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Tomatenwurzeltransformation gefolgt von Impfung mit Ralstonia Solanacearum für einfache genetische Analyse der bakteriellen Wilt-Krankheit

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DOI:

10.3791/60302

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11. März 2020

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1Shanghai Center for Plant Stress Biology, CAS Center for Excellence in Molecular Plant Sciences, Shanghai Institutes of Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, 2University of Chinese Academy of Sciences, 3Department of Soil Microbiology and Symbiotic Systems, Estación Experimental del Zaidín (CSIC)

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir eine vielseitige Methode zur Tomatenwurzeltransformation, gefolgt von der Impfung mit Ralstonia solanacearum, um eine einfache genetische Analyse für die Untersuchung von bakteriellen Wilt-Erkrankungen durchzuführen.

Zusammenfassung

Ralstonia solanacearum ist ein verheerender, durch den Boden übertragener Vasoren, der eine Große Auswahl an Pflanzenarten infizieren kann und eine wichtige Bedrohung für die Landwirtschaft darstellt. Allerdings ist das Ralstonia-Modell im Vergleich zu anderen Modellen mit bakteriellen Pflanzenpathogenen, wie Pseudomonas syringae in Arabidopsis,erheblich untererforscht. Forschung auf das Verständnis der Wechselwirkung zwischen Ralstonie und Pflanzen ist wichtig, um nachhaltige Lösungen zur Bekämpfung der bakteriellen Wilt-Krankheit zu entwickeln, wird aber derzeit durch das Fehlen von einfachen experimentellen Assays behindert, um die verschiedenen Komponenten der Interaktion in einheimischen Wirtspflanzen zu charakterisieren. In diesem Szenario haben wir eine Methode entwickelt, um eine genetische Analyse der Ralstonie-Infektion von Tomaten durchzuführen, einem natürlichen Wirt von Ralstonien. Diese Methode basiert auf Agrobacterium rhizogenes-vermittelte Umwandlung von Tomatenwurzeln, gefolgt von Ralstonia Boden-drenching Inokulation der resultierenden Pflanzen, die transformierte Wurzeln, die das Konstrukt des Interesses auszudrücken. Die Vielseitigkeit des Wurzeltransformationstests ermöglicht die Durchführung von Genüberexpression oder Gen-Silencing, die von RNAi vermittelt wird. Als Proof of Concept haben wir diese Methode verwendet, um zu zeigen, dass RNAi-vermitteltes Silencing von SlCESA6 in Tomatenwurzeln RalstonieResistenzverleiht. Hier beschreiben wir diese Methode im Detail, die es genetischen Ansätzen ermöglicht, bakterielle Wildeskrankheiten in relativ kurzer Zeit und mit geringen Anforderungen an Ausrüstung und Pflanzenwachstumsraum zu verstehen.

Einleitung

Ralstonia solanacearum, der Erreger der bakteriellen Wilt-Krankheit, ist ein verheerender bodenübertragener Vasor mit einer weltweiten Verbreitung, die eine große Auswahl an Pflanzenarten infizieren kann, darunter Kartoffeln, Tomaten, Tabak, Banane, Pfeffer und Auberginen, unter anderem1,2. Ertragsverluste durch Ralstonie können 80-90% der Produktion in Tomaten, Kartoffeln oder Bananen erreichen, abhängig von Sorte, Klima, Boden und anderen Faktoren3. Allerdings ist das Ralstonia-Modell im Vergleich zu anderen Modellen mit bakteriellen Pflanzenpathogenen, wie Pseudomonas syringae oder Xanthomonas spp,erheblich untererforscht. Darüber hinaus konzentrieren sich die meisten Studien in Pflanzen-Mikroben-Wechselwirkungen auf die Modellpflanze Arabidopsis thaliana. Obwohl die Forschung, die diese Modelle verwendet, weitgehend zu unserem Verständnis von Pflanzen-Bakterien-Wechselwirkungen beigetragen hat, gehen sie nicht auf die aktuelle Notwendigkeit ein, diese Wechselwirkungen in Kulturpflanzen zu verstehen. Forschung, die auf das Verständnis der Wechselwirkung zwischen Ralstonie und Pflanzen ausgerichtet ist, ist wichtig, um nachhaltige Lösungen zur Bekämpfung der bakteriellen Wilt-Krankheit zu entwickeln, wird aber derzeit durch das Fehlen von einfachen experimentellen Assays behindert, um die verschiedenen Komponenten der Interaktion zu charakterisieren. Insbesondere Tomate, ein natürlicher Wirt für Ralstonie,ist die zweitwichtigste Gemüsepflanze weltweit und wird von einer Vielzahl von Krankheiten4, einschließlich bakterieller Wilt-Krankheit betroffen. In dieser Arbeit haben wir eine einfache Methode entwickelt, um genetische Analysen der Ralstonie-Infektion von Tomaten durchzuführen. Diese Methode basiert auf Agrobacterium rhizogenes-vermittelte Transformation von Tomatenwurzeln, mit DsRed Fluoreszenz als Selektionmarker5, gefolgt von Ralstonia Boden-drenching Inokulation der resultierenden Pflanzen, enthält transformierte Wurzeln, die das Konstrukt des Interesses. Die Vielseitigkeit des Wurzeltransformationstests ermöglicht die Durchführung von Genüberexpression oder Gen-Silencing, die von RNAi vermittelt wird.

Eine mögliche Einschränkung dieser Methode besteht in dem Restwachstum nicht transformierter Wurzeln. Dies ist besonders wichtig in den Fällen, in denen das verwendete Plasmid kein Reportergen hat, das die Auswahl transformierter Wurzeln ermöglicht. Um dieses Problem zu lösen, haben wir eine alternative Methode entwickelt, die auf der Antibiotikaauswahl basiert, die das Wachstum nicht transformierter Wurzeln hemmt und gleichzeitig das Wachstum gesunder antibiotikaresistenter transformierter Wurzeln ermöglicht. Da A. rhizogenes die Umwandlung von Trieben nicht induziert, sind sie anfällig für das Antibiotikum, und daher sollten sie vom antibiotikahaltigen Medium getrennt gehalten werden.

Obwohl die Pflanzenresistenz gegen Ralstonie nicht gut verstanden wird, haben mehrere Berichte Zellwandveränderungen mit einer verbesserten Resistenz gegen bakterielle swilt6,7,8,9. Es wurde vorgeschlagen, dass diese Zellwandveränderungen die Gefäßentwicklung beeinflussen, ein wesentlicher Aspekt für den Lebensstil von Ralstonia innerhalb der Pflanze10. Mutationen in Genen, die für die Cellulose-Synthasen CESA4, CESA7 und CESA8 in Arabidopsis thaliana kodieren, haben gezeigt, dass sie die sekundäre Zellwandintegrität beeinträchtigen und eine erhöhte Resistenz gegen Ralstoniaverursachen, die mit der ABA-Signalisierung8verbunden zu sein scheint. Daher haben wir als Proof of Concept für unsere Methode RNAi-vermittelte Gen-Silencing von SlCESA6 (Solyc02g072240), einer sekundären Zellwand-Zellulose-Synthase und einem Ortholog von AtCESA8 (At4g18780) durchgeführt. Die anschließende bodendurchflutete Impfung mit Ralstonie zeigte, dass das Silencing SlCESA6 die Resistenz gegen bakterielle Wilt-Symptome erhöhte, was darauf hindeutet, dass die zellwandvermittelte Resistenz gegen Ralstonie wahrscheinlich in Tomaten konserviert wird, und unsere Methode zur Durchführung genetischer Analysen der bakteriellen Wilkresistenz in Tomatenwurzeln validiert. Hier beschreiben wir diese Methode im Detail, die es genetischen Ansätzen ermöglicht, bakterielle Wildeskrankheiten in relativ kurzer Zeit und mit geringen Anforderungen an Ausrüstung und Pflanzenwachstumsraum zu verstehen.

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Protokoll

HINWEIS: Wichtige Teile dieser Methode umfassen den Umgang mit Pflanzenmaterialien in vitro, und daher ist es wichtig, während all dieser Verfahren sterile Bedingungen beizubehalten, einschließlich der Visualisierung der DsRed-Fluoreszenz. DsRed Während des gesamten Transformationsprozesses wachsen Tomatensämlinge bei 25 bis 28 °C und 16 h/8 h hell/dunkel (130 mol Photonen m-2s-1 Licht). Die Platten sind mit Mikroporenband versiegelt, um den Gasaustausch und die Transpiration zu erleichtern.

1. Zubereitung von Tomatenpflanzen und Agrobacterium-Rhizogenen

  1. Sterilisieren Sie Tomatensamen(Solanum lycopersicum cv. Moneymaker, LA2706, Tomato Genetics Resource Center, TGRC) mit 5% (v/v) Natriumhypochlorit für 5 min. 4-5 mal mit destilliertem sterilem Wasser waschen und die Samen langsam in sterilem Wasser über Nacht schütteln lassen, um die Keimung zu erleichtern.
  2. Tomatensamen ohne Saccharose (2,21 g/L MS, 8% w/v Agar) auf halbfestes Murashige- und Skoog-Medium (1/2 MS) übertragen. Halten Sie die Samen drei Tage lang bei 25 bis 28 °C im Dunkeln(Abbildung 1A).
    HINWEIS: In der Regel werden für jedes Konstrukt etwa 40 Samen benötigt.
  3. Autoklav 8,5 cm2 quadratische Filterpapiere. Legen Sie die quadratischen Filterpapiere in 9 cm2 quadratische Petrischalen mit 1/2 MS Medium (legen Sie das Papier auf den Agar) und legen Sie sechs gekeimte Tomatensamen auf jeden Teller (Abbildung 1B). Versiegeln Sie die Platte mit Mikroporenband und bebrüten Sie die gekeimten Samen bei 25 bis 28 °C für 3 bis 4 Tage.
  4. Agrobacterium rhizogenes MSU440 in festem LB-Medium (mit geeigneten Antibiotika) bei 28 °C zwei Tage vor der Pflanzentransformation anbauen.
    HINWEIS: A. rhizogenes wird von Dr. Juan Antonio Lépez Réez, AEZ-CSIC, Granada, Spanien, zur Verfügung gestellt. In dem in diesem Artikel beschriebenen Experiment wurden A. rhizogenes verwendet, die pK7GWIWG2_II-RedRoot::CESA6 oder einen leeren Vektor als Kontrolle enthalten. pK7GWIWG2_II-RedRoot enthält ein Reportergen, DsRed, angetrieben vom Arabidopsis thaliana ubiquitin Promoter (pAtUBQ10), und verleiht eine Resistenz gegen Spektinomycin (50 g/ml). Es ist möglich, andere Vektoren für die Genüberexpression zu verwenden, wie vor5berichtet. In dieser Arbeit wurde die Verstärkung des spezifischen Fragments für SlCESA6-Silencing durch Reverse Transkription (RT) PCR mit RNA aus Tomaten isoliert (S. lycopersicum cv. Moneymaker) und in p-ENTR/D-TOPO Vektor(Tabelle 1) ligiert. Anschließend wurde das SlCESA6-RNAi-Fragment in den pK7GWIWG2_II-RedRoot-Binärvektor geklont.

2. Pflanzenumwandlung und -auswahl

  1. Schneiden Sie mit einem sterilen Skalpell das Radikel und den Boden des Hypocotyls von Tomatensämlingen (Abbildung 1C,D).
  2. Ernte A. rhizogenes Biomasse von der Oberfläche des LB-Mediums mit Plastikspitzen oder einer Skalpellklinge und tauchen Sie die geschnittenen Tomatensämlinge vorsichtig in die bakterielle Biomasse (Abbildung 1E).
  3. Nach der Impfung mit A. rhizogenesdie Tomatensämlinge mit einem 2 cm x 4 cm halbkreisförmigen Filterpapier bedecken (Abbildung 1F), um eine hohe Luftfeuchtigkeit zu halten und das Überleben und die Neuwurzelentwicklung zu erleichtern.
  4. Bewahren Sie die verwandelten Tomatensämlinge 6-7 Tage auf. Dann verwenden Sie ein steriles Skalpell, um die neu entstehenden haarigen Wurzeln zu schneiden(Abbildung 1G,H; bei diesem Schritt sind die Wurzeln noch nicht transformiert) und lassen Sie die Sämlinge neue haarige Wurzeln zu produzieren.
  5. Sobald die zweite Generation der neuen haarigen Wurzeln erscheint (Abbildung 1I), entfernen Sie das Filterpapier auf den Sämlingen und versiegeln Sie die Platte wieder mit Mikroporenband.
    HINWEIS: An dieser Stelle ermöglicht das Vorhandensein des DsRed-Fluoreszenzmarkers im Transformationsvektor die Transformationseffizienz in den neuen Wurzeln zu visualisieren.
  6. Um dsRed Fluoreszenz zu visualisieren, verwenden Sie ein Stereomikroskop oder andere Geräte für die Pflanzen-in-vivo-Bildgebung (Abbildung 1J). Markieren Sie die positiven (rote Fluoreszenz) transformierten Wurzeln und entfernen Sie die negativen nicht transformierten Wurzeln (keine rote Fluoreszenz) mit einem sterilen Skalpell.
  7. Übertragen Sie die Sämlinge mit roter Fluoreszenz auf eine neue Platte mit einem Medium mit 1/2 MS, um die Entwicklung der transformierten Wurzel als Hauptwurzel zu erleichtern (Abbildung 1K). Bewahren Sie die Sämlinge, die keine rote Fluoreszenz zeigen, in derselben Platte auf, um die Entstehung von fluoreszierenden Wurzeln (Abbildung 1L) in späteren Zeitpunkten zu überprüfen.
  8. Alternative Methode auf Basis der Antibiotikaauswahl
    1. Alternative zu Schritt 2.5, bereiten Sie halbgefüllte 9 cm2 quadratische Platten mit 1/2 MS Medium mit dem entsprechenden Antibiotikum. Neigen Sie die Platten ca. 5° während des Vorbereitungsprozesses, um einen leeren Raum ohne Medium zu erzeugen (Abbildung 2A), so dass die Triebe wachsen können, um den Kontakt mit dem Antibiotikum zu vermeiden.
    2. Alternativ zu Schritt 2.6 entstanden nach dem Schneiden der ersten nicht transformierten haarigen Wurzeln (Schritt 2.4) die Sämlinge ohne Wurzeln mit Filterpapieren mit der entsprechenden Größe auf die halbgefüllten Platten (Abbildung 2B).
      HINWEIS: Als Positivkontrolle wird empfohlen, mehrere Sämlinge mit einem Plasmid zu transformieren, das die gleiche Antibiotikaresistenz und ein Reportergen enthält (in diesem Protokoll pK7GWIWG2_II-RedRoot; Kanamycin 50 g/ml).
    3. Alternative zu Schritt 2.7, lassen Sie die Sämlinge neue haarige Wurzeln entwickeln und schneiden Sie jene Wurzeln, die nicht in direktem Kontakt mit der Oberfläche der Filter-Sandwich-Papiere sind, da diese Wurzeln Antibiotika-Auswahl vermeiden können.
      HINWEIS: Aufgrund der antibiotischen Wirkung kann die Wurzelentwicklung langsamer sein als in Platten ohne Antibiotika. Neue transformierte haarige Wurzeln erscheinen innerhalb von 14 bis 18 Tagen nach dem Übertragen der Sämlinge ohne Wurzeln auf die halbgefüllten Platten (Schritt 2.8.2) (Abbildung 2C-E).
  9. Bedecken Sie die Sämlinge mit einem 2 cm x 4 cm Halbkreisfilterpapier, versiegeln Sie den Teller und bebrüten die Sämlinge, damit sie neue haarige Wurzeln entwickeln können.
    HINWEIS: Es ist nicht notwendig, die A. rhizogenes mit Antibiotika zu beseitigen. Das Filterpapier auf dem MS-Medium und der Mangel an Saccharose hemmen die Ausbreitung der A. Rhizogenen auf der Platte5.
  10. Fünf bis sieben Tage nach der ersten Wurzelauswahl wiederholen Sie den Auswahlprozess, um neue transformierte Wurzeln auszuwählen und nicht transformierte Wurzeln zu entfernen. Die Sämlinge mit transformierten Wurzeln auf eine neue Platte mit einem Medium von 1/2 MS übertragen.

3. Übertragung in Impftöpfe

  1. Bereiten Sie Impftöpfe vor, in denen die Oberfläche der Wurzeln dem bakteriellen Inokulum ausgesetzt wird: Die Impftöpfe mit Wasser einweichen, überschüssiges Wasser abgießen und in eine Kunststoff-Pflanzschale legen. Übertragen Sie die ausgewählten Sämlinge mit transformierten Wurzeln mit einer Pinzette in Impftöpfe (Abbildung 3A).
  2. Bedecken Sie das Fach mit Plastikfolie oder einem transparenten Deckel und halten Sie sie bei 25 x 28 °C und 65 % Luftfeuchtigkeit (16 h/8 h hell/dunkel; 130 mol Photonen m-2s-1 Licht), um eine hohe Luftfeuchtigkeit zu halten Abbildung 3B). Entfernen Sie die Abdeckung nach fünf oder sechs Tagen.
    HINWEIS: Die umgewandelten Tomatenpflanzen sind zwei bis drei Wochen nach ihrer Übertragung auf den Boden zur Impfung bereit (Abbildung 3C). Während des Wachstums auf dem Boden können Tomatenpflanzen neue Wurzeln produzieren, die nicht umgewandelt werden. Um das Ausmaß dieses Phänomens zu bestimmen, wurde die rote Fluoreszenz in Wurzeln von 3 Wochen alten transformierten Tomatenpflanzen visualisiert. Die meisten Wurzeln (80%-100%) zeigte rote Fluoreszenz, was darauf hindeutet, dass sie tatsächlich transformiert sind (Abbildung 3D,E).

4. Bodenträgheit

  1. R. solancearum (Stamm GMI1000 in diesem Protokoll) in phi flüssigem Medium (Tabelle 211) in einem Orbitalshaker (200 Rpm) bei 28 °C bis zur stationären Phase anbauen.
  2. Bestimmen Sie die Bakterienzahlen, indem Sie die optische Dichte der Bakterienkultur bei 600 nm (OD600) messen. Verdünnen Sie die Bakterienkultur mit Wasser auf eine OD600 von 0,1 (unter den hier verwendeten Bedingungen entspricht dies etwa 108 koloniebildenden Einheiten [CFU]/mL).
  3. 16 bis 20 Impftöpfe mit transformierten Tomatenpflanzen in eine Impfschale (29 cm x 20 cm) geben; Abbildung 4A).
  4. Gießen Sie 300 ml (ca. 15 ml pro Pflanze) bakterielles Inokulum (OD600 von 0,1) in die Schale, die die Impftöpfe enthält. Lassen Sie sie in das Inokulum für 20 min einweichen (Abbildung 4B).
  5. Bereiten Sie eine neue Schale mit einer Schicht von Blumenerde. Bewegen Sie die geimpften Töpfe in das neue Tablett (Abbildung 4C) und legen Sie die Schalen in eine Wachstumskammer mit 75 % Luftfeuchtigkeit, 26 x 28 °C und einer Photoperiode von 12 h Licht und 12 h Dunkelheit (130 mol Photonen m-2s-1 Licht).

5. Bestimmung der Infektionsparameter und statistische Auswertung

  1. Score-Krankheitssymptome wie zuvor beschrieben12,13, mit einer Skala von 0 (keine Symptome) bis 4 (vollständiges Welken) (Abbildung 4D-H), jeden Tag nach Ralstonia Impfung für zwei Wochen.
    HINWEIS: Die Daten des Krankheitsindex werden im Laufe der Zeit von derselben Versuchseinheit (jeder Pflanze) gesammelt.

6. Genexpressionsanalyse

ANMERKUNG: Die Expression des Transgens oder das Silencing des Zielgens kann durch RT-PCR oder durch quantitative RT-PCR (qRT-PCR) bestimmt werden.

  1. Sammeln Sie Proben und extrahieren Sie RNA aus einem repräsentativen Teil des transformierten Wurzelsystems (um die Wirkung auf das Zielgen zu bewerten) und Blätter (als interne Kontrolle).
  2. Synthetisieren Sie cDNA mit 1 g der gesamten DNase-behandelten RNA.
  3. Analysieren Sie die Genexpression der Zielgene mit qRT-PCR. Berechnen Sie die relativen Transkriptionsniveaus mit der2-CT-Methode 14, wobei SlEF-1 als Haushaltsgen15verwendet wird.
    HINWEIS: Primersequenzen sind in Tabelle 1aufgeführt.

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Ergebnisse

Abbildung 5 zeigt die Entwicklung von Krankheitssymptomen von Tomatenpflanzen mit Wurzeln, die mit einem leeren Vektor (EV) transformiert wurden, und Pflanzen mit Wurzeln, die mit einem RNAi-Konstrukt transformiert wurden, das auf SlCESA6 (Solyc02g072240) abzielt. Die Krankheitsindexdaten (Abbildung 5A) werden von derselben Versuchseinheit (jede Pflanze) im Laufe der Zeit nach einer beliebigen S...

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Diskussion

Ralstonia solanacearum stellt eine wichtige Bedrohung für die Landwirtschaft dar; Seine Wechselwirkung mit natürlichen Wirten von landwirtschaftlicher Bedeutung ist jedoch im Vergleich zu anderen bakteriellen Krankheitserregern, insbesondere bei Pflanzenarten, noch immer wenig verstanden. In den meisten Fällen wird die genetische Analyse durch die Zeit und die Kosten behindert, die für die genetische Veränderung von Wirtspflanzen erforderlich sind. Um dieses Problem anzugehen und die genetische Analyse der R...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Wir danken allen Labormitgliedern des Macho-Labors für die hilfreichen Diskussionen, Alvaro Lépez-Garcéa für statistische Ratschläge und Xinyu Jian für die technische und administrative Unterstützung während dieser Arbeit. Wir danken der PSC Cell Biology Kerneinrichtung für die Unterstützung bei der Fluoreszenzbildgebung Diese Arbeit wurde durch das Strategic Priority Research Program der Chinese Academy of Sciences (Grant XDB27040204), das Shanghai Center for Plant Stress Biology (Chinesisch) unterstützt. Akademie der Wissenschaften) und das chinesische 1000 Talents-Programm.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
90 mm quadratische Petrischalen
Agar-PulverSigma-Aldrich
Bacto PeptonBD (Becton und Dickinson)
CasaminosäurenSigma-Aldrich
Filterpapier
In Vivo Plant Imaging System NightShade LB 985Berthold Technologies
Jiffy TöpfeJiffy Products International A.S.
Mikroporenband3M
Murashige und Skoog medium (M519)Phytotechlab
Pindstrup SubstratPindstrup Mosebrug A/S
Skalpell und Klinge
NatriumhypochloritSigma-Aldrich
Sterile Reinbank
Pinzette
Wahtman PapierWahtman International Ltd. Maldstone
HefeextraktOXOID

Referenzen

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Agrobacterium rhizogenesRNAi SilencingCESA6 GenKrankheitsindexFl che unter der Kurvenichtparametrischer Test

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