In Vivo Optische Calcium-Bildgebung der lerninduzierten synaptischen Plastizität bei Drosophila melanogaster

Summary

Hier stellen wir ein Protokoll vor, mit dem vor- und/oder postsynaptisches Kalzium im Kontext des Drosophila-Lernens und -Gedächtnisses visualisiert werden kann. In vivo Kalzium-Bildgebung mit synaptisch lokalisierten Kalziumsensoren wird mit einem klassischen olfaktorischen Konditionierungsparadigma kombiniert, so dass die synaptische Plastizität, die dieser Art des assoziativen Lernens zugrunde liegt, bestimmt werden kann.

Abstract

Jahrzehntelange Forschung in vielen Modellorganismen hat zu dem aktuellen Konzept der synaptischen Plastizität geführt, die dem Lernen und der Gedächtnisbildung zugrunde liegt. Lerninduzierte Veränderungen in der synaptischen Übertragung sind oft auf viele Neuronen und Ebenen der Verarbeitung im Gehirn verteilt. Daher sind Methoden zur Visualisierung lernabhängiger synaptischer Plastizität über Neuronen hinweg erforderlich. Die Fruchtfliege Drosophila melanogaster stellt einen besonders günstigen Modellorganismus dar, um neuronale Schaltkreise zu untersuchen, die dem Lernen zugrunde liegen. Das hier vorgestellte Protokoll zeigt, wie die Prozesse, die der Bildung assoziativer olfaktorischer Erinnerungen zugrunde liegen, d.h. synaptische Aktivität und deren Veränderungen, in vivo überwacht werden können. Mit hilfe der breiten Palette genetischer Werkzeuge, die in Drosophilaverfügbar sind, ist es möglich, genetisch kodierte Kalziumindikatoren in bestimmten Zellpopulationen und sogar Einzelzellen gezielt auszudrücken. Durch die Fixierung einer Fliege an Ort und Stelle und das Öffnen der Kopfkapsel ist es möglich, die Kalziumdynamik in diesen Zellen zu visualisieren und gleichzeitig olfaktorische Reize zu liefern. Zusätzlich zeigen wir eine Einrichtung, bei der die Fliege gleichzeitig elektrischen Stößen auf den Körper ausgesetzt werden kann. Dies bietet ein System, in dem Fliegen klassische olfaktorische Konditionierung enden können - wobei ein zuvor naiver Geruch gelernt wird, mit Elektroschock-Strafe in Verbindung gebracht zu werden - zur gleichen Zeit wie die Darstellung dieses Geruchs (und anderer ungeübter Gerüche) im Gehirn mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie beobachtet. Unser Labor hat bereits über die Erzeugung synaptisch lokalisierter Kalziumsensoren berichtet, die es ermöglichen, die fluoreszierenden Calciumsignale auf prä- oder postsynaptische Kompartimente zu beschränken. Die Zwei-Photonen-Mikroskopie bietet eine Möglichkeit, feine Strukturen räumlich aufzulösen. Wir veranschaulichen dies, indem wir uns auf Neuronen konzentrieren, die Informationen aus dem Pilzkörper integrieren, einem Zentrum höherer Ordnung des Insektenhirns. Insgesamt bietet dieses Protokoll eine Methode, um die synaptischen Verbindungen zwischen Neuronen zu untersuchen, deren Aktivität als Ergebnis des olfaktorischen Lernens moduliert wird.

Introduction

Die Entschlüsselung, wo und wie die Informationen durch Lernen im Gehirn erfasst und anschließend als Gedächtnis gespeichert werden, stellt eine der schwierigsten Aufgaben in der Neurowissenschaft¹dar. Neurowissenschaftliche Forschung hat zum Konzept einer Veränderung der synaptischen Übertragung als neuronales Substrat geführt, das dem Lernen und der Gedächtnisbildung zugrunde liegt^2,3. Es wird vermutet, dass während des Lernens synaptische Verbindungen zwischen neuronalen Ensembles, die während der Wahrnehmung eines Stimulus aktiv sind, so verändert werden, dass ihr kombiniertes Aktiv....

Protocol

1. Transgene Fruchtfliegen, Drosophila melanogaster

1. Kreuzinnen von Jungfrauen und männlichen Fliegen (bei 25 °C bei 60 % relativer Luftfeuchtigkeit auf einem 12 h-Licht-/Dunkelzyklus) mit den gewünschten Gal4- bzw. UAS-Konstrukten^25,um Fliegen zu produzieren, in denen bestimmte Neuronen von Interesse eine genetisch kodierte Kalzium-Indikator.
2. Altern Sie die weibliche Nachkommenschaft des oben genannten Kreuzes, bis sie im Bereich von 3-6 Tagen nach der Eklat liegen. Weibliche Fliegen sind wegen ihrer etwas größeren Größe vorzuziehen.

2. Vorbereitung der Fruchtfliege für die In-vivo-Ca....

Results

Ein Beispiel für Bilder, die mit dem obigen Protokoll aufgenommen wurden, ist in Abbildung 2zu sehen. d Homer-GCaMP3 wird in einem MB-Ausgangsneuron exprimiert, dessen Dendriten das Fach 1 des MB-Lappens (das Neuron wird MVP2^28,29) innervierend erhalten und genetisch mit der Split-Gal4-Linie MB112C¹⁶gezielt eingesetzt werden. Auch, gezeigt ist der Unterschied in der su.......

Discussion

Die Zerlegung der neuronalen Schaltkreise, die dem Lernen und Gedächtnis zugrunde liegen, ist ein herausragendes Ziel auf dem Gebiet der Neurowissenschaften. Die genetische Zugänglichkeit von Drosophila und die Breite und Leichtigkeit der Verhaltenstests macht dies zu einem idealen Werkzeug, um solche Phänomene zu untersuchen. Hier wird eine Methode vorgestellt, mit der innerhalb einzelner Fliegen die Modulation visualisiert werden kann, die auf subzellulärer Ebene als Ergebnis der olfaktorischen Konditionierung.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Octen-3-ol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	O5284	Chemikalie, die als Odorierungsmittel verwendet
wird 3-Octanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	218405	Chemikalie, die als Odorant verwendet
4-Methylcyclohexanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	153095	Chemikalie, die als Odorierungsmittel
verwendet wird Bandpassfilter für EGFP (525/50 nm)	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Deutschland
Durchsichtiges Klebeband	Tesa SE, Norderstedt, Deutschland		Standard klares Klebeband
Konkav-konvexe Backen	Fine Science Tools, North Vancouver, Kanada	10053-09	Klingenhalter mit konkav-konvexen
Backen Feine Pinzette	Fine Science Tools, North Vancouver, Kanada	11412-11	Pinzette mit Spitze 0,1 x 0,06 mm
Injektionsnadel	Sterican - B. Braun, Melsungenk, Deutschland	4665120	1,20x40mm
Insekten Minutien Stifte	Fine Science Tools, North Vancouver, Kanada	26002-10	Durchmesser 0,1mm, Spitze 0,0125mm
Kentoflow	Kent Express Dental Supplies, Gillingham, UK	953683	Blaulichthärtender Kleber
Objektträger Mikroskop	Objektträger Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland	0656.1	Standardobjektiv Objektträger 76 x 26 mm
Mineralöl	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	M8410	Wird als Verdünnungsmittel für Odorstoffe
verwendet Modengekoppelter Ti-Saphir-Laser Chameleon Vision 2	Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA		Abstimmbarer Infrarot-Femtosekundenlaser
Multiphotonenmikroskop LSM 7MP ausgestattet mit BiG-Detektoren	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Deutschland		Multiphotonenmikroskope, mehrere Unternehmen bieten ähnliche Geräte an.
Plan-Apochromat 20x (NA = 1,0) Wasserimmersionsobjektiv	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Deutschland	421452-9900-000	Objektiv W "Plan-Apochromat" 20x/1,0 DIC M27 70mm
Ringer-Lösung			KCl, 130mM NaCl, 2mM MgCl2, 2mM CaCl2, 5mM Hepes-NaOH, 36mM Saccharose, pH = 7,4
Stichmesser	Sharpoint, Surgical Specialties Corporation, Reading, PA, USA	72-1551	5,0 mm Gerade begrenzte Klingentiefe
Chirurgische Skalpellklinge	Swann-Morton, Sheffield, UK	0303	Artikel-Nr. 11
Chirurgischer Skalpellgriff	Swann-Morton, Sheffield, UK	0907	Artikel-Nr. 7S/S
Visual Basics of Applicatons (VBA)-Software, um einen Trigger vom Geruchsabgabegerät zu erhalten, und das Elektroschock -Applikationsgerät (Stromversorgung) zur Interaktion mit der ZEN-Software von Zeiss, die das Mikroskop steuert.	Individuell angefertigt und auf Anfrage erhältlich	n.a.n.a	.