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Bildgebung von intrazellulärem ATP in organotypischen Gewebescheiben des Maushirns mit dem FRET-basierten Sensor ATeam1.03YEMK

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DOI:

10.3791/60294

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19. Dezember 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Neurobiology, Heinrich Heine University Düsseldorf, 2Department of Neurology, Düsseldorf University Hospital

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Protokoll zur zelltypspezifischen Expression des genetisch codierten FRET-basierten Sensors ATeam1.03YEMK in organotypischen Scheibenkulturen des Mausvorhirns. Darüber hinaus zeigen wir, wie dieser Sensor für die dynamische Bildgebung von zellulären ATP-Spiegeln in Neuronen und Astrozyten verwendet wird.

Zusammenfassung

Die neuronale Aktivität im Zentralnervensystem (ZNS) weckt eine hohe Nachfrage nach zellulärer Energie, die durch den Abbau von Adenosintriphosphat (ATP) entsproche. Ein großer Teil von ATP wird benötigt, um Ionengradienten über Plasmamembranen, die durch elektrische Signalisierung von Neuronen abgebaut werden, neu zu installieren. Es gibt Hinweise darauf, dass Astrozyten - während sie selbst keine schnellen elektrischen Signale erzeugen - eine erhöhte Produktion von ATP als Reaktion auf neuronale Aktivität durchlaufen und aktive Neuronen unterstützen, indem sie ihnen Energiemetaboliten zur Verfügung stellen. Die jüngste Entwicklung genetisch kodierter Sensoren für verschiedene Metaboliten ermöglicht nun die Untersuchung solcher metabolischen Wechselwirkungen zwischen Neuronen und Astrozyten. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur zelltypspezifischen Expression des ATP-empfindlichen Fluoreszenz-Resonanz-Energieübertragungssensors (FRET-) Sensor ATeam1.03YEMK in organotypischen Gewebescheibenkulturen des Maus-Hippocampus und des Kortex mit adeno-assoziierten viralen Vektoren (AAV). Darüber hinaus zeigen wir, wie dieser Sensor zur dynamischen Messung von Veränderungen der zellulären ATP-Spiegel in Neuronen und Astrozyten bei Zunahmen des extrazellulären Kaliums und nach Induktion chemischer Ischämie (d. h. einer Hemmung des zellulären Energiestoffwechsels) eingesetzt werden kann.

Einleitung

Die exzitatorische elektrische Aktivität von Neuronen basiert weitgehend auf dem Fluss von Kationen wie Natrium (Na+) und Kalium (K+) über ihre Plasmamembranen. Die Aufrechterhaltung der elektrochemischen Gradienten dieser beiden Ionen ist daher für die Signalisierung erforderlich. Dies wird durch die zelluläre Na+/K+-ATPase (NKA) erreicht, eine allgegenwärtig exprimierte elektrogene Transmembranpumpe, die 3 Na+ aus der Zelle im Austausch für 2 K+ aus dem extrazellulären Raum extrudiert, was den Verbrauch eines Moleküls ATP pro Transportzyklus1erfordert. Neben dem NKA gibt es noch einige weitere ATP-verbrauchende Ionentransporter, darunter die Plasmamembran Ca2+-ATPase, die für die intrazelluläre Ca2+ Homöostase und deren Export nach aktivitätsinduziertem Zustrom2von entscheidender Bedeutung ist. In präsynaptischen Vesikeln erzeugt ein Vakuolar-Typ H+-ATPase (v-ATPase) den Protonengradienten, der für die Aufnahme des Neurotransmitters in dieses Fach erforderlich ist3.

Während die Aktivität von Neuronen daher eine erhebliche Menge an ATP4erfordert, weisen sie keine signifikante Kapazität für die Speicherung von Energie auf. Stattdessen scheinen sie auf metabolische Wechselwirkungen mit benachbarten Astrozyten zu verlassen, die wichtigsten Glykogenspeicher im Gehirn5. Es wurde vorgeschlagen, dass astrozytisches Glykogen in der Tat eine wichtige Rolle bei der Unterstützung des neuronalen Energiebedarfs spielt; und ein Schlüsselphänomen in dieser vorgeschlagenen neurometabolischen Kopplung zwischen den beiden Zelltypen ist die Fähigkeit der Astrozyten, ihre ATP-Produktion als Reaktion auf neuronale Aktivität zu erhöhen6,7,8. Diese Hypothese, bekannt als Astrozyten-Neuron-Laktat-Shuttle (ANLS), ist immer noch in der Debatte, weil andere Arbeiten Beweise dafür geliefert haben, dass Neuronen auch ihre eigene Rate der Glykolyse als Reaktion auf Stimulation9,10erhöhen können, was die Notwendigkeit weiterer Methoden und Ansätze zur Untersuchung der Neuro-Glia-Interaktion widerspiegelt.

Die Untersuchung des zellulären Energiestoffwechsels und des ATP-Spiegels in Neuronen und Astrozyten zur Aufklärung neuro-gliametabolischer Wechselwirkungen wird seit langem durch das Fehlen geeigneter Sonden zum Nachweis von Veränderungen der Metabolitenkonzentrationen in lebenden Zellen im Hirngewebe behindert. Das letzte Jahrzehnt hat jedoch einen Schub in der Entwicklung neuer Werkzeuge und neuer genetisch kodierter Fluoreszenzsonden für verschiedene Metaboliten, einschließlich Sensoren für ATP, Laktat, Pyruvat und andere11,12. Mit diesen Werkzeugen ist es nun möglich, Fragen im Zusammenhang mit dem zellulären ATP-Verbrauch und Veränderungen der zellulären Energieniveaus auf Einzelzellebene und zelltypspezifisch in intaktem Hirngewebe direkt zu behandeln13.

In der vorliegenden Arbeit beschreiben wir ein Verfahren zur Visualisierung der zytosolischen ATP-Dynamik auf Neuronen und Astrozyten kultivierter organotypischer Gehirnscheiben. Wir zeigen, wie adeno-assoziierte virale Vektoren (AAV) für die zelltypspezifische Expression des genetisch kodierten ATP-Nanosensors ATeam1.03YEMK (14) in Neuronen und Astrozyten von Scheiben des Maushirns verwendet werden, die in der Zellkultur für mehrere Wochen gehalten werden können15. Es wird ein Verfahren beschrieben, wie die Glianarbe entfernt wird, die kultivierte Gewebescheiben bedeckt, was die optische Zugänglichkeit und Bildgebung von Zellen in den darunter liegenden organotypischen Gewebeschichten verbessert. Schließlich zeigen wir, wie ATeam1.03YEMK verwendet werden kann, um FRET-basierte Abbildungvonen von Veränderungen in zellulären ATP-Spiegeln in dieser Zubereitung durchzuführen. Diese Methode hostet die wichtigsten Vorteile, dass es keine chirurgischen Gehirnverfahren erfordert, bietet hohe Expression der Sensor- und Zelltyp-Spezifität in kultivierten Gehirnscheiben, Verringerung der Invasivität oder Stress in den Zellen im Vergleich zu anderen Methoden, wie Transfektion durch Elektroporation oder Transduktion mit anderen viralen Vektoren10,16,17. Darüber hinaus kann dieses Protokoll auf andere FRET-basierte Nanosensoren angewendet werden, darunter Varianten von ATeam1.03, die eine geringere Bindungsaffinität für ATP14bieten.

Protokoll

Die vorliegende Studie wurde in strikter Übereinstimmung mit den institutionellen Leitlinien der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf sowie der Richtlinie des Rates der Europäischen Gemeinschaft (2010/63/EU) durchgeführt. Alle Experimente mit organotypischen Hirnscheibenkulturen wurden dem Tierschutzamt der Tierpflege- und Einsatzeinrichtung der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf mitgeteilt und genehmigt (institutionelle Aktnummer: O50/05). Gemäß den Empfehlungen der Europäischen Kommission18wurden Tiere bis zu 10 Tagen durch Enthauptung getötet.

1. Vorbereitung von organotypischen Hirnscheibenkulturen (OTCs)

  1. Am Tag vor oder mindestens 30 min vor dem Eingriff
    1. Bereiten Sie die Petrischale (unter sterilen Bedingungen) vor. Entfernen Sie den Deckel der 6 Well-Platte und legen Sie 800-850 L OTC-Medium in jeden Brunnen. Bewahren Sie die Platte im Inkubator auf (37 °C, 5% CO2/95%O2), bis erforderlich.
    2. Bereiten Sie die Wasch-Petri-Gerichte (unter sterilen Bedingungen) vor. Fügen Sie 3 ml HBSS zu jeder 30 mm Petrischale hinzu. Es sind insgesamt 5 Gerichte pro Verfahren erforderlich. Legen Sie sie mindestens 30 min lang in den Inkubator (37 °C, 5% CO2/95%O2) — über Nacht, bis erforderlich.
    3. Vorbereiten des ACSF (Tabelle 1). Die Saline ohne Glukose bei 4 °C bis zum nächsten Tag aufbewahren.
Salines und Medien - Formulierung
NamenAbkürzungZusammensetzungKonzentration [mM]Kommentare
Künstliche Cerebrospinal Fluid LösungACSFNacl125Geblasen mit 5% CO2/95% O2, pH 7.4
Kcl2.5Fügen Sie Glukose immer direkt vor der Verwendung hinzu.
CaCl2 2Nicht mehr als einen Tag mit Glukose lagern
MgCl2 1Nr. 310 mOsm/L
NaH2PO4 1.25
NaHCO3 26
Glukose20
Experimentelle ACSFE-ACSFNacl136Geblasen mit 5% CO2/95% O2, pH 7.4
Kcl3Fügen Sie Glukose immer direkt vor der Verwendung hinzu.
CaCl2 2Nicht mehr als einen Tag mit Glukose lagern
MgCl2 1320 mOsm/L
NaH2PO4 1.25
NaHCO3 24
Glukose5
Laktat1
Chemische Ischämie-LösungCisNacl136Geblasen mit 5% CO2/95% O2, pH 7.4
Kcl3Nr. 318 mOsm/L
CaCl2 2
MgCl2 1
NaH2PO4 1.25
NaHCO3 24
2, 2-Deoxyglucose2
NaN3 5
8 mM Kalium ACSF8 mM K+ ACSFNacl128Geblasen mit 5% CO2/95% O2, pH 7.4
Kcl8320 mOsm/L
CaCl2 2
MgCl2 1
NaH2PO4 1.25
NaHCO3 24
Glukose5
Laktat1
Hepes-gepufferter ACSFH-ACSFNacl125Angepasst auf pH 7,4 mit NaOH
Kcl3Fügen Sie Glukose immer direkt vor der Anwendung hinzu
CaCl2 2Nicht mehr als einen Tag mit Glukose lagern
MgSO4 2310 mOsm/L (angepasst mit Saccharose)
NaH2PO4 125
Hepes25
Glukose10
Hanks' ausgewogene SalzlösungHBSSSigma (Katalognummer H9394).
Phosphat-gepufferte Saline von DulbeccoDPBSGibco (Katalognummer 14287-080)
Organotypische Kultur MediumOTC-Mediumwärmeinaktiviertes Pferdeserum20%34°C, 5 %CO2, pH 7,4, unter Kultivierungszustand
Mem79%320 mOsm/L
L-Glutamin1
Insulin0,01 mg/ml
Nacl14.5
MgSO4 2
CaCl2 1.44
Ascorbinsäure0.00125 %
D-Glucose13

Tabelle 1: Lösungszusammensetzung.

  1. Am Tag der Zubereitung die Glukose in den ACSF geben, auf Eis legen und mit 95% O2/5%CO2 für mindestens 30 min sprudeln, um einen pH-Wert von 7,4 zu erzielen.
  2. Sezier- und Schneiden
    1. Opfern Sie die Maus (BalbC, beide Geschlechter) an den postnatalen Tagen 6 bis 8 durch schnelle Enthauptung und legen Sie den Kopf in eine gläserne Petrischale mit eiskaltem ACSF.
    2. Setzen Sie den Schädel aus, indem Sie die Haut von hinten bis zur hinteren Spitze des Nasenbeins schneiden. Dann schneiden Sie vorsichtig den Schädel aus dem Foramen Magnum mit einer chirurgischen Schere und setzen Sie das Gehirn.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Verfahren mit den Leitlinien des Organs im Einklang steht.
    3. Entfernen Sie das Gehirn und legen Sie es auf eine Filtermembran in einer eiskalten Petrischale, die mit ACSF gefüllt ist.
    4. Trennen Sie die Hemisphären und führen Sie einen parasagittalen Schnitt in einem Winkel von 45° durch. Fix eine Hemisphäre im Vibramgewebe Stadium mit Superkleber. Den Gewebeblock sofort in das Vibrammebad mit eiskaltem ACSF (mit 5% CO2/95% O2) überführen. Richten Sie schließlich das Gewebe aus. Halten Sie die zweite Hemisphäre in eiskaltem ACSF bis zum Schneiden.
    5. Passen Sie das Vibratome an, um Scheiben auf 250-400 m zu schneiden. Das Schneiden bei 250 m ergibt etwa 12 Scheiben pro Tier (400 m: 7 Scheiben).
    6. Nach dem Schneiden der Scheibe (Abbildung 1A), identifizieren Sie die Hippocampus-Bildung anhand ihres typischen morphologischen Aussehens (Abbildung 1) und isolieren Sie sie mit hypodermischen Nadeln (23 Gauge, 1"), wobei der Teil der Großhirnrinde neben dem Hippocampus bleibt.
      HINWEIS: Die Erhaltung des Neocortex während der Kultivierung trägt dazu bei, die Integrität des Hippocampus zu erhalten. Der Hippocampus kann jedoch bei Bedarf ohne Kortex isoliert und kultiviert werden.
    7. Legen Sie die Scheibe auf ein Netz in erwärmt, ACSF (34 °C, mit 5% CO2/95%O2) geblasen, bis alle Scheiben gesammelt werden.
    8. Übertragen Sie die Scheiben in den laminaren Strömungsschrank, um unter sterilen Bedingungen fortzufahren.

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Abbildung 1: Repräsentative Übertragungsbilder von akuten und organotypischen Hirnscheibenpräparaten. Vergleich einer akut isolierten parasagittalen Hirnscheibe (A) und einer parasagittalen organotypischen Hirnscheibe, die 12 Tage lang in der Kultur gepflegt wurde (B) mittels Weitfeldtransluminationsmikroskopie. DG = dentate gyrus; CA1/3 = CA1/CA3-Region des Hippocampus; E-CTX = Entorhinaler Kortex; CTX = (Neo-) Kortex. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. Culturing the Slices

  1. Übertragen Sie die Scheiben aus dem ACSF vorsichtig in eine der vorgewärmten Petrischalen, die mit steriler Hank-Salzlösung gefüllt sind, mit einer invertierten sterilen Glas-Pasteur-Pipette.
    HINWEIS: Die Sterilisation des Gewebes erfolgt durch Verdünnung (Schritt 3.2). Übertragen Sie so wenig ACSF wie möglich auf die Petrischale.
  2. Die Pipette wechseln und die Scheiben in die zweite Petrischale geben. Wiederholen Sie den Vorgang insgesamt 5 Mal. Übertragen Sie so wenig HBSS wie möglich auf die folgenden Petri-Gerichte.
  3. Legen Sie vorsichtig eine Scheibe nach der anderen auf die Oberseite des Kultureinsatzes. Wiederholen Sie den Vorgang für jedes Slice. Vermeiden Sie Turbulenzen in der Pipette und warten Sie, bis die Scheibe zur Spitze der Pasteur Pipette absteigt. Man kann bis zu 4 Scheiben auf eine einzelne Membran legen.
  4. Entfernen Sie vorsichtig überschüssige Hank-Lösung von der Oberseite des Einsatzes mit einer feinen Spitze.
  5. Bewahren Sie die Kulturen (Abbildung 2) in einem Inkubator an der Schnittstelle zwischen Gas (Carbogen, 95% O2 /5%CO2) und der Flüssigkeit bei 37 °C bis zum Tag des Experiments auf. Ersetzen Sie das Medium alle 2-3 Tage.

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Abbildung 2: Prinzip der FRET-basierten ATP-Bildgebung in kultivierten organotypischen Gehirnscheiben mit dem genetisch codierten Sensor ATeam1.03YEMK. Schematische Darstellung des in dieser Arbeit vorgestellten Protokolls. Kurz gesagt, parasagittale organotypische Scheiben, die 1-3 Tage lang kultiviert wurden, werden mit einem adeno-assoziierten viralen Vektor transduziert, der entweder das astrozytenspezifische hGFAP- oder den neuronspezifischen hSyn-Promotor und die Sequenz für die Expression von ATeam1.03YEMKenthält. Verdünnte Aliquots dieser Vektoren (1:2-1:4) werden direkt auf die Oberseite einer Scheibe aufgetragen, die unter Kultivierungsbedingungen für mindestens 6 weitere Tage gepflegt wird. Veränderungen der intrazellulären ATP-Spiegel können dann in Zellen visualisiert werden, die den Sensor exemiten, indem er ihn bei 434 nm spannend wird und indem die Fluoreszenzemission gleichzeitig bei 527 (Akzeptor) und 475 (Spender) nm erreicht wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

3. Expression von ATP-Sensoren mit einem Aadeno-assoziierten Viralvektor (Abbildung 2)

HINWEIS: Achten Sie darauf, alle Anforderungen für den Umgang mit gentechnisch veränderten Organismen zu erfüllen!

  1. Um den viralen Vektor zu behandeln, aliquot adeno-assoziierte virale Vektoren (AAV2/5) bei 1-2 l, um wiederholtes Einfrieren und Auftauen zu vermeiden. Bewahren Sie die Aliquots bei -80 °C auf.
  2. Legen Sie einen Kolben mit 10 % Bleichmittel auf die sterile Bank, um alle verwendeten Reststoffe, die mit dem Vektor in Berührung kam, zu entsorgen.
  3. Für die Transduktion eine Verdünnung des Vektors um 1 l mit 2-3 l DPBS vorbereiten. Stocklösungen weisen normalerweise einen physikalischen Titer in der Größenordnung von 1012 viralen Genomen pro ml (vg/mL) auf.
  4. Übertragen Sie einen Einsatz mit einer kultivierten Scheibe in die sterile Kapuze.
  5. Ohne das Gewebe zu berühren, tragen Sie 0,5 l des verdünnten Vektors direkt auf die Oberseite jeder Scheibe auf.
    HINWEIS: Eine bessere Expression in den tieferen Schichten des Gewebes wird durch die Transdution von kultivierten Scheiben bei 1-3 Tagen in vitro (DIV) erreicht. Die Transduktion älterer Kulturen kann zu einer vorherrschenden Expression von Zellen in der umgebenden Glianarbe bzw. zu einer niedrigen Expression in Neuronen führen.
  6. Schließlich die Scheiben wieder in den Inkubator legen und mindestens 6 Tage lang pflegen. Ändern Sie das Medium am Tag der Transduktion nicht.

4. Entfernung der Glial Narbe (Abbildung 3)

  1. Kurz vor Beginn eines Experiments einen Einsatz mit kultivierten Scheiben in die sterile Kapuze geben und in eine 30 mm Schale mit 1 ml OCT-Medium oder MEM legen.
  2. Legen Sie die Schale unter das Stereoskop und konzentrieren Sie sich auf die Oberfläche der Scheibe.
  3. Verwenden Sie zwei sterile hypodermische Nadeln (23 G, 1"), um einen kurzen Querschnitt direkt an den schmalen Kanten einer ausgewählten Scheibe zu machen (Abbildung 3). Dieses Verfahren löst die Spannung in der Oberfläche, die durch die Glianarbe erzeugt wird, wodurch sie sich zurückzieht, wodurch die darunter liegenden Schichten freigelegt werden (siehe Abbildung 5).
    HINWEIS: Die erste Gewebeschicht (Glianarbe) wird hauptsächlich durch reaktive Astrozyten gebildet. In der Großfeld-Bildgebung führt diese dichte Gewebeschicht zu einer zusätzlichen Streuung des Lichts, was zu verschwommenen Bildern führt. Das Entfernen der Narbe ist daher vorteilhaft, um eine bessere Sichtbarkeit der tieferen Schichten zu erhalten, die das richtige organotypische Gewebe enthalten. Achten Sie daher darauf, diesen Schnitt ausschließlich am Rand und in der oberen Schicht der Scheibenpräparation durchzuführen und das darunter liegende Gewebe nicht zu beschädigen. Wir haben keine Unterschiede zwischen den in OTCs mit Glialnarben erhaltenen Daten und denen von narbenfreien OTCs beobachtet (Daten werden nicht angezeigt).
  4. Entfernen Sie das vorbereitete Slice aus der Einlage. Zu diesem Zweck verwenden Sie ein steriles Skalpell und verbrauchen es, indem Sie gerade parallele Schnitte zur Membran machen, ein Quadrat oder ein Dreieck mit der Scheibe in der Mitte bilden, während Sie die Ränder der Membran mit einer Pinzette halten. Wenn der Einsatz zusätzliche Scheiben enthält, übertragen Sie ihn zurück auf die Originalplatte und in den Inkubator. Die Oberflächenspannung des Mediums verhindert, dass es auf die Oberfläche der Membran austritt.

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Abbildung 3: Schematische Darstellung der mechanischen Entfernung der Glianarbe. Die Abbildung zeigt eine Hippocampus-Scheibenkultur, die von einer Glianarbe (blaues Ellipsoid) bedeckt ist. Wenn man einmal die Spitzen zweier Spritzennadeln am kleinsten Pol der Kultur und am Rand der Glianarbe (blaue gestrichelte Linie) schert, kippt die Narbe zur Seite. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

5. FRET-basierte ATP-Bildgebung (Abbildung 4)

  1. Vor dem Experiment E-ACSF vorbereiten und mit 95% O2/5%CO2 für mindestens 30 min blasen, um einen pH-Wert von 7,4 zu erhalten. Schalten Sie die Leuchtstofflichtquelle (Xenon-Lampe) des Monochromators ein (Abbildung 4). Starten Sie die Perfusion kurz vor dem Herausnehmen der Scheibe aus dem Inkubator.
    HINWEIS: Halten Sie die Salinmiten mit 95%O2 und 5%CO2 während des gesamten Experiments blasen.
  2. Übertragen Sie die Scheibe mit einer peristaltischen Pumpe in eine Versuchskammer, die ständig mit frisch kariertem E-ACSF durchforsst wird (Abbildung 4). Fixieren Sie dann das Segment mit einem Raster. Legen Sie die Kammer auf die Mikroskopstufe und verbinden Sie das Perfusionssystem. Für die Durchblutung werden gasdichte Laborschläuche empfohlen.
    HINWEIS: Experimente können bei Raumtemperatur oder bei physiologischer Temperatur durchgeführt werden, je nach versuchsweiseer Konstruktion. Überprüfen Sie die Stabilität und Zuverlässigkeit des Durchblutungsflusses, um Fokusänderungen zu vermeiden, die durch Die Bewegung des Gewebes und/oder Veränderungen der Scherspannung verursacht werden. Die Standard-Perfusionsgeschwindigkeiten für Scheibenarbeiten, die von uns und vielen anderen Laboratorien verwendet werden, sind 1,5-2,5 ml/min.

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Abbildung 4: Konfiguration des FRET-Imaging-Setups. (A) Schematische Darstellung der verschiedenen Komponenten und ihrer räumlichen Anordnung, die für die FRET-Bildgebungseinrichtung erforderlich sind. Die Anordnung besteht aus einem Monochromator mit einer Xenonlampe als Lichtquelle, einem aufrechten Feststufenmikroskop (1), einem Bildteilersystem (2), einer digitalen CCD- oder CMOS-Kamera für Zeitrafferaufnahmen (3) und einem für stabile Konstanteperfusion angepassten Versuchsbad (4). Die Badperfusion wird durch eine peristaltische Pumpe mit einstellbarer Durchflussrate realisiert. (B) Bild des experimentellen Arbeitsbereichs. Das FRET-Bildgebungs-Setup ist auf einem vibrationsgedämpften Tisch mit einer x/y-translationalen Stufe montiert, in die das Versuchsbad eingebettet ist. Zahlen: siehe (A). (C) Schematische Ansicht des Lichtwegs vom Monochromator zur Digitalkamera. Angezeigt ist die Position der verschiedenen Filter und des dichroitischen Spiegels. Zahlen: siehe (A). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

  1. Bringen Sie die kultivierte Scheibe mit Transmissionslicht in den Fokus. Identifizieren Sie den Bereich, in dem Experimente durchgeführt werden sollen (Beispiel: CA1-Region des Hippocampus). Bevor Sie mit bildgebenden Experimenten beginnen, warten Sie mindestens 15 min, damit sich die Scheiben an die salinen Bedingungen anpassen können. Die Konfiguration des Versuchsaufbaus finden Sie in Abbildung 4.
  2. Schalten Sie die Kamera und die Bildverarbeitungssoftware ein. Wählen Sie dann den richtigen Filterwürfel aus.
  3. Erregen Sie das Spenderfluoreszenzprotein (eCFP) bei 435/17 nm ( 435 nm). Stellen Sie die Belichtungszeit zwischen 40 und 90 ms ein.
    HINWEIS: Eine starke Exposition von Scheiben gegenüber dem fluoreszierenden Licht kann zu phototoxischen Wirkungen führen.
  4. Die Anregung bei 435 nm führt zu Einer Emission bei 475 nm (eCFP; Spender) und 527 nm (Venus; Akzeptor). Teilen Sie die Fluoreszenzemission bei 500 nm mit einem Emissionsbildteiler auf und verwenden Sie Bandpassfilter bei 483/32 und 542/27, um die Spender- und Akzeptorfluoreszenz weiter zu isolieren. Starke Expression kann zu einer Sättigung der Detektoren führen. In diesem Fall können Sie einen Neutraldichtefilter verwenden, um die Intensität der Anregung zu reduzieren.
  5. Wählen Sie eine Region von Interesse (ROI) scheinbar ohne zelluläre Fluoreszenz für Hintergrundsubtraktion. Erstellen Sie dann ROIs, die Zellkörper abbilden.
  6. Legen Sie die Häufigkeit der Bildaufnahme und die Gesamtaufnahmezeit fest. Für lange (>30 min) Experimente wird eine Erfassungshäufigkeit von 0,2-0,5 Hz empfohlen, um Phototoxizität zu verhindern.
  7. Starten Sie die Aufzeichnung. Es wird empfohlen, mindestens 5 min unter Basisbedingungen aufzunehmen, um die Stabilität der Zubereitung zu gewährleisten.
    HINWEIS: Passen Sie den Fokus der Zelle während der Aufnahme bei Bedarf an.
  8. Um Veränderungen im intrazellulären ATP zu induzieren, übertragen Sie das Perfusionsrohr von Standard-ACSF auf eine Saline, die metabolische Inhibitoren enthält (z. B. CIS, siehe Tabelle 1 und unten). Alternativ können Sie eine Saline mit erhöhter Kaliumkonzentration verwenden, um die Freisetzung von Kalium aus aktiven Neuronen nachzuahmen.
    HINWEIS: Die Anwendung durch Badperfusion ist ein relativ langsamer Prozess, der global auf die gesamte Zubereitung wirkt. Beachten Sie die Zeit, zu der die neue Lösung tatsächlich in das Versuchsbad eintrat. Je nach Abstand zwischen Kammer und Stausee der Strandlinie sowie der Geschwindigkeit der Perfusion ist eine Verzögerungszeit zu berücksichtigen.

6. Hochauflösende Dokumentation der zellulären ATeam Fluoreszenz

  1. Übertragen Sie direkt nach den Aufnahmen die Aufnahmekammer mit der Scheibenkultur an das konfokale Laserscanmikroskop.
    HINWEIS: Seien Sie besonders vorsichtig. Aufgrund möglicher Photoschäden führen Sie diesen Schritt erst nach Experimenten durch. Zu Dokumentationszwecken kann man den E-ACSF gegen H-ACSF austauschen. Daher ist ein Perfusionssystem nicht unbedingt erforderlich.
  2. Nehmen Sie z-Stacks mit der höchsten z Auflösung, die bei der angegebenen optischen Konfiguration möglich ist.
  3. Wenden Sie einen Dekonvolutionalgorithmus an, um die Bildauflösung zu erhöhen.

Ergebnisse

AAV-Vektoren sind ein zuverlässiges Werkzeug, um fremde Gene in Zellen innerhalb lebenden Gewebes selektiv auszudrücken16. Die direkte Anwendung von AAVs, die die Sequenzkassette von ATeam1.03YEMK und einen bestimmten Promotor enthalten, führt zu einem hohen Ausdruck des Sensors im gewählten Zelltyp. Bei DIV 14 (ca. 10 Tage nach einer Transduktion) werden Neuronen, die ATeam unter dem menschlichen Synapsinpromotor exzessiieren, mit hoher Dichte im Neocortex kultivierter Gewebescheiben in Tiefen von bis zu 50 m unter der Schnittoberfläche gefunden (Abbildung 5A). Vergleichbare Ergebnisse können im Hippocampus erzielt werden (Abbildung 5B).

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Abbildung 5: Visualisierung von Neuronen, die ATeam1.03YEMK in kultivierten parasagittalen organotypischen Gehirnscheiben exdrücken. Die Bilder auf der linken Seite entsprechen erweiterten Fokusprojektionen von 43 optischen Abschnitten (je 1,05 m) kortikalen Gewebes (A) und (B) von 70 optischen Abschnitten (je 0,6 m) Hippocampusgewebe. Bilder auf der rechten Seite stellen die Lautstärkeansicht derselben Projektion dar. Zellen werden entsprechend ihrer Tiefe relativ zur Schnittfläche farbcodiert, wie durch die Farbskala auf der rechten Seite angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Für die Messung des ATP-Spiegels in Astrozyten wird ATeam1.03YEMK unter der Kontrolle des humanen glialfibrillären sauren Proteins (GFAP) promotorisiert. Dies führt zu einer effizienten Transduktion von Zellen in Neocortex und Hippocampus von kultivierten Gewebescheiben (Abbildung 6). Insbesondere können je nach Tiefe der Scheibenpräparate zwei verschiedene morphologische Phänotypen unterschieden werden. In der ersten, oberflächlichen Schicht zeichnen sich Zellen durch dicke Primärprozesse aus, die überwiegend parallel zur Oberfläche angeordnet sind. Diese Zellen weisen stark überlappende Domänen auf, wodurch ein dichtes Netz scheinbar reaktiver Astrozyten entsteht (Abbildung 6). In tieferen Schichten (30-60 m von der Oberfläche) zeigen transduzierte Astrozyten feine zelluläre Prozesse, die weitgehend sphärische Domänen bilden, und ihre Morphologie ähnelt der von Astrozyten in situ, wie zuvor berichtet19,20,21 ( Abbildung6). Um eine bessere Transduktion von tieferen Astrozyten sowie einen besseren optischen Zugang zu diesen tieferen Schichten zu erhalten, kann das gliale Narbengewebe entfernt werden, wie in Schritt 4 beschrieben.

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Abbildung 6: Visualisierung von Astrozyten, die ATeam1.03YEMK in kultivierten parasagittalen organotypischen Gehirnscheiben exdrücken. Das Bild auf der linken Seite entspricht einer erweiterten Fokusprojektion von 191 optischen Abschnitten (je 0,45 m). Zur Veranschaulichung wurde die Glianarbe von der Projektion von Astrozyten ausgeschlossen. Bilder auf der rechten Seite stellen die Lautstärkeansicht derselben Projektion vor und nach dem Entfernen der Glianarbe dar. Zellen werden entsprechend ihrer Tiefe relativ zur Schnittfläche farbcodiert, wie durch die Farbskalen auf der rechten Seite angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die erfolgreiche Expression von ATeam1.03YEMK ermöglicht die dynamische Messung von Veränderungen der ATP-Spiegel in Neuronen oder Astrozyten, abhängig vom verwendeten Promotor (siehe oben). Experimente wurden in einem Versuchsbad durchgeführt, das ständig mit E-ACSF durchdrungen ist (mit 95% O2/5%CO2). In organotypischen Scheiben, die ATeam1.03YEMK in Hippocampus-Neuronen exdrücken, wurden vor Beginn der Aufnahme Interessensgebiete (ROIs) ausgewählt, die die Somata von Pyramidenzellen darstellen (Abbildung 7A). Darüber hinaus wurde eine Region für Hintergrundsubtraktion ausgewählt (Abbildung 7A). Die Emission von Venus sowie eCFP-Fluoreszenz wurde dann für jeden dieser ROIs separat erhoben und im Laufe der Zeit als Fluoreszenzemissionsniveau dargestellt (Abbildung 7B). Nach der Aufzeichnung der Fluoreszenz unter Kontrollbedingungen für mehrere Minuten, um eine stabile Ausgangsbasis zu gewährleisten, wurde der Zellstoffwechsel durch die Exposition der Scheibenzubereitung einer glukosefreien Kochsaline gehemmt, der 5 mM Natriumazid (NaN3) für eine Minute zugesetzt wurde (Abbildung 7B). Diese Manipulation führte zu gegenteiligen Veränderungen der Emissionsintensität des FRET-Paares(Abbildung 7B, linke Paneele), mit einer Abnahme der Venus (527 nm) und einer Erhöhung der eCFP-Emission (475 nm). Die Berechnung des FRET-Verhältnisses durch Division der Fluoreszenzemission der Venus durch die von eCFP (FVenus/FeCFP) führte zu Signalen, die die relativen Veränderungen der intrazellulären ATP-Werte widerspiegeln, das sogenannte "ATeam FRET-Verhältnis"(Abbildung 7B, rechtes Panel). In allen aufgezeichneten Neuronen (n = 70 Zellen in N = 5 Scheiben) verursachte NaN3 eine reversible Abnahme des ATeam FRET-Verhältnisses, was auf eine reversible Abnahme der intrazellulären ATP-Spiegel bei Hemmung des Zellstoffwechsels hindeutet.

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Abbildung 7: Demonstration der Zeitraffer-ATeam FRET-Verhältnis-Bildgebung. (A) Oben links: Weitfeldfluoreszenzbild der Pyramidenschicht und des Stratum radiatum der CA1-Region einer kultivierten organotypischen Hippocampusscheibe, die ATeam1.03YEMK in Neuronen ausdrückt. Oben rechts: Vergrößerte Ansicht des Geschachtelten, wie auf der linken Seite angegeben. Weiße Linien umreißen Interessengebiete (ROIs) 1-3, die Zellkörper von CA1-Pyramidenneuronen darstellen, die für die Analyse in ausgewählt wurden (B). BG stellt den ROI dar, der für die Hintergrundkorrektur ausgewählt wurde. Unten: Pseudofarbene Bilder, die die Fluoreszenzemission von Venus (grün), eCFP (lila) und das Verhältnis von Venus/eCFP darstellen. (B) Zeitrafferaufzeichnung in ROIs 1-3, die neuronale Zellkörper darstellen (siehe A). Spuren auf der linken Seite zeigen eine normalisierte Fluoreszenzemission von Venus (grün) und eCFP (Magenta). Spuren auf der rechten Seite zeigen das entsprechende ATeam FRET Verhältnis. Beachten Sie, dass eine Perfusion mit 5 mM NaN3 in Abwesenheit von extrazellulärer Glukose für 1 Minute (grauer Balken) eine reversible Abnahme des ATeam FRET-Verhältnisses induziert, was auf eine Abnahme der intrazellulären ATP-Konzentration hindeutet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Um die Stabilität der Präparation und des Sensors unter langfristigen Versuchsbedingungen zu gewährleisten, wurden Scheiben, die ATeam in Neuronen oder Astrozyten exexzessiver exemitzen, über längere Zeiträume ständig mit ACSF durchdrungen (>50 min; n = 12 Zellen, N = 3 OTCs aus 3 Gehirnen). Unter diesen Bedingungen hat sich das ATeam FRET-Verhältnis nicht geändert (Abbildung 8). Die Exposition der Präparate gegenüber CIS, die metabolische Inhibitoren enthalten ("Chemische Ischämie", siehe Tabelle 1), führte dagegen erneut zu einem erwarteten Rückgang des ATeam-FRET-Verhältnisses, wie oben beobachtet.

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Abbildung 8: Basisexperimente mit ATeam. Langfristige ATeam FRET-Verhältnis-Bildgebung in 14 verschiedenen Zellen unter Ausgangsbedingungen in Neuronen (oben) und Astrozyten (unten). Die Daten wurden unter vergleichbaren Bedingungen wie andere experimentelle Daten entnommen. Am Ende jeder Messung wurde chemische Ischämie durch Perfusion mit GUS ausgelöst, wie durch den Pfeil angegeben. HINWEIS: Die Basis-ATeam-FRET-Verhältnisse sind unter Basisbedingungen im Zeitverlauf stabil. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Als nächstes analysierten wir die Reaktionen von Neuronen und Astrozyten, die ATeam1.03YEMK auf eine Erhöhung der extrazellulären Kaliumkonzentration ausdrücken. Nach der Festlegung einer stabilen Ausgangsbasis wurden neuronen mit einer Saline durchdrungen, bei der die Kaliumkonzentration für 3 Minuten von 3 auf 8 mM erhöht wurde(Abbildung 9A). Diese Manipulation hat jedoch nicht zu einer nachweisbaren Änderung des ATeam FRET-Verhältnisses geführt (n = 56 Zellen in N = 5 Slices). Um sicherzustellen, dass der Sensor auf eine Änderung der ATP-Werte reagierte, wurden die Scheiben dann wieder einer anhaltenden Periode chemischer Ischämie ausgesetzt, die durch den Ersatz von E-ACSF durch CIS ausgelöst wurde. Chemische Ischämie führte zu einem schnellen Rückgang des ATeam FRET-Verhältnisses auf ein neues, stabiles Niveau, was auf eine nominale Erschöpfung des ATP nach 2-3 min hindeutet (Abbildung 9A).

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Abbildung 9: Repräsentative Experimente zur Veranschaulichung von Veränderungen des ATP-Spiegels in Neuronen und Astrozyten. (A,B): Bilder auf der linken Seite zeigen ATeam Fluoreszenz von Neuronen und Astrozyten im Hippocampus CA1 Region von organotypischen Scheiben. Spuren auf der rechten Seite stellen Zeitrafferaufzeichnungen des ATeam FRET-Verhältnisses dar, die aus einem ROI gewonnen werden, der über einem einzelnen Zellkörper positioniert ist. In beiden Experimenten wurden die Scheiben zunächst 3 Minuten lang einer Erhöhung der extrazellulären Kaliumkonzentration unterzogen (siehe Bar), gefolgt von einer endgültigen Exposition gegenüber chemischer Ischämie. Beachten Sie, dass, während Neuronen nicht auf die Erhöhung des extrazellulären Kaliums (A) reagieren, reagieren Astrozyten mit einer Erhöhung der ATP (B). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Das gleiche experimentelle Protokoll wurde mit Slices durchgeführt, in denen ATeam1.03YEMK in Astrozyten ausgedrückt wurde. Im Gegensatz zu dem, was in Neuronen beobachtet wurde, reagierten Astrozyten auf die Zunahme des extrazellulären Kaliums durch eine reversible Erhöhung des ATeam FRET-Verhältnisses, was auf einen Anstieg der intrazellulären ATP-Spiegel hindeutet (n = 70 Zellen in N = 5 Scheiben) (Abbildung 9B). Die anschließende Exposition gegenüber chemischer Ischämie führte erwartungsgemäß zu einem starken Rückgang des ATeam-FRET-Verhältnisses, was auf eine nominale Erschöpfung des intrazellulären ATP hindeutet (Abbildung 9B).

Diskussion

Hier zeigen wir ein Verfahren zur zelltypspezifischen Expression von ATeam1.03YEMK, einem FRET-basierten, genetisch kodierten Nanosensor14, zur Messung von Veränderungen der ATP-Spiegel in Astrozyten oder Neuronen in organotypischen Gewebescheibenkulturen des Maushirns15. In beispielhaften Aufnahmen zeigen wir, dass eine Erhöhung der extrazellulären Kaliumkonzentration nicht zu einer Veränderung der ATP-Konzentrationen in Neuronen führt, während die astrozytischen ATP-Spiegel als Reaktion auf diese Manipulation steigen. Darüber hinaus zeigen unsere Ergebnisse, dass bei Hemmung des Zellstoffwechsels das ATeam1.03YEMK FRET-Verhältnis bei beiden Zelltypen rapide abnimmt, was auf eine schnelle Abnahme des intrazellulären ATP hindeutet.

Die Expression von ATeam1.03YEMK in organotypischen Scheibenkulturen erfordert die Erhaltung des Gewebes in der Kultur unter kontrollierten Bedingungen für mindestens 7-10 Tage. Alternativ kann ATeam1.03YEMK auch zur Messung von ATP in akut isolierten Hirngewebescheiben und in Sehnerven von Mäusen13,15eingesetzt werden. Messungen in akut isoliertem Gewebe erfordern jedoch die Erzeugung transgener Tiere oder eine stereotaktische Anwendung viraler Vektoren in das Gehirn, die Tierversuche und strenge Tierpflegeprotokolle beinhalten. In dieser Hinsicht stellt die ATeam1.03YEMK-Expression in organotypischen Gewebescheibenkulturen eine nützliche und wertvolle Alternative22,23dar. Seit vielen Jahren dienen organotypische Gewebescheibenkulturen als etabliertes Modellsystem zur Untersuchung neuronaler Eigenschaften, Konnektivität und Entwicklung24,25,26. Sie erhalten nicht nur die allgemeine Gewebearchitektur und Laminierung (Abbildung 1), sondern beherbergen auch die bevorzugten Eigenschaften von Zellkulturen wie überlegene Zugänglichkeit und direkte Kontrolle experimenteller Bedingungen. Organotypische Gewebescheibenkulturen werden auch routinemäßig verwendet, um fremde Gene mit viralen Vektoren auszudrücken27. Mehrere Arten von viralen Vektoren wurden berichtet, transgenes in Gehirngewebe zu liefern16,28. Adenovirale Vektoren induzieren eine hohe Expression in Gliazellen, aber nicht Hippocampus-Neuronen16, und könnte gliare Reaktivität erzeugen17. Adeno-assoziierte virale Vektoren, wie hier verwendet, erscheinen als eine gute Alternative15, und ihre Wirksamkeit wurde auch in vivo29gezeigt.

Während vor allem für die Untersuchung der neuronalen Eigenschaften verwendet, neuere Studien haben festgestellt, dass organotypische Gewebe-Scheibenkulturen auch für die Analyse von Astrozyten verwendet werden können. Kultivierte Scheiben werden in der Regel von einer Schicht reaktiver Astrozyten19,30 (Abbildung 5) abgedeckt, aber Astrozyten zeigen eine nativere, nicht-reaktive Morphologie und Zytoarchitektur in tieferen Schichten19,30 (Abbildung 5). In der vorliegenden Studie beschreiben wir ein Verfahren zur mechanischen Entfernung der äußeren Glianarbe, das zu einer besseren experimentellen und optischen Zugänglichkeit einheimischer Astrozyten innerhalb der richtigen organotypischen Gewebeschichten führt. Darüber hinaus verbessert seine Entfernung die Expression Wirksamkeit in tieferen Schichten der organotypischen Scheiben; Wenn die Glianarbe nicht entfernt wird, kann die Transduktion durch AAVs auf die oberflächlichen Zellschichten beschränkt sein.

Bei der Durchführung von Experimenten in Gewebescheiben müssen mehrere externe mechanische Faktoren berücksichtigt werden. Eine Variation der Durchblutungsgeschwindigkeit des Bades kann Bewegungen der gesamten Zubereitung auslösen und/oder Fokusänderungen auslösen, was zu künstlichen transienten Veränderungen des Sensorsignals führt. Darüber hinaus wurden sowohl Astrozyten als auch Neuronen berichtet, um auf mechanische Verformungen zu reagieren, wie durch hohe Perfusionsratenauferlegt 32,33. In unseren Händen führt die Verwendung einer zuverlässigen Peristaltikpumpe zusammen mit der Aufrechterhaltung kleiner und stabiler Mengen an Saline zwischen Gewebe und Ziel (Meniskus) zu einem stabilen FRET-Signal unter Ausgangsbedingungen bei der hier verwendeten Perfusionsgeschwindigkeit (1,5-2,5 ml/min; Abbildung 8).

In der vorliegenden Studie zeigen wir auch, dass FRET-basierte Bildgebung mit ATeam1.03YEMK zur Überwachung des ATP-Spiegels in Neuronen und Astrozyten eingesetzt werden kann. Ein alternatives Mittel, das früher für die Messung der zellulären ATP eingeführt wurde, ist der sogenannte Luziferin-Luziferase-Assay34,35,36,37. Dieser Ansatz basiert jedoch auf der Abbildung der Biolumineszenz und bietet nur eine eher geringe zeitliche und räumliche Auflösung, teilweise aufgrund hoher Hintergrundgeräusche. Eine weitere Methode, die in den letzten Jahren routinemäßig angewandt wurde, war die Abbildung von Veränderungen der intrazellulären Magnesiumkonzentration mit dem ionenempfindlichen Fluorophor Magnesium grün38,39,40. Dieser Ansatz bezieht sich auf die Beobachtung, dass ein ATP-Verbrauch zur Freisetzung seines Co-Faktors Magnesium führt. Die Bildgebung mit Magnesiumgrün liefert dabei nur eine sekundäre Schätzung der Veränderungen der ATP-Werte. Darüber hinaus ist Magnesiumgrün auch empfindlich gegenüber Veränderungen des intrazellulären Kalziums, was eine weitere Schwierigkeit bei der Interpretation der mit dieser Methode erzielten Ergebnisse einführt.

Die jüngste Entwicklung von genetisch kodierten Nanosensoren zur direkten Bildgebung zellulärer Metaboliten stellte daher einen großen Schritt nach vorn dar11,12. Es wurden verschiedene Sensoren erzeugt, die zur Messung von intrazellulären ATP36,41,42,43eingesetzt werden können. Dazu gehören der ratiometrische fluoreszierende ATP-Indikator "QUEEN"41 sowie PercevalHR, der das ATP:ADP-Verhältnis42erkennt. Die letztgenannte Sonde ist zwar ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung des Energiestatus von Zellen, erfordert aber eine gleichzeitige Messung von Veränderungen des pH42.

ATeam ist ein Nanosensor, von dem es mehrere Varianten gibt, die sich unter anderem in ihrer Bindungsaffinität zu ATP14unterscheiden. In vitro weist ATeam1.03YEMK ein Kd von 1,2 mM bei 37 °C auf, das in der Nähe von zellulären ATP-Spiegeln liegt, die in verschiedenen neuronalen Zelltypen bestimmt sind und von Hypothalamus und Kleinhirn34 bis Hippocampus37,44,45. Bei Küvettenmessungen führte die Senkung der Temperatur um 10 °C zu einer signifikanten Abnahme der Bindungsaffinität von ATeam1.03YEMK zu ATP, was darauf hindeutet, dass es möglicherweise nicht ideal für die zelluläre Bildgebung bei Raumtemperatur14ist. Unsere frühere Studie15zeigte jedoch, dass das Verhalten und die Reaktion von ATeam1.03YEMK, ausgedrückt in Neuronen und Astrozyten, bei verschiedenen Manipulationen bei nahezu physiologischen und Raumtemperatur ähnlich ist, was darauf hindeutet, dass der Sensor eine zuverlässige Bestimmung der intrazellulären ATP-Spiegel unter beiden Bedingungen ermöglicht. Darüber hinaus befassten sich unsere früheren Experimente mit der pH-Empfindlichkeit von ATeam1.03YEMK in Zellen15, was zeigte, dass es unempfindlich gegen Veränderungen der intrazellulären pH-Einheiten um etwa 0,1-0,2 pH-Einheiten ist. Wenn das Kd im niedrigen mM-Bereich ein Problem ist, könnten alternative ATeam-Varianten14verwendet werden, darunter rot verschobene Varianten von ATeam ("GO-ATeam")43.

Unsere Experimente mit ATeam1.03YEMK zeigen, dass eine Erhöhung der extrazellulären Kaliumkonzentration nur um wenige mM (von 3 auf 8 mM) zu einer vorübergehenden Erhöhung des ATeam1.03YEMK-Verhältnisses in Astrozyten in der organotypischen Scheibenkultur führt. Diese Beobachtung bestätigt frühere Studien15,46 und zeigt deutlich, dass Astrozyten auf die Freisetzung von Kalium durch aktive Neuronen mit einer Erhöhung ihrer ATP-Produktion reagieren, meist wahrscheinlich als Folge einer Stimulation der Na+/K+-ATPase und der Na+/HCO3- Cotransporter, bzw.47,48. Im Gegensatz dazu zeigten Neuronen keine Antwort, die auch mit früheren Arbeiten im Einklang steht15. Beide Zelltypen reagierten jedoch schnell und stark auf die Hemmung der zellulären Glykolyse und der mitochondrialen Atmung, wie vor15gezeigt. Unter den Bedingungen der chemischen Ischämie fielen die ATeam FRET-Verhältnisse auf ein neues stabiles Niveau, was auf eine nominale Erschöpfung des zellulären ATP hindeutet. Das letztgenannte Ergebnis legt nahe, dass sowohl Neuronen als auch Astrozyten einen relevanten ATP-Verbrauch auch unter stationären Bedingungen ohne zusätzliche Stimulation durch synaptische Aktivierung oder Anwendung von Neurotransmittern aufweisen. Zusammengenommen kommen wir zu dem Schluss, dass FRET-basierte Bildgebung mit genetisch kodierten Nanosensoren, darunter ATeam1.03YEMK, einen wertvollen Ansatz bieten wird, um die zellulären Prozesse aufzuklären, die für Veränderungen der intrazellulären ATP-Spiegel und den zellulären ATP-Verbrauch unter verschiedenen Bedingungen verantwortlich sind.

Offenlegungen

Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen. Die Autoren erhielten finanzielle Unterstützung für die Open-Access-Publikation von Nikon Microscope Solutions, Düsseldorf, Deutschland, die Instrumente produziert, die im Videoartikel verwendet werden. Das Unternehmen war weder an der Gestaltung der hier vorgestellten Experimente, noch an deren Ausführung, an der Datenverarbeitung, noch an der Manuskriptschrift beteiligt.

Danksagungen

Die Autoren bedanken sich bei Claudia Roderigo und Simone Durry für die fachkundige technische Unterstützung. Wir danken Dr. Niklas J. Gerkau und M.Sc. Joel Nelson für die Unterstützung bei der Vorbereitung der organotypischen Scheibenkulturen. Die Forschung im Autorenlabor wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG; FÜR 2795: Ro 2327/13-1 und SPP 1757: Ro 2327/8-2 zu CRR; und SPP 1757: Young Glia Start-Up-Förderung an RL).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2-DesoxyglucoseAlfa AesarL07338Nicht metabolisierbares Glukoseanalogon
36-IMA-410-019 ArgonlaserMelles Griot488 nm Wellenlänge Argon
AscorbinsäureCarl Roth3525.1Antioxidationsmittel, Vitamin C
Bandpassfilter 483/32AHF Analysentechnik AGSplitter kompatible
Emissionsfilter Bandpassfilter 542/27AHF Analysentechnik AGSplitter kompatibler Emissionsfilter
Strahlteiler T 455 LPAHF Analysentechnik AGAnregungsdichroitischer Spiegel
Strahlteiler T 505 LPXRAHF Analysentechnik AGSplitter dichroitisches
konfokales Laser-Scannigmikroskop C1Nikon Microscope SolutionsModulares konfokales Mikroskopsystem C1
Datenverarbeitung Origin Pro 9.0.0 (64-bit)OriginLab CorporationWissenschaftliche Grafik- und Datenanalysesoftware
D-Glukose-MonohydratCaelo2580-1kg
DPBSGIBCO/Life14190250Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung
Eclipse E 600FN aufrechtes MikroskopNikon Microscope Solutions
Eclipse FN1 aufrecht MikroskopNikon Microscope Solutions
Experimentierkammernach MaßPerfusionskammer für die Bildgebung lebender Zellen
EZ-C1 Silver Version 3.91Nikon Microscope SolutionsBildgebungssoftware für konfokale
Mikroskope Hanks' Balanced Salt LösungSigma-AldrichH9394mit Phenolrot für die pH-Überwachung
HERAcell 150Thermo ScientificCO2-Inkubator HERAcell ® 150 mit Dekontaminationsroutine
HERAsafe KS/KSPThermo ScientificSicherheitswerkbank
PferdeserumGIBCO/Life26050088Hitzeinaktiviert
Huygens ProfessionalSVI ImagingDekonvolutionssoftware
Image J 1.52iWayne Rasban National Institute of HealthBildverarbeitungssoftware öffentlich verfügbar
InsulinSigma-AldrichI6634Insulin aus der Bauchspeicheldrüse
IP-Serie SchlauchpumpeIsmatecHochpräzise Mehrkanalpumpe
Layout-Software, Illustrator CS6AdobeVektorgrafik-Editor
L-GlutaminGIBCO/Life
Microm HM 650 VThermo ScientificVibrationsmikrotom. Thermo Scientific hat die Produktion des Gerätes zwischenzeitlich eingestellt. Jeder andere Slicer oder Tissue-Chopper, der zum Schneiden von lebendem Gewebe geeignet ist, ist ebenfalls in Ordnung.
Mikroskoptischnach Maß
Microsoft Excel 16MicrosoftTabellenkalkulationssoftware für die grundlegende Datenverarbeitung
Millicell-KultureinsatzMerck MilliporePICM0RG50Hydrophiliertes PTFE, Porengröße 0,4 μ m
Minimum Essential Medium EagleSigma-AldrichM7278Synthetische Zellkulturmedien
Monochromator Polychrome VThermo Scientific/FEIUltraschnell schaltender
Monochromator NaN3 (Natriumazid)Sigma-AldrichS-8032Mitochondrialer Inhibitor (komplexer IV-Inhibitor). ACHTUNG: Azid ist giftig. Achten Sie darauf, es nicht versehentlich zu verschlucken oder einzuatmen, und verhindern Sie eine Absion durch die Haut.
Nikon Fluor 40x / 0.80 W DIC M ∞/0 WD 2.0Nikon Microscope SolutionsWasser-Immersionsmikroskop Objektiv
NIS Elements 4.50 advanced ResearchNikon Microscope SolutionsImaging Software. Aktualisierte Version für FRET-Bildgebung
ORCA-Flash4.0Hamamatsu PhotonicsDigital CMOS Kamera
PerfusionsschlauchPro Liquid GmbHTygon Schlauch, 1,52 x 322 mm (Wd: 0,85)
Photoshop CS 6 Version 13.0AdobeBildbearbeitungssoftware
Natrium L-LaktatSigma-Aldrich71718-10G
ssAAV-2/2- hSyn1-ATeam1.03YEMK-WPRE-hGHp(A)ETH Zü reichhaltigerv244Einzelsträngiger AAV-Vektor, der die Expression von ATeam1.03YEMK unter der Kontrolle des humanen Synapsin-1-Promotorfragments hSyn1 induziert.
ssAAV-5/2-hGFAP-hHBbI/E-ATeam1.03YEMK-WPRE-bGHp(A)ETH Zü reichhaltigerv307-einzelsträngiger AAV-Vektor, der die Expression von ATeam1.03YEMK unter der Kontrolle des humanen sauren Gliafibrillenprotein-Promotorfragments ABC1D induziert.
WVIEW GEMINI OptiksystemHamamatsu PhotonicsEmission Image Splitter
25030024

Referenzen

  1. Sweadner, K. J. Isozymes of the Na+/K+-ATPase. Biochimica et Biophysica Acta. 988, 185-220 (1989).
  2. Clapham, D. E. Calcium signaling. Cell. 131, 1047-1058 (2007).
  3. Cotter, K., Stransky, L., McGuire, C., Forgac, M. Recent Insights into the Structure, Regulation, and Function of the V-ATPases. Trends in Biochemical Sciences. 40, 611-622 (2015).
  4. Harris, J. J., Jolivet, R., Attwell, D. Synaptic energy use and supply. Neuron. 75, 762-777 (2012).
  5. Brown, A. M., Ransom, B. R. Astrocyte glycogen and brain energy metabolism. Glia. 55, 1263-1271 (2007).
  6. Hertz, L., et al. Roles of astrocytic Na+,K+-ATPase and glycogenolysis for K+ homeostasis in mammalian brain. Journal of Neuroscience Research. 93, 1019-1030 (2015).
  7. Allaman, I., Belanger, M., Magistretti, P. J. Astrocyte-neuron metabolic relationships: For better and for worse. Trends in Neurosciences. 34, 76-87 (2011).
  8. Barros, L. F., Deitmer, J. W. Glucose and lactate supply to the synapse. Brain Research Reviews. 63, 149-159 (2010).
  9. Diaz-Garcia, C. M., et al. Neuronal Stimulation Triggers Neuronal Glycolysis and Not Lactate Uptake. Cell Metabolism. 26, 361-374 (2017).
  10. Diaz-Garcia, C. M., et al. Quantitative in vivo imaging of neuronal glucose concentrations with a genetically encoded fluorescence lifetime sensor. Journal of Neuroscience Research. 97, 946-960 (2019).
  11. Barros, L. F., et al. Current technical approaches to brain energy metabolism. Glia. 66, 1138-1159 (2018).
  12. Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. Optogenetic reporters: Fluorescent protein-based genetically encoded indicators of signaling and metabolism in the brain. Progress in Brain Research. 196, 235-263 (2012).
  13. Trevisiol, A., et al. Monitoring ATP dynamics in electrically active white matter tracts. eLife. 6, e24241(2017).
  14. Imamura, H., et al. Visualization of ATP levels inside single living cells with fluorescence resonance energy transfer-based genetically encoded indicators. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 15651-15656 (2009).
  15. Lerchundi, R., et al. FRET-based imaging of intracellular ATP in organotypic brain slices. Journal of Neuroscience Research. , 1-13 (2018).
  16. Ehrengruber, M. U., et al. Gene transfer into neurons from hippocampal slices: comparison of recombinant Semliki Forest Virus, adenovirus, adeno-associated virus, lentivirus, and measles virus. Molecular and Cellular Neurosciences. 17, 855-871 (2001).
  17. Woo, J., et al. Functional Characterization of Resting and Adenovirus-Induced Reactive Astrocytes in Three-Dimensional Culture. Experimental Neurobiology. 26, 158-167 (2017).
  18. Close, B., et al. Recommendations for euthanasia of experimental animals: Part 2. DGXT of the European Commission. Laboratory Animals. 31, 1-32 (1997).
  19. Benediktsson, A. M., Schachtele, S. J., Green, S. H., Dailey, M. E. Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures. Journal of Neuroscience Methods. 141, 41-53 (2005).
  20. Lanjakornsiripan, D., et al. Layer-specific morphological and molecular differences in neocortical astrocytes and their dependence on neuronal layers. Nature Communications. 9, 1623(2018).
  21. Bushong, E. A., Martone, M. E., Ellisman, M. H. Examination of the relationship between astrocyte morphology and laminar boundaries in the molecular layer of adult dentate gyrus. The Journal of Comparative Neurology. 462, 241-251 (2003).
  22. Frotscher, M., Zafirov, S., Heimrich, B. Development of identified neuronal types and of specific synaptic connections in slice cultures of rat hippocampus. Progress in Neurobiology. 45, vii-xxviii (1995).
  23. Galimberti, I., et al. Long-term rearrangements of hippocampal mossy fiber terminal connectivity in the adult regulated by experience. Neuron. 50, 749-763 (2006).
  24. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37, 173-182 (1991).
  25. Forster, E., Zhao, S., Frotscher, M. Laminating the hippocampus. Nature Reviews. Neuroscience. 7, 259-267 (2006).
  26. Holopainen, I. E. Organotypic Hippocampal Slice Cultures: A Model System to Study Basic Cellular and Molecular Mechanisms of Neuronal Cell Death, Neuroprotection, and Synaptic Plasticity. Neurochemical Research. 30, 1521-1528 (2005).
  27. Teschemacher, A. G., et al. Targeting specific neuronal populations using adeno- and lentiviral vectors: applications for imaging and studies of cell function. Experimental Physiology. 90, 61-69 (2005).
  28. Kantor, B., Bailey, R. M., Wimberly, K., Kalburgi, S. N., Gray, S. J. Methods for gene transfer to the central nervous system. Advances in Genetics. 87, 125-197 (2014).
  29. Mächler, P., et al. In Vivo Evidence for a Lactate Gradient from Astrocytes to Neurons. Cell Metabolism. 23, 94-102 (2016).
  30. Schreiner, A. E., Berlinger, E., Langer, J., Kafitz, K. W., Rose, C. R. Lesion-Induced Alterations in Astrocyte Glutamate Transporter Expression and Function in the Hippocampus. ISRN Neurology. 2013, 893605(2013).
  31. Haber, M., Zhou, L., Murai, K. K. Cooperative astrocyte and dendritic spine dynamics at hippocampal excitatory synapses. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 8881-8891 (2006).
  32. Neary, J. T., Kang, Y., Tran, M., Feld, J. Traumatic injury activates protein kinase B/Akt in cultured astrocytes: role of extracellular ATP and P2 purinergic receptors. Journal of Neurotrauma. 22, 491-500 (2005).
  33. Xia, J., et al. Neurons respond directly to mechanical deformation with pannexin-mediated ATP release and autostimulation of P2X7 receptors. The Journal of Physiology. 590, 2285-2304 (2012).
  34. Ainscow, E. K., Mirshamsi, S., Tang, T., Ashford, M. L., Rutter, G. A. Dynamic imaging of free cytosolic ATP concentration during fuel sensing by rat hypothalamic neurones: evidence for ATP-independent control of ATP-sensitive K+ channels. The Journal of Physiology. 544, 429-445 (2002).
  35. Arcuino, G., et al. Intercellular calcium signaling mediated by point-source burst release of ATP. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 9840-9845 (2002).
  36. Rajendran, M., Dane, E., Conley, J., Tantama, M. Imaging Adenosine Triphosphate (ATP). The Biological Bulletin. 231, 73-84 (2016).
  37. Rangaraju, V., Calloway, N., Ryan, T. A. Activity-driven local ATP synthesis is required for synaptic function. Cell. 156, 825-835 (2014).
  38. Chatton, J. Y., Pellerin, L., Magistretti, P. J. GABA uptake into astrocytes is not associated with significant metabolic cost: implications for brain imaging of inhibitory transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 12456-12461 (2003).
  39. Magistretti, P. J., Chatton, J. Y. Relationship between L-glutamate-regulated intracellular Na+ dynamics and ATP hydrolysis in astrocytes. Journal of Neural Transmission (Vienna). 112, 77-85 (2005).
  40. Langer, J., et al. Rapid sodium signaling couples glutamate uptake to breakdown of ATP in perivascular astrocyte endfeet. Glia. 65, 293-308 (2017).
  41. Yaginuma, H., et al. Diversity in ATP concentrations in a single bacterial cell population revealed by quantitative single-cell imaging. Scientific Reports. 4, 6522(2014).
  42. Tantama, M., Martinez-Francois, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio. Nature Communications. 4, 2550(2013).
  43. Nakano, M., Imamura, H., Nagai, T., Noji, H. Ca2+ Regulation of Mitochondrial ATP Synthesis Visualized at the Single Cell Level. ACS Chemical Biology. 6, 709-715 (2011).
  44. Mollajew, R., Toloe, J., Mironov, S. L. Single KATP channel opening in response to stimulation of AMPA/kainate receptors is mediated by Na+ accumulation and submembrane ATP and ADP changes. The Journal of Physiology. 591, 2593-2609 (2013).
  45. Pathak, D., et al. The Role of Mitochondrially Derived ATP in Synaptic Vesicle Recycling. The Journal of Biological Chemistry. 290, 22325-22336 (2015).
  46. Karus, C., Mondragao, M. A., Ziemens, D., Rose, C. R. Astrocytes restrict discharge duration and neuronal sodium loads during recurrent network activity. Glia. 63, 936-957 (2015).
  47. Larsen, B. R., Stoica, A., MacAulay, N. Managing Brain Extracellular K+ during Neuronal Activity: The Physiological Role of the Na+/K+-ATPase Subunit Isoforms. Frontiers in Physiology. 7, 141(2016).
  48. Ruminot, I., et al. NBCe1 mediates the acute stimulation of astrocytic glycolysis by extracellular K+. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 14264-14271 (2011).

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ATP MessungFRET Sensororganotypische SchnitteAAV TransduktionFluoreszenzbildgebungchemische Isch mieKaliumstimulationneuronale Astrozytenzellul re Energie

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