Fibroblast-Derived 3D Matrix System anwendbar auf Endothel Tube Formation Assay

Zusammenfassung

Das Ziel dieser Methode ist es, fibroblast-abgeleitete 3D-Matrizen als natürliches Gerüst für nachfolgende zelluläre Assays zu erhalten. Fibroblasten werden in einer vorbehandelten Kulturplatte gesät und mit Ascorbinsäure für die Matrixgenerierung stimuliert. Matrizen werden dezellularisiert und an kulturrelevante Zellen (z. B. Endothelzellen) blockiert.

Zusammenfassung

Die extrazelluläre Matrix (ECM) ist ein dreidimensionales Gerüst, das als Hauptstütze für Zellen in Geweben dient. Neben seiner strukturellen Funktion beteiligt sich das ECM auch an zellwanderungs-, Proliferations- und Differenzierungsfunktionen. Fibroblasten sind die Haupttypen von Zellen, die die Anordnung und Produktion von ECM-Fasern verändern. Bei Krebs befinden sich CAFs (krebsassoziierte Fibroblasten) im permanenten Aktivierungsstatus, nehmen an der ECM-Umgestaltung teil, erleichtern die Tumorzellmigration und stimulieren die tumorassoziierte Angiogenese, unter anderem pro-tumorigenic. Das Ziel dieser Methode ist es, eine dreidimensionale Matrix mit einer Faserzusammensetzung zu erstellen, die in vivo Matrizen ähnelt, mit verewigten Fibroblasten oder menschlichen primären CAFs. Fibroblasten werden in vorbehandelten Zellkulturplatten kultiviert und unter Ascorbinsäurestimulation angebaut. Dann werden Fibroblasten entfernt und Matrizen für die weitere Zellaussaat blockiert. In diesem ECM-Modell können Fibroblasten aktiviert oder modifiziert werden, um verschiedene Arten von Matrix zu erzeugen, deren Auswirkungen in der Zellkultur untersucht werden können. 3D-Matrizen werden auch durch Zellsignale geformt, wie Degradation oder Vernetzung von Enzymen, die die Faserverteilung verändern könnten. In diesem Zusammenhang kann die Angiogenese zusammen mit anderen Zelltypen wie epitheliale Tumorzellen untersucht werden.

Einleitung

Die extrazelluläre Matrix (ECM) ist eine dynamische Struktur, die in allen Gewebearten vorhanden ist. Es besteht aus Proteinen und Polysacchariden, die ein Netz von Fasern für Zellhaftung, Migration und Kommunikation¹. Die ECM-Zusammensetzung variiert je nach Gewebe. Während Typ-I-Kollagen das am weitesten verbreitete Strukturprotein ist, sind die Kollagentypen II, III, V und XI auch in verschiedenen Geweben zu finden². Fibronectin, das durch Fibroblasten erzeugt wird, wird für die Zelladhäsion²benötigt. Darüber hinaus gibt es andere strukturelle Moleküle wie Elastin, Laminin und Oberflächenrezeptoren genannt Integrine, die Fasermontage vermitteln und sind spezifisch für die verschiedenen ECM Gewebe². Das ECM spielt als Zellgerüst eine wichtige Rolle und kann auch an physiologischen und pathologischen Prozessen beteiligt werden¹. Anomalien im ECM werden bei Pathologien wie Krebs beobachtet, der die Zusammensetzung und/oder Organisation des ECM verändert. Bei Tumoren stellt das ECM die nichtzelluläre Komponente der Tumormikroumgebung (TME) dar, ein komplexes Milieu von Zellkomponenten wie Fibroblasten, Immunzellen, Endothelzellen, Pericyten und einer Vielzahl von löslichen Faktoren. Es ist bekannt, dass die TME die Krebsprogression und Metastasierung fördert; Krebsassoziierte Fibroblasten, als vorherrschender Zelltyp im Tumor stroma, nehmen an diesem Prozess^{teil 3}. Im Gegensatz zu normalen Fibroblasten befinden sich CAFs in permanenter Aktivierung und zeigen eine erhöhte Sekretion von ECM-Proteinen und Wachstumsfaktoren (z. B. Transforming Growth Factor-, TGF-) sowie eine höhere Expression einiger Marker, wie z. B. "glatter Muskelaktin" (-SMA) und Fibroblasten-Aktivierungsprotein (FAP)⁴. CAFs sind jedoch eine heterogene Zellpopulation, die unterschiedliche Aktivierungsstufen oder Markerausdruck⁵anzeigt. Es kann dann davon ausgegangen werden, dass die Zusammensetzung und Struktur von fibroblasten-abgeleiteten Matrizen vom Fibroblastenstatus und den Eigenschaften abhängen.

In diesem Zusammenhang besteht das Ziel dieser Methodik darin, ein geeignetes In-vitro-Modell für die ECM-Erzeugung durch Fibroblasten zu erstellen, das der in vivo ECM-Einstellung entspricht. Wir schlagen diesen Ansatz als in vitro translationale Methodik für weitere Studien von Tumorzellfunktionen wie Chemoresistenz oder Migration vor, die von ECM vermittelt werden. Wie unsere Gruppe an anderer Stelle veröffentlicht hat, können CAFs aus frischen Gewebeproben gewonnen werden, aber es ist zu beachten, dass das Überleben der CAFs in der Kultur begrenzt ist und ihre Zelldurchgangszahl reduziert wird⁶. Darüber hinaus können CAF-Primärkulturen, die aus Patientenproben hergestellt wurden, für die Matrixgenerierung verwendet werden. Die Manipulation der Genexpression in Fibroblasten ist auch eine interessante Möglichkeit, verschiedene In-vitro-Matrizen zu produzieren, um die möglichen Auswirkungen auf die Matrixzusammensetzung, Faserorientierung usw. zu bewerten. In diesem Sinne hat unsere Gruppe vor kurzem über die Rolle von Schnecken-extierten Fibroblasten in der Zusammensetzung und Faserausrichtung verschiedener abgeleiteter Matrizen^{berichtet 7}.

Darüber hinaus sind CAFs und ECM sowohl bei der Gefäßerzeugung als auch als Teil der Vasenaußenschicht⁸am Gefäßsystem beteiligt. ECM-Umbau induziert Angiogenese; Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) scheinen der wichtigste Enzymtyp zu sein, der zu diesem Prozess beiträgt^9,10. Die Gewebevaskularisation von Primärzellen, die die ECMs, ECM-Makromoleküle, Restwachstumsfaktoren des ECM, Matrixelastizität und Matrixdicke erzeugen, wird als Faktoren beschrieben, die an der Endothelzellaktivierung beteiligt sind¹¹. Bei Tumoren erhöht Hypoxie die ECM-Steifigkeit und die endotheliale Sprossengeneration¹². Darüber hinaus sezernieren CAFs vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) und Thrombozyten-abgeleiteten Wachstumsfaktor (PDGF), die Angiogenese in Tumor stroma¹³stimulieren. In diesem Bereich könnte die In-vitro-Matrixgenerierung verwendet werden, um Angiogeneseprozesse oder MMP-Wirkung unter verschiedenen experimentellen Bedingungen zu untersuchen. Somit könnte die In-vitro-Reproduktion der analogsten In-vivo-Matrix ein wertvolles Werkzeug sein, um die Rolle von ECM bei Angiogenese oder Mikro-Umwelt-Zell-Wechselwirkungen zu untersuchen.

Die Stimulation von kultivierten Fibroblasten mit Ascorbinsäure zur Verbesserung der Matrixabscheidung und zur Erzeugung eines ECM ist eine anerkannte Art, analoge In-vivo-Matrizen herzustellen. Verewigte Fibroblasten-Zelllinien lassen sich leicht kulturalisieren und werden durch verschiedene Wachstumsfaktoren aktiviert, wie PDGF-BB, Tumor-Nekrose-Faktor ----(TNF-) oder^{TGF-Nr. 14}. Innerhalb der TME synthetisieren CAFs Typ-I-Kollagen und Fibronectin als Hauptbestandteile von ECM⁴. In ähnlicher Weise werden diese Komponenten als Hauptbestandteile von in vitro erzeugten Fibroblasten-abgeleiteten Matrizen gefunden (Abbildung 1).

Es gibt verschiedene In-vitro-Methoden, um in vivo ECM zu simulieren. Die Verwendung von beschichteten Kulturgerichten mit Mischungen von ECM-Fasern wurde in den vergangenen Jahren erweitert, aber dieser 2D-Ansatz musste verbessert werden an 3D-Strukturen, wie z.B. vernetzte Gele (z.B. Matrigel)¹. Das Matrigel-ähnliche Setup ist zur Standardmethode zur Simulation einer 3D-Matrix geworden. Fibrin ist auch eine Alternative bei der Erzeugung von Matrizen, scheitert aber in Bezug auf Festigkeit und Haltbarkeit des ECM¹. Kollagen, das in Kombination mit anderen ECM-Komponenten verwendet wird, ändert einige der oben genannten Probleme. Diese Kollagengele bilden jedoch ein starkes Netzwerk mit Fasern, die sich orientieren können, aber sehr heterogen sind, was bei Experimentwiederholungen ein Problem sein kann¹. Dennoch ist davon auszugehen, dass je nach Ziel der Experimente die Verwendung von Matrigel oder anderen Hydrogelen besser geeignet ist (z. B. in Matrixkontraktionsstudien, in denen die Gelkontraktion leicht nachgewiesen werden kann).

Die potentielle Immunogenität der erzeugten Matrizen könnte ein Problem in Experimenten mit einigen Zelltypen sein. Daher, um die Möglichkeit von Immunantworten aufgrund von ECM-generierenden Zellen zu reduzieren, wenn unsere Methode verwendet wird, werden Matrizen dezellularisiert und gewaschen, obwohl die Entfernung von Zellfragmenten nicht insgesamt¹⁵sein könnte. Das ideale ECM muss mit der Zellkultur kompatibel sein und in der Lage sein, zellsignale zu kommunizieren und darauf zu reagieren. Unser Verfahren ermöglicht die problemlose Einführung von Veränderungen während der ECM-Produktion (z. B. Hinzufügen von fibroblastenstimulierenden Wachstumsfaktoren).

Protokoll

Menschliche Gewebeproben wurden mit Genehmigung der Forschungsethikkommission des Krankenhauses Ramen y Cajal, Madrid, erhalten.

1. Vorbereitung von Lösungen

1. 0,2% Gelatinelösung vorbereiten: 1 g Gelatine zu 500 ml PBS hinzufügen. Autoklavieren Sie die Lösung und halten Sie bei 4 °C. Filtern Sie vor der Verwendung mit einem 0,22 m Filter.
2. 1% Glutaraldehyd vorbereiten: 1 ml 25% Glutaraldehyd-Stammlösung zu 24 ml PBS hinzufügen. Filtern Sie vor der Verwendung mit einem 0,22 m Filter.
3. 1 M Ethanolamin vorbereiten: Ethanolaminlösung mit sterilem_H2O. Filter mit einem 0,22 m Filter vor dem Gebrauch vorbereiten.
   HINWEIS: Da Ethanolamin mit einer Sicherheitskappe versehen ist, werden eine Nadel und eine Spritze benötigt.
4. Ascorbinsäure zubereiten: 0,1 ml 50 mg/ml Stammlösung Ascorbinsäure (lichtempfindlich) auf 100 ml Medium hinzufügen.
5. Lysepuffer vorbereiten: PBS 0,5% Triton 100X mit 20 nM NH₄OH vorbereiten. Fügen Sie NH₄OH direkt vor der Verwendung hinzu.
6. PbS Pen/Strep vorbereiten: Verdünnung der Pen/Strep-Lagerlösung auf 100 U/ml Pen und 100 g/ml Strep.
7. DMEM mit 10% FBS vorbereiten: 10% FBS zu 500 ml DMEM hinzufügen. Ergänzung mit 100 U/ml Penicillin, 100 g/ml Streptomycin, 0,1 mg/ml Normocin und 0,25 g/ml Amphotericin B.
8. 2% BSA-Wärme denaturiert vorbereiten: 2 g BSA auf 100 ml steriles Wasser geben. 7 min in kochendem Wasser erwärmen.
9. BEREITEN FBS mit Antibiotika vor: Ergänzung FBS mit 200 U/ml Penicillin, 200 g/ml Streptomycin, 100 g/ml Gentamicin und 2,5 g/ml Amphotericin B.

2. Zellkulturvorbereitung

1. Verewigte Fibroblasten Zelllinie
   1. Kultur rekombinante Telomerase transfizierte verewigte menschliche Vorhaut-Fibroblasten (BJ-hTERT, ATCC CRL-4001) in DMEM mit 10% FBS und halten bei 37 °C und 5%_CO2.
2. Endothelzellen
   1. Kultur menschliche Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECs, ATCC PCS-100-013) in EBM-2 Medium mit 2% FBS und halten bei 37 °C und 5%_CO2.
3. Fibroblasten Primärkultur
   ANMERKUNG: Für CAF-Einrichtung und Kultur wurde das zuvor von unserer Gruppe veröffentlichte Protokoll⁶befolgt.
   1. Kurz gesagt, schneiden Sie Gewebeproben in kleine Stücke von ca. 2-3 mm³ und Samen in FBS mit hoher Konzentration von Antibiotika.
   2. Wenn die ersten Fibroblasten erschienen, ersetzen Medium mit FBM Medium für die Zellerhaltung.
      HINWEIS: Je nach Gewebeherkunft können Zellkulturen leicht kontaminiert werden. Waschen Sie Proben in PBS, ergänzt mit Antibiotika, mit stark kontaminiertem Gewebe (z. B. Dickdarm⁶) und schütteln Sie 30-45 min.

3. Fibroblasten-abgeleitete 3D-Matrizen (angepasst von Castella-Cros und Cukierman¹⁶)

1. 2 ml 0,2% Gelatinelösung in jeden Brunnen einer 6-Well-Platte geben und 1 h bei 37 °C oder über Nacht bei 4 °C inkubieren.
2. Gelatine ansaugen und in 2 ml PBS waschen.
3. Fügen Sie 2 ml 1% Glutaraldehyd hinzu und brüten sie 30 min bei RT. Glutaraldehyd wird Gelatine vernetzen.
4. Anspirieren Glutaraldehyd und waschen Brunnen in 2 ml PBS für 5 min. Wiederholen Sie 3 mal.
5. Fügen Sie 2 ml 1 M Ethanolamin hinzu und brüten Sie 30 min bei RT. Ethanolamin wird wirken, um das restliche Glutaraldehyd zu blockieren.
6. Ethanolamin ansaugen und Brunnen in 2 ml PBS für 5 min waschen. 3 Mal wiederholen.
7. Fügen Sie 1 ml DMEM mit 10% FBS hinzu. Wenn das Medium sofort rosa wird, entfernen Sie das Medium, waschen Sie in 2 ml PBS und fügen Sie erneut 1 ml DMEM mit 10% FBS hinzu.
8. Samen 1 ml Fibroblastsuspension, mit 5 x 10⁵ Zellen in jedem Brunnen. Das Gesamtvolumen in jedem Brunnen beträgt 2 ml.
9. Kulturzellen bis zum 100%igen Zusammenfluss erreicht ist. Entfernen Sie dann das Medium und ersetzen Sie mit DMEM mit 10% FBS mit 50 g/ml Ascorbinsäure und zusätzlicher Behandlung, falls verwendet.
10. Ersetzen Sie Medium durch frisches DMEM mit 10% FBS und 50 g/ml Ascorbinsäure alle 2 Tage für 6 Tage.
    HINWEIS: Wenn eine zusätzliche Behandlung verwendet wird (z. B. PDGF-BB, TGF-B und/oder andere Wachstumsfaktoren), fügen Sie sie an den gleichen Tagen hinzu, an denen ascorbinsäurebehandelt wird.
11. Zwei Tage nach der letzten Ascorbinsäurebehandlung das Medium entfernen und in 2 ml PBS waschen.
12. Langsam 1 ml Lysepuffer, bei 37 °C vorgewärmt, zu jedem Brunnen hinzufügen. Inkubieren Sie für 5-10 min bei RT, bis Fibroblasten lysiert werden (unter dem Mikroskop beobachtet).
13. Fügen Sie vorsichtig und ohne Entfernen des Lysepuffers 2 ml PBS hinzu. Dann aspirieren Sie ca. 2,5 ml PBS. Wiederholen Sie dies zweimal für insgesamt drei Wähbe.
14. Entfernen Sie schließlich 2,5 ml PBS und fügen Sie 2 ml PBS mit Pen/Strep (100 U/ml bzw. 100 g/ml) hinzu. Mit Folie versiegeln und bis zu 3 Monate bei 4 °C halten.
    ANMERKUNG: Je nach Experiment kann die langfristige Speicherung der erzeugten Matrizen die Ergebnisse beeinflussen. Wir empfehlen, Matrizen so schnell wie möglich zu verwenden, und noch mehr, wenn das Experiment zellsaatiert wird, aufgrund eines möglichen Proteinabbaus. Wenn Matrizen für strukturelle Assays wie Kollagenbeobachtung verwendet werden, können Matrizen fixiert und für längere Zeiträume gelagert werden. Dieses Protokoll ist für eine 6-Well-Kulturplatte angegeben. Andere Platten können verwendet werden, aber reaktive Volumina und Zellsuspensionskonzentration müssen entsprechend der Wellfläche neu berechnet werden.

4. Tube Formation Assay

1. Wachsen Sie HUVEC-Zellen in EBM-2 2% FBS bis zum maximalen Zusammenfluss.
2. Ersetzen Sie Medium mit EBM-2 ohne FBS für 8 h.
3. Bereiten Sie Matrizen vor, bevor Sie Zellen säen.
   1. Entfernen Sie Matrizen aus dem Kühlschrank und legen Sie für 1 h bei RT.
   2. Blockmatrizen durch Zugabe von 2 ml wärmedenaturierter 2% BSA. 1 h bei 37 °C inkubieren.
   3. Aspirieren Sie BSA und waschen Sie in 2 ml PBS.
4. Samen 2 x 10⁵ HUVEC-Zellen in FBS-erschöpftem Medium auf jedem Brunnen einer 6-Well-Platte, die zuvor mit 3D-Fibroblasten-abgeleiteten Matrizen beschichtet war.
5. Endothelzellen bei 37 °C für 16 h inkubieren.
6. Untersuchen Sie die röhrenartige Strukturbildung unter einem Standard-Hellfeldmikroskop mit 20-40-facher Vergrößerung.

Ergebnisse

PDGF-BB stimulierte Fibroblasten erzeugen ein dickeres ECM. Herrera et al. zeigten, wie PDGF-stimulierte Fibroblasten eine dickere Matrix sowie eine höhere Faserausrichtung^{erzeugten 7}. BJ-hTERT-Fibroblasten wurden mit oder ohne PDGF inkubiert und repräsentative Bereiche zeigten eine stärker ausgerichtete Zellverteilung in Matrizen, die durch PDGF-stimulierte Fibroblasten hergestellt wurden (Abbildung 1a). Die Expressio...

Diskussion

Matrizen können mit verewigten Fibroblasten oder primären Fibroblastenkulturen erzeugt werden. Fibroblasten sind in der In-vitro-Kultur mit einer hohen Wachstumsrate und Stressresistenz leicht zu pflegen. Sie können sogar aus post-mortem Gewebe isoliert werden³, obwohl Kontamination könnte eine Einschränkung sein, je nach Gewebeursprung.

Das 3D-Matrix-Modell bietet hier ein neuartiges und effektives System zur erfolgreichen Untersuchung der ECM-Zusammensetzung und Faser...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Ammoniumhydroxid (NH4OH)	Roth	A990.1
Amphotericin-B	Corning	30-003-CF
Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma	A7906-50G
Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM)	Corning	10-014-CVR
Endotheliales Basalmedium (EBM)	Lonza	CC-3121	Nahrungsergänzungsmittel vor Gebrauch hinzufügen
Endothelzell-Basalmedium Ergänzungen (EGM-2)	Lonza	CC-4176
Ethanolamin	Sigma	411000-100ML
Fötales Rinderserum (FBS)	Biowest	S181B-500	Gebrauch hitzeinaktiviert
Fibroblastenwachstum Basalmedium (FBM)	Lonza	CC-3131	Nahrungsergänzungsmittel vor Gebrauch hinzufügen
Fibroblasten-Wachstumsmedium-Ergänzungen und Wachstumsfaktoren (FGM-2)	Lonza	CC-4126
Gelatine aus Rinderhaut	Sigma	G9391-100G
Glutaraldehyd	Sigma	g5882
L-Ascorbinsäure	Sigma	A92902-100G	lichtempfindliches
L-Glutamin	Lonza	BE17-605E
Normocin	Invivogen	3ANT-NR-2
Pencillin/Streptomycin (Pen/Streptomycin)	Gibco	15140122
phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Corning	21-040-CVR
Triton X100	Roth	3051
Rekombinante Telomerase transfizierte immortalisierte menschliche Vorhautfibroblasten (BJ-hTERT)	ATCC	ATCC CRL-4001
Menschliche Nabelvene Endothelzellen (HUVECs)	ATCC	PCS-100-013