahrens werden Fliegengruppen einem Geruch als konditionierter Stimulus (CS⁺) ausgesetzt, während sie einen strafenden Elektrischen Schlag als den unkonditionierten Stimulus (US) erhalten. Ein zweiter Geruch (CS^-) wird dann ohne Strafe präsentiert. Dabei lernen die Tiere, den mit der Bestrafung verbundenen Geruch zu vermeiden, der in einer späteren Wahlsituation zwischen den beiden Gerüchen CS⁺ und CS^-getestet werden kann. Die Arbeit an der Sezieren des neuronalen Substrats, das diesem Verhalten in Drosophila zugrunde liegt, hat die Pilzkörper (MB) als primäre Stelle des "Engramms" identifiziert^7,8,9,10 und daher war und ist die Schaltung dieser Hirnregion Gegenstand intensiver Forschung, um die Logik aufzudecken, durch die ein Speicherengramm erworben und gespeichert wird (vor kurzem in^11,12überprüft).

Die Drosophila MB besteht aus 2.000 intrinsischen Neuronen (Kenyon-Zellen) pro Hemisphäre, organisiert in parallelen axonalen Projektionen¹³. Axone von olfaktorischen Projektionsneuronen werden auf die seitliche Protocerebra und auf die MB-Calyces, die Haupt-dendritische Eingangsstelle des MB, ausgedehnt und empfangen olfaktorische Eingaben von Antennenlappen. Das lange, parallele Axonbündel von Kenyon-Zellen bilden den Pedunkel und die Lappen. Die meisten Kenyon-Zellen bifurcate bilden horizontale ,-Lappen, indem sie eine Sicherheit in Richtung der Mittellinie des Gehirns ausdehnen, und die vertikalen ,,/"-Lappen, indem sie die zweite Sicherheit erweitern, die in die dorsale Vorderrichtung projiziert. Die andere Gruppe von Kenyon-Zellen bildet die horizontalen -lappes¹³ des MB, wo der Lernprozess und die anschließende Kurzzeitgedächtnisbildung lokalisiert werden könnten¹⁰. Die MB-Lappen erhalten eine affete Eingabe und bieten eine efferente Ausgabe, die beide in der Regel auf unterschiedliche Teilunterregionen entlang der Kenyon-Zell-Axone^14,15,16beschränkt sind. Insbesondere haben afferente dopaminerge MB-Eingangsneuronen gezeigt, dass sie wertbasierte, z.B. strafbare, verstärkende Effekte im assoziativen olfaktorischen Lernen^15,17vermitteln. Stereotypische und individuell identifizierbare effelösenMB Output-Neuronen aus den Pilzkörperlappen integrieren Informationen über eine große Anzahl von Kenyon-Zellen, zielen auf verschiedene Hirnbereiche ab und tragen verhaltens-lehrreiche appetitive oder aversive Informationen¹⁵ . Diese neuronale Architektur hat zu einem Konzept der Organisation des assoziativen Engramms geführt. Gerüche werden relativ präzise von spärlich aktivierten Ensembles von Kenyon-Zellen kodiert. Die zufällige Aktivität dieser Kenyon-Zell-Ensembles und die Freisetzung von Dopamin - evoziert durch strafende Reize - moduliert die Übertragung von Kenyon-Zell-Präsynapsen auf MB-Ausgangsneuronen, so dass die Tiere anschließend diesen besonderen Geruch vermeiden^{10 ,12}. Wir verwenden dieses ziemlich genau definierte und lokalisierte Engramm als paradigmatischen Fall, um zu veranschaulichen, wie diese lernabhängigen Veränderungen der synaptischen Aktivität bestimmt und überwacht werden können.

Der Wert von Drosophila als Modellsystem hängt stark von der unübertroffenen genetischen Toolbox ab, die es ermöglicht, Transgene zur Identifizierung, Überwachung und Steuerung einzelner Neuronen innerhalb komplexer Schaltkreise auszudrücken¹⁸. Das Aufkommen von Techniken zur neuronalen Aktivitätsüberwachung - wie die hier diskutierte Kalzium-Bildgebung - hat die Bestimmung neuronaler Aktivitätsmuster als Reaktion auf einen bestimmten Reiz ermöglicht. Durch die Kombination spezifischer Gal4-gesteuerter Expression genetisch kodierter Calciumindikatoren (GECIs) mit olfaktorischer Stimulation kann man die geruchsbeschworene Kalziumdynamik von Neuronen von Interesse visualisieren¹⁹. In diesem Protokoll wird gezeigt, dass es durch die weitere Kopplung dieser Technik mit einem klassischen Konditionierungsparadigma möglich ist, diese olfaktorischen Reaktionen im Kontext des Lernens zu untersuchen. Lerninduzierte Plastizität kann mit GECIs weiter seziert werden, die nicht nur auf ein einzelnes spezifisches Neuron, sondern auch auf bestimmte Teilabteilungen eines Neurons lokalisiert sind. Pech et al.²⁰ haben eine Auswahl an Werkzeugen etabliert, die genau dies erlauben. Durch die Ausrichtung von GCaMP3²¹ auf die Vor- oder Postsynapse - über die Verbindung zum Wirbeltier Synaptophysin bzw. dHomer bzw.²⁰- kann die Differentialmodulation dieser Standorte unterschieden werden. Diese Lokalisierung verschafft in diesem Zusammenhang einen Vorteil gegenüber den meisten GECIs, die im gesamten Zytosol allgegenwärtig sind - z. B. GCaMP²², GCaMP3²¹oder GCaMP6²³ -, da es bedeutet, dass prä- und postsynaptische Transienten vom gesamten integrierten Kalziumzufluss, der durch neuronische Aktivierung auftritt, unterschieden. Dies kann Hinweise auf den Ort und die Arten der Plastizität geben, die als Folge von oder zu Lern- und Gedächtnisbildung auftreten. Als Beispiel zeigt das hier bereitgestellte Protokoll den Wert dieses Werkzeugs bei der Entschlüsselung der Modulation von MB-Ausgangsneuronen während des olfaktorischen assoziativen Lernens, indem es die Expression des Kalziumsensors nur auf die Postsynapse ausrichtet. Durch die Überwachung, innerhalb einer einzelnen Fliege, geruchsevokte Aktivität vor und nach der Geruchskonditionierung kann ein direkter Vergleich zwischen einer naiven Geruchsreaktion und einer erlernten Geruchsreaktion gezogen werden. Während sie in derselben Bildkammer fixiert sind, werden Fliegen einer Auswahl von Gerüchen ausgesetzt. Dann erhalten sie ein aversives assoziatives Konditionierungsprotokoll, in dem einer dieser Gerüche mit einem elektrischen Schlag gepaart wird (wird das CS⁺) und ein weiterer Geruch wird ohne Verstärkung präsentiert (wird zum CS^-). Schließlich sind die Fliegen wieder den gleichen Gerüchen ausgesetzt wie im ersten Schritt. Die Calciumdynamik wird mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie beobachtet.

Protokoll

1. Transgene Fruchtfliegen, Drosophila melanogaster

1. Kreuzinnen von Jungfrauen und männlichen Fliegen (bei 25 °C bei 60 % relativer Luftfeuchtigkeit auf einem 12 h-Licht-/Dunkelzyklus) mit den gewünschten Gal4- bzw. UAS-Konstrukten^25,um Fliegen zu produzieren, in denen bestimmte Neuronen von Interesse eine genetisch kodierte Kalzium-Indikator.
2. Altern Sie die weibliche Nachkommenschaft des oben genannten Kreuzes, bis sie im Bereich von 3-6 Tagen nach der Eklat liegen. Weibliche Fliegen sind wegen ihrer etwas größeren Größe vorzuziehen.

2. Vorbereitung der Fruchtfliege für die In-vivo-Calciumbildgebung

1. Wählen Sie eine einzelne weibliche Fliege und anästhesieren auf Eis für nicht länger als 5 min.
2. Mit feinen Zangen die Fliege in die Bildkammer legen (in Abbildung 1cdargestellt). Stellen Sie sicher, dass Thorax und Beine in Kontakt mit den elektrischen Drähten im Boden der Kammer sind und dass der Kopf flach liegt. Fixieren Sie die Position der Fliege mit klarem Klebeband.
   HINWEIS: Dieses Protokoll erfordert eine maßgeschneiderte Kammer, in der die Fliegen fixiert sind, wobei die Kopfkapsel zum Öffnen zugänglich ist und die Fliegen sowohl Geruchsstimulationen an den Antennen als auch elektrische Stöße an Thorax und Beinen empfangen können (Abbildung 1).
3. Mit einer chirurgischen Skalpellklinge, die am Skalpellgriff befestigt ist (siehe Tabelle der Materialien),schneidet ein Fenster im Band um den Kopf der Fliege, so dass die Antennen bedeckt und nur der vordere Teil des Thorax ausgesetzt.
4. Umgeben Sie die Seiten und die Rückseite des Kopfes mit blaulichthärtendem Kleber, sorgfältig manipuliert mit einem Insektenstift, der von konkav-konvexen Kiefern gehalten wird. Stellen Sie den Kleber mit einer blauen, lichtemittierenden LED-Lampe ein.
5. Prüfen Sie, ob der Kleber vollständig eingestellt ist, und entfernen Sie alle verbleibenden ungehärteten Kleber von der dorsalen Oberfläche des Fliegenkopfes.
6. Tragen Sie einen Tropfen Ringers Lösung²⁴ (siehe Materialtabelle) auf, um die freiliegende Nagelhaut des Kopfes abzudecken.
7. Mit einem sehr feinklingenden Stichmesser durch die Nagelhaut schneiden. Für die effizienteste Entfernung der Nagelhaut, zuerst über das Hinterteil des Kopfes schneiden mit dem Ocelli als Ausgangspunkt. Dann schneiden Sie jede Seite, medial zu den Augen, um eine Klappe der Nagelhaut zu bilden, die leicht mit Zangen abgerissen werden kann.
8. Entfernen Sie überschüssige Nagelhaut, die die Gehirnregion von Interesse blockieren kann.
9. Löschen Sie vorsichtig die dorsale Oberfläche jeder Luftröhre mit feinen Zangen, um Störungen des Hirngewebes selbst zu vermeiden. Entfernen und aktualisieren Sie die Lösung²⁴ von Ringer (siehe Materialtabelle),wenn dies erforderlich ist, um den Bereich von Gewebeablagerungen zu entfernen.
10. Stellen Sie die hypodermische Geruchsabgabenadel in Position, ca. 1 cm vom Flugkopf entfernt. Stellen Sie sicher, dass es nichts gibt, was die Geruchszufuhr zu den Antennen behindern könnte.
11. Schließen Sie am Mikroskop die Bildgebungskammer über die hypodermische Geruchsabgabenadel an das Geruchsabgabesystem an.
12. Um der Fliege zu ermöglichen, sich vollständig von Anästhesie und Operation zu erholen und sich an den Luftstrom anzupassen, implementieren Sie in diesem Stadium eine 10-min-Ruhezeit.

3. In vivo Calcium-Bildgebung

1. Verwenden Sie ein Multiphotonenmikroskop, das mit einem Infrarotlaser und einem Wassertauchobjektiv (siehe Tabelle der Materialien)ausgestattet ist, das auf einem vibrationsisolierten Tisch installiert ist. Für die Visualisierung von GFP-basierten Calciumindikatoren stimmen Sie den Laser auf eine Anregungswellenlänge von 920 nm ab und installieren Sie einen GFP-Bandpassfilter.
2. Scannen Sie mit dem groben Z-Einstellknopf durch die Z-Achse des Gehirns und lokalisieren Sie die von Interesse sindde Hirnregion. Verwenden Sie die Zuschneidefunktion, um das Scannen nur auf diesen Bereich zu konzentrieren, um die Scanzeit zu minimieren, und um die Scanansicht so zu drehen, dass der Vorderkopf nach unten zeigt.
3. Passen Sie die Framegröße auf 512 x 512 px, die Scangeschwindigkeit auf > 4 Hz und den Scanbereich (in der Y-Dimension) an, sodass die neuronen von Interesse abgedeckt werden.

4. Visualisierung geruchsbeschworener Calciumtransienten durch olfaktorische Konditionierung

1. Verwenden Sie ein Geruchsabgabesystem^19,26, das zeitlich präzise mehrere Geruchsreize liefern kann.
   1. Verwenden Sie einen zusätzlichen Computer, um das Gerät zu steuern, und um mit der Bildmikroskop-Software zu kommunizieren, um Geruchsstimulationen mit Bildaufnahme während Experimenten zu koordinieren.
   2. Initiieren Sie ein vorprogrammiertes Makropaket, das die Bildaufnahmesoftware mit dem Geruchslieferprogramm (z. B. ein in der Mikroskopsteuerungssoftware installiertes VBA-Makropaket, siehe Tabelle der Materialien)miteinander verknüpft, das auf einen externen Eingang reagiert. durch die Initiierung eines Geruchsabgabeprotokolls in einem separaten Programm).
2. Beginnen Sie die Messung mit einer Messung durch Überwachung von "Pre-Training"/naiven geruchsbeschworenen Calciumtransienten mit einer Auflösung von 512 x 512 px und einer Bildrate von 4 Hz. Liefern Sie einen 2,5 s Geruchsreiz, flankiert durch zusätzliche Bildaufnahme für 6,25 s vorausgehenden Geruchsbeginn (um ein F zu etablieren ₀ Basiswert) und 12,5 s nach Geruchsversatz. Wiederholen Sie dies mit einem zweiten Geruchsmittel und dann mit einem dritten Geruchsmittel.
3. Fahren Sie 3 min nach dieser Messung mit klassischer Konditionierung ("Training") der Fliege fort.
   1. Wählen Sie einen der Gerüche in der "Pre-Training" Phase präsentiert, um die CS⁺ Geruch und eine andere, um die CS^- Geruch zu werden. Präsentieren Sie den CS⁺ Geruch mit dem computergesteuerten Geruchsliefersystem für 60 s neben zwölf 90 V Elektroschocks.
   2. Nach einer 60 s Pause, präsentieren Sie die CS^- Geruch allein für 60 s. Als Geruchsstoffe 4-Methylcyclohexanol und 3-Oktanol verwenden. Stellen Sie das dritte Geruchsmittel (z.B. 1-Okten-3-ol) während dieses Trainings nicht vor (Schritt 4.2.) und nach (Schritt 4.4) der Trainingsphase als Kontrolle dar.
4. Messen Sie die "nach dem Training" geruchsbeschworenen Kalziumtransienten erneut, indem Sie das "Pre-Training"-Geruchsstimulationsprotokoll (Schritt 4.2.) 3 min nach Abschluss der Trainingsphase wiederholen (Schritt 4.3).
   HINWEIS: Der Zeitpunkt dieses Schritts sollte die Zeit des Interesses nach der Gedächtnisbildung widerspiegeln (z. B. diesen Schritt 3-4 min nach dem Konditionierungsschritt durchführen, um das Kurzzeitgedächtnis zu untersuchen). In der Regel können Fliegen in dieser Zubereitung mehrere Stunden überleben.
5. Speichern Sie Bildgebungsdateien in einem geeigneten Format (z. B. Tiff) für eine spätere Bildanalyse.

5. Bildanalyse

1. Um Bilder zu analysieren, öffnen Sie Tiff (oder ähnliche) Dateien in der Bildanalyse-Software wie Fidschi²⁷.
2. Richten Sie die Stapel mithilfe eines Bewegungskorrekturalgorithmus aus, um eine minimale Bewegung in X- und Y-Richtung zu gewährleisten. Verwerfen Sie alle Aufnahmen, die eine starke Bewegung in der Z-Achse zeigen.
3. Wählen Sie das Tool der Software aus, mit der ein Bereich von Interesse (ROI) um den zu untersuchenden Bereich markiert wird. Dies sollte so präzise wie möglich sein, um den Einfluss der Hintergrundfluoreszenz zu begrenzen.
4. Verwenden Sie das entsprechende Tool der Software, um zeitliche Fluoreszenzintensitätsdaten als Datendateien aus dem ausgewählten ROI zu extrahieren, so dass für jeden Frame der Aufzeichnung ein Wert generiert wird.
5. Öffnen Sie die Daten mit einem Datenanalyseprogramm, um die Werte für jede Geruchsspur mit F/F₀ zu berechnen. F₀ = durchschnittliche Fluoreszenz in den 2 s vor Geruchsbeginn. F = die Differenz zwischen der Rohfluoreszenz in einem gegebenen Rahmen und F₀. Berechnen Sie aus diesen Werten einen Wert von F/F₀ für jeden Frame, der gegen die Zeit geplottet werden kann, um die relative Fluoreszenz während der gesamten Geruchsreizperiode widerzuspiegeln.

Ergebnisse

Ein Beispiel für Bilder, die mit dem obigen Protokoll aufgenommen wurden, ist in Abbildung 2zu sehen. d Homer-GCaMP3 wird in einem MB-Ausgangsneuron exprimiert, dessen Dendriten das Fach 1 des MB-Lappens (das Neuron wird MVP2^28,29) innervierend erhalten und genetisch mit der Split-Gal4-Linie MB112C¹⁶gezielt eingesetzt werden. Auch, gezeigt ist der Unterschied in der su...

Diskussion

Die Zerlegung der neuronalen Schaltkreise, die dem Lernen und Gedächtnis zugrunde liegen, ist ein herausragendes Ziel auf dem Gebiet der Neurowissenschaften. Die genetische Zugänglichkeit von Drosophila und die Breite und Leichtigkeit der Verhaltenstests macht dies zu einem idealen Werkzeug, um solche Phänomene zu untersuchen. Hier wird eine Methode vorgestellt, mit der innerhalb einzelner Fliegen die Modulation visualisiert werden kann, die auf subzellulärer Ebene als Ergebnis der olfaktorischen Konditionierung...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1-Octen-3-ol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	O5284	Chemikalie, die als Odorierungsmittel verwendet
wird 3-Octanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	218405	Chemikalie, die als Odorant verwendet
4-Methylcyclohexanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	153095	Chemikalie, die als Odorierungsmittel
verwendet wird Bandpassfilter für EGFP (525/50 nm)	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Deutschland
Durchsichtiges Klebeband	Tesa SE, Norderstedt, Deutschland		Standard klares Klebeband
Konkav-konvexe Backen	Fine Science Tools, North Vancouver, Kanada	10053-09	Klingenhalter mit konkav-konvexen
Backen Feine Pinzette	Fine Science Tools, North Vancouver, Kanada	11412-11	Pinzette mit Spitze 0,1 x 0,06 mm
Injektionsnadel	Sterican - B. Braun, Melsungenk, Deutschland	4665120	1,20x40mm
Insekten Minutien Stifte	Fine Science Tools, North Vancouver, Kanada	26002-10	Durchmesser 0,1mm, Spitze 0,0125mm
Kentoflow	Kent Express Dental Supplies, Gillingham, UK	953683	Blaulichthärtender Kleber
Objektträger Mikroskop	Objektträger Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland	0656.1	Standardobjektiv Objektträger 76 x 26 mm
Mineralöl	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	M8410	Wird als Verdünnungsmittel für Odorstoffe
verwendet Modengekoppelter Ti-Saphir-Laser Chameleon Vision 2	Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA		Abstimmbarer Infrarot-Femtosekundenlaser
Multiphotonenmikroskop LSM 7MP ausgestattet mit BiG-Detektoren	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Deutschland		Multiphotonenmikroskope, mehrere Unternehmen bieten ähnliche Geräte an.
Plan-Apochromat 20x (NA = 1,0) Wasserimmersionsobjektiv	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Deutschland	421452-9900-000	Objektiv W "Plan-Apochromat" 20x/1,0 DIC M27 70mm
Ringer-Lösung			KCl, 130mM NaCl, 2mM MgCl2, 2mM CaCl2, 5mM Hepes-NaOH, 36mM Saccharose, pH = 7,4
Stichmesser	Sharpoint, Surgical Specialties Corporation, Reading, PA, USA	72-1551	5,0 mm Gerade begrenzte Klingentiefe
Chirurgische Skalpellklinge	Swann-Morton, Sheffield, UK	0303	Artikel-Nr. 11
Chirurgischer Skalpellgriff	Swann-Morton, Sheffield, UK	0907	Artikel-Nr. 7S/S
Visual Basics of Applicatons (VBA)-Software, um einen Trigger vom Geruchsabgabegerät zu erhalten, und das Elektroschock -Applikationsgerät (Stromversorgung) zur Interaktion mit der ZEN-Software von Zeiss, die das Mikroskop steuert.	Individuell angefertigt und auf Anfrage erhältlich	n.a.n.a	.