Das Ziel dieser Methode ist es, fibroblast-abgeleitete 3D-Matrizen als natürliches Gerüst für nachfolgende zelluläre Assays zu erhalten. Fibroblasten werden in einer vorbehandelten Kulturplatte gesät und mit Ascorbinsäure für die Matrixgenerierung stimuliert. Matrizen werden dezellularisiert und an kulturrelevante Zellen (z. B. Endothelzellen) blockiert.
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Methodenartikel
Fibroblast-Derived 3D Matrix System anwendbar auf Endothel Tube Formation Assay
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die extrazelluläre Matrix (ECM) ist ein dreidimensionales Gerüst, das als Hauptstütze für Zellen in Geweben dient. Neben seiner strukturellen Funktion beteiligt sich das ECM auch an zellwanderungs-, Proliferations- und Differenzierungsfunktionen. Fibroblasten sind die Haupttypen von Zellen, die die Anordnung und Produktion von ECM-Fasern verändern. Bei Krebs befinden sich CAFs (krebsassoziierte Fibroblasten) im permanenten Aktivierungsstatus, nehmen an der ECM-Umgestaltung teil, erleichtern die Tumorzellmigration und stimulieren die tumorassoziierte Angiogenese, unter anderem pro-tumorigenic. Das Ziel dieser Methode ist es, eine dreidimensionale Matrix mit einer Faserzusammensetzung zu erstellen, die in vivo Matrizen ähnelt, mit verewigten Fibroblasten oder menschlichen primären CAFs. Fibroblasten werden in vorbehandelten Zellkulturplatten kultiviert und unter Ascorbinsäurestimulation angebaut. Dann werden Fibroblasten entfernt und Matrizen für die weitere Zellaussaat blockiert. In diesem ECM-Modell können Fibroblasten aktiviert oder modifiziert werden, um verschiedene Arten von Matrix zu erzeugen, deren Auswirkungen in der Zellkultur untersucht werden können. 3D-Matrizen werden auch durch Zellsignale geformt, wie Degradation oder Vernetzung von Enzymen, die die Faserverteilung verändern könnten. In diesem Zusammenhang kann die Angiogenese zusammen mit anderen Zelltypen wie epitheliale Tumorzellen untersucht werden.
Einleitung
Die extrazelluläre Matrix (ECM) ist eine dynamische Struktur, die in allen Gewebearten vorhanden ist. Es besteht aus Proteinen und Polysacchariden, die ein Netz von Fasern für Zellhaftung, Migration und Kommunikation1. Die ECM-Zusammensetzung variiert je nach Gewebe. Während Typ-I-Kollagen das am weitesten verbreitete Strukturprotein ist, sind die Kollagentypen II, III, V und XI auch in verschiedenen Geweben zu finden2. Fibronectin, das durch Fibroblasten erzeugt wird, wird für die Zelladhäsion2benötigt. Darüber hinaus gibt es andere strukturelle Moleküle wie Elastin, Laminin und Oberflächenrezept....
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Protokoll
Menschliche Gewebeproben wurden mit Genehmigung der Forschungsethikkommission des Krankenhauses Ramen y Cajal, Madrid, erhalten.
1. Vorbereitung von Lösungen
- 0,2% Gelatinelösung vorbereiten: 1 g Gelatine zu 500 ml PBS hinzufügen. Autoklavieren Sie die Lösung und halten Sie bei 4 °C. Filtern Sie vor der Verwendung mit einem 0,22 m Filter.
- 1% Glutaraldehyd vorbereiten: 1 ml 25% Glutaraldehyd-Stammlösung zu 24 ml PBS hinzufügen. Filtern Sie vor der Verwendung mit einem 0,22 m Filter.
- 1 M Ethanolamin vorbereiten: Ethanolaminlösung mit sterilemH2O. Filter mit einem 0,22 m Filter vor dem Gebrauch vorbereit....
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Ergebnisse
PDGF-BB stimulierte Fibroblasten erzeugen ein dickeres ECM. Herrera et al. zeigten, wie PDGF-stimulierte Fibroblasten eine dickere Matrix sowie eine höhere Faserausrichtungerzeugten 7. BJ-hTERT-Fibroblasten wurden mit oder ohne PDGF inkubiert und repräsentative Bereiche zeigten eine stärker ausgerichtete Zellverteilung in Matrizen, die durch PDGF-stimulierte Fibroblasten hergestellt wurden (Abbildung 1a). Die Expressio.......
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Diskussion
Matrizen können mit verewigten Fibroblasten oder primären Fibroblastenkulturen erzeugt werden. Fibroblasten sind in der In-vitro-Kultur mit einer hohen Wachstumsrate und Stressresistenz leicht zu pflegen. Sie können sogar aus post-mortem Gewebe isoliert werden3, obwohl Kontamination könnte eine Einschränkung sein, je nach Gewebeursprung.
Das 3D-Matrix-Modell bietet hier ein neuartiges und effektives System zur erfolgreichen Untersuchung der ECM-Zusammensetzung und Faser.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.
Danksagungen
Die Entwicklung dieses Protokolls wurde von PI12/02037, PI15/02101, PI17/01847, PI18/01034 und RD12/0036/0041 vom Instituto de Salud Carlos III unterstützt; von der Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER); von "CIBER de Céncer", CB16/12/00273 und CB16/12/00446, vom Instituto de Salud Carlos III-FEDER; und von der Fundacion Cientéfica AECC (ein facettenreicher Ansatz zur Bekämpfung von Bauchspeicheldrüsenkrebs). Cristina Pea ist Empfängerin eines Miguel Servet-Vertrags des Instituto de Salud Carlos III. M. Eaude half beim englischen Text. Wir danken den Labormitgliedern für die Hilfe und Beratung während dieser gesamten Forschung.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Ammoniumhydroxid (NH4OH) | Roth | A990.1 | |
| Amphotericin-B | Corning | 30-003-CF | |
| Rinderserumalbumin (BSA) | Sigma | A7906-50G | |
| Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) | Corning | 10-014-CVR | |
| Endotheliales Basalmedium (EBM) | Lonza | CC-3121 | Nahrungsergänzungsmittel vor Gebrauch hinzufügen |
| Endothelzell-Basalmedium Ergänzungen (EGM-2) | Lonza | CC-4176 | |
| Ethanolamin | Sigma | 411000-100ML | |
| Fötales Rinderserum (FBS) | Biowest | S181B-500 | Gebrauch hitzeinaktiviert |
| Fibroblastenwachstum Basalmedium (FBM) | Lonza | CC-3131 | Nahrungsergänzungsmittel vor Gebrauch hinzufügen |
| Fibroblasten-Wachstumsmedium-Ergänzungen und Wachstumsfaktoren (FGM-2) | Lonza | CC-4126 | |
| Gelatine aus Rinderhaut | Sigma | G9391-100G | |
| Glutaraldehyd | Sigma | g5882 | |
| L-Ascorbinsäure | Sigma | A92902-100G | lichtempfindliches |
| L-Glutamin | Lonza | BE17-605E | |
| Normocin | Invivogen | 3ANT-NR-2 | |
| Pencillin/Streptomycin (Pen/Streptomycin) | Gibco | 15140122 | |
| phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | Corning | 21-040-CVR | |
| Triton X100 | Roth | 3051 | |
| Rekombinante Telomerase transfizierte immortalisierte menschliche Vorhautfibroblasten (BJ-hTERT) | ATCC | ATCC CRL-4001 | |
| Menschliche Nabelvene Endothelzellen (HUVECs) | ATCC | PCS-100-013 |
Referenzen
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Kular, J. K., Basu, S., Sharma, R. I. The extracellular matrix: Structure, comp....
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Nachdrucke und Genehmigungen
