Methodenartikel

Vergleich von metastasierenden klaren Zell Nierenzellkarzinom Modell in Maus Niere und auf Huhn Chorioallantoic Membran etabliert

DOI:

10.3791/60314

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8. Februar 2020

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1Department of Molecular and Medical Pharmacology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 2Department of Molecular, Cell, and Developmental Biology, University of California, Los Angeles, 3Department of Bioengineering, Hanyang University, 4Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of California, Los Angeles, 5Department of Microbiology, Immunology, and Molecular Genetics, University of California, Los Angeles, 6School of Life Sciences, Beijing Normal University, 7Department of Urology, West China Hospital, Sichuan University, 8Department of Urology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Metastasierendes blutestes Nierenzellkarzinom ist eine Krankheit ohne umfassendes Tiermodell für eine gründliche präklinische Untersuchung. Dieses Protokoll veranschaulicht zwei neuartige Tiermodelle für die Krankheit: das orthototisch implantierte Mausmodell und das Hähnchen-Chorioallanto-Membranmodell, die beide Lungenmetastasen zeigen, die klinischen Fällen ähneln.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metastasierendes klarzellrenales Zellkarzinom (ccRCC) ist der häufigste Subtyp von Nierenkrebs. Lokalisiertes ccRCC hat ein günstiges chirurgisches Ergebnis. Ein Drittel der ccRCC-Patienten wird jedoch Metastasen zur Lunge entwickeln, was mit einem sehr schlechten Ergebnis für die Patienten zusammenhängt. Leider gibt es für dieses tödliche Stadium keine Therapie, da der molekulare Mechanismus der Metastasierung unbekannt bleibt. Seit 25 Jahren ist bekannt, dass der Funktionsverlust des von Hippel-Lindau (VHL) Tumorsuppressorgens pathognomisch von ccRCC ist. Es wurde jedoch kein klinisch relevantes transgenes Mausmodell von ccRCC erzeugt. Ziel dieses Protokolls ist es, zwei neu eingerichtete Tiermodelle für metastasierende ccRCC einzuführen und zu vergleichen. Die erste ist die Nierenimplantation im Mausmodell. In unserem Labor wurde das CRISPR-Gen-Editing-System verwendet, um das VHL-Gen in mehreren RCC-Zelllinien auszuschalten. Orthotopische Implantation heterogener ccRCC-Populationen in die Nierenkapsel schuf neuartige ccRCC-Modelle, die robuste Lungenmetastasen bei immunkompetenten Mäusen entwickeln. Das zweite Modell ist das Chicken Chorioallantoic Membrane (CAM) System. Im Vergleich zum Mausmodell ist dieses Modell zeit-, arbeits- und kosteneffizienter. Dieses Modell unterstützte auch eine robuste Tumorbildung und Intravasation. Aufgrund der kurzen 10-tägigen Phase des Tumorwachstums in CAM wurde durch die Immunhistochemie (IHC) in den gesammelten Embryogeweben keine unverhakten Metastasen beobachtet. Als jedoch das Tumorwachstum beim geschlüpften Huhn um zwei Wochen verlängert wurde, wurden mikrometastatische ccRCC-Läsionen von IHC in der Lunge beobachtet. Diese beiden neuartigen präklinischen Modelle werden nützlich sein, um den molekularen Mechanismus hinter Metastasen weiter zu untersuchen und neue, patientenabgeleitete Xenografts (PDXs) zur Entwicklung neuartiger Behandlungen für metastasierendes ccRCC zu etablieren.

Einleitung

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Nierenzellkarzinom (RCC) ist die7. häufigste Krebsart in den Vereinigten Staaten. Jährlich werden schätzungsweise 74.000 Amerikaner neu diagnostiziert, was mehr als 14.000 Todesfällen entspricht (der histologische Untertyp clear-cell, kurz ccRCC, ist der häufigste Subtyp, der etwa 80% der RCC-Fälle ausmacht. Patienten mit lokalisierter Malignität werden mit Nephrektomie behandelt und haben eine günstige 5-Jahres-Überlebensrate von 73%1. Jedoch, 25%-30% der Patienten entwickeln entfernte Metastasen zu lebenswichtigen Organen wie der Lunge, was zu einem schlechten mittleren Überleben von 13 Monaten und 5-Jahres-Überlebensrate von nur 11%1,2,3. Ein besseres Verständnis des metastasierenden Mechanismus ist erforderlich, um das tödliche Ergebnis für metastasierende ccRCC zu verbessern.

Der Verlust des VHL-Tumorsuppressorgens ist ein Kennzeichen genetischer Läsion, das in der Mehrzahl der menschlichen ccRCC-Fälle4,5,6,7beobachtet wird. Der genaue onkogene Mechanismus des VHL-Verlustes in ccRCC ist jedoch unbekannt. Außerdem ist der VHL-Ausdrucksstatus nicht vorhersagbar für das Ergebnis in ccRCC8. Bemerkenswert ist, dass es den Wissenschaftlern trotz zahlreicher Versuche von renal-epithelialen VHL-Knockout nicht gelungen ist, Nierenanomalien jenseits der präneoplastischen zystischen Läsionen zu erzeugen, die bei Mäusen9beobachtet wurden, selbst wenn sie mit der Deletion anderer Tumorsuppressoren wie PTEN und p5310kombiniert werden. Diese Ergebnisse stützen die Vorstellung, dass VHL-Verlust allein für die Tumorgenese oder die anschließende spontane Metastasierung nicht ausreicht.

Kürzlich hat unser Labor eine neue VHL-Knockout-Zelle (VHL-KO) mit CRISPR/Cas9-vermittelter Deletion des VHL-Gens in der murinen VHL+ ccRCC-Zelllinie (RENCA, oder VHL-WT)11,12erstellt. Wir zeigten, dass VHL-KO nicht nur mesenchymal ist, sondern auch epitheliale zu mesenchymalen Übergängen (EMT) von VHL-WT-Zellen12fördert. EMT spielt bekanntlich eine wichtige Rolle im metastasierenden Prozess13. Unsere Arbeit zeigte weiter, dass entfernte Lungenmetastasen nur mit der Koimplantation von VHL-KO- und VHL-WT-Zellen in der Niere auftreten und einen kooperativen Mechanismus der Metastasierung unterstützen. Wichtig ist, dass unser orthotopisch implantiertes VHL-KO- und VHL-WT-Modell zu robusten Lungenmetastasen führt, die die klinischen ccRCC-Fälle rekapitulieren. Dieses spontane metastasierende ccRCC-Modell kompensiert das Fehlen eines transgenen metastasierenden Mausmodells, insbesondere bei der Entwicklung neuartiger Antimetastasen-Medikamente. Dieses Protokoll zeigt die renale Kapselimplantation der heterogenen Zellpopulationen genetisch entwickelter RENCA-Zellen.

Hühner-CAM-Modelle haben eine lange Geschichte in der Forschung für Angiogenese und Tumorbiologie aufgrund ihrer zahlreichen Vorteile, wie in Tabelle 114,15,16,17,18zusammengefasst. Kurz gesagt, das Zeitfenster für DAS CAM-Tumorwachstum ist kurz, so dass maximal 11 Tage, bis das CAM beim Schlüpfen des Huhns zerstört wird16. Trotz der kurzen Wachstumszeit ermöglichen die reichhaltige Nahrungsversorgung und der immundefiziierende Zustand des Hühnerembryons eine sehr effiziente Tumortransplantation16,19,20,21. Schließlich betragen die Kosten für jedes befruchtete Ei 1 USD, verglichen mit über 100 USD für eine SCID-Maus. Zusammen kann das CAM-Modell als wertvolles alternatives Tiermodell bei der Etablierung neuer PDXs zu einer großen Zeit- und Kostenersparnis im Vergleich zur Maus dienen. In diesem Protokoll haben wir untersucht, ob das Modell in der Lage war, die Biologie des metastasierenden ccRCC zu rekapitulieren, die im orthotopischen Mausmodell beobachtet wurde.

(SCID) MausCamHinweis
Kosten> 100 € pro Stück1 $ pro StückLebensfähigkeit von 50-75%
Bedarf an BarrieregehäuseJaNeinWeitere Kosten reduziert und vereinfacht die serielle Überwachung der Tumore
Tumor direkt sichtbarNeinJaAbbildung 3A
Zeit zur ersten Engraftment (RENCA)2 Wochen2-4 TageRef 14, 15
Endpunkt des Wachstums (RENCA)3-6 Wochen10 TageRef 14, 15
Metastasen (RENCA) beobachtetJaJa in KükenAbbildung 3D
Serielle PassagenJaJaRef 16-18
Durchgang zu Mäusen (RENCA)JaJaHu, J., et al. im Rückblick (2019)
Erhaltung der TumorheterogenitätJaJaHu, J., et al. im Rückblick (2019)

Tabelle 1: Vorteile und Einschränkungen der Maus- und CAM-Modelle. Diese Tabelle vergleicht die beiden Modelle hinsichtlich ihrer Vorteile und Einschränkungen in Bezug auf benötigte Zeit, Kosten, Arbeit sowie die Biologie. Das CAM-Modell hat Vorteile in der Effizienz, hat aber auch seine eigenen einzigartigen Grenzen aufgrund der unterschiedlichen Morphologie zwischen Vögeln und Säugetieren. Daher ist es wichtig zu bestätigen, dass das Modell die Biologie der Xenografts beibehalten kann.

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Protokoll

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Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt, das als UCLA Chancellor es Animal Research Committee (ARC) (ARC 2002-049-53 und ARC 2017-102-01A) bezeichnet wurde. Das Protokoll 2002-049-53 ist für die Implantation von ccRCC-Tumorzellen in die Nierenkapsel von Nude- oder BALB/c-Mäusen optimiert. Tumorimplantationsexperimente in befruchteten Hühnereiern vor dem Schlüpfen bedürfen keiner IACUC-Zulassung. Um die Zeit für die Etablierung der Lungenmetastasierung zu verlängern, dürfen die Embryonen mit CAM-Tumor schlüpfen und zu Hühnern heranwachsen. Das Protokoll 2017-102-01A deckt diese Tierversuche ab.

1. Orthotopische Tumorstudien an Mäusen

HINWEIS: Die Zeitachse für dieses Experiment ist in Abbildung 1Adargestellt. Diese Verfahren wurden aus früheren Veröffentlichungen11,12angepasst.

  1. Vorbereitung der einzelzelligen Suspension für die Pfropfung
    1. Lösen Sie die RENCA VHL-WT- und VHL-KO-Zellen mit Trypsin/EDTA von den Kulturgerichten.
    2. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und setzen Sie sie in einer vorgekühlten 1:1-Mischung aus PBS und extrazellulärer Matrixlösung in einer Konzentration von 1 x 105 Zellen/L wieder auf.
      HINWEIS: Verwenden Sie ein Verhältnis von 1:4 von VHL-WT:VHL-KO-Zellen für heterogene Implantate und VHL-WT allein für homogene Implantate.
    3. Übertragen Sie die resuspendierten Zellen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr und halten Sie bis zur Implantation auf Eis.
  2. Implantation in die Nierenkapsel
    1. Anästhesie: Ein warmes Pad auf 37 °C vorheizen und mit einem Stück dicken sterilen Vorhangs bedecken. Anästhetisieren Sie die Maus entweder durch Isofluran-Inhalation über eine Induktionskammer oder intraperitoneale (IP) Injektion von 1% Pentobarbital-Natrium in der Dosierung von 10 ml/kg.
    2. Rasieren Sie die Haare von der chirurgischen Stelle. Dieser Schritt kann für nackte Mäuse übersprungen werden.
    3. Desinfektion und chirurgische Drapieren: Desinfizieren Sie die Rückseite der Maus vollständig mit Povidon-Jod 3x gefolgt von 70% Ethanol 1x und wischen Sie es mit sterilen Wattestäbchen trocken. Dann tragen Sie drei sterile medizinische Verbände nacheinander, die den ganzen Rücken abdecken, um ein chirurgisches Feld zu schaffen sowie die Maus zu immobilisieren.
    4. Inzisions- und Nierenexerzitien: Vor der Operation die Finger des Bedieners mit Povidon-Jod desinfizieren oder ein Paar sterile Handschuhe verwenden. Platzieren Sie die Maus in der anfälligen Position und verwenden Sie die Finger, um die linke Niere rechts unter der linken Flanke zu lokalisieren. Verwenden Sie ein Paar stumpfe Zangen und Scheren, um die Haut und die Muskelschicht unter der angegebenen Position zu schneiden. Verwenden Sie sterile Wattestäbchen und Zangen, um die linke Niere teilweise aus dem Bauch herauszudrängen.
    5. Tumorzellimplantation: Laden Sie die in Schritt 1.1 hergestellte Zellsuspension entweder in Insulinspritzen oder kundenspezifische Hamilton-Spritzen (siehe Materialtabelle für Spezifikationen). Injizieren Sie 20 l resuspendierte Zellen unter die Nierenkapsel.
      HINWEIS: Eine erfolgreiche Injektion wird durch die Bildung einer transluzenten Wölbung auf der Nierenoberfläche bestimmt. Die versehentliche Injektion in das Nierenparenchym führt zu Blutungen und einer postoperativen Sterblichkeitsrate von bis zu 90 % aufgrund einer tödlichen Blutung an der Injektionsstelle.
    6. Ziehen Sie die Nadel langsam heraus, damit die extrazelluläre Matrixlösung verfestigt und Blutungen oder Tumorzellaustritte verhindert. Dann, mit einem sterilen Wattestäbchen, drücken Sie die Niere zurück in den Bauch.
    7. Wundnähte: Verwenden Sie eine 5-0 beschichtete VICTRYL Naht, um die Muskelschicht zu nähen. Desinfizieren Sie die Haut einmal mit Povidon-Jod und schließen Sie die Haut mit gewickelten Autoclips.
    8. Wiederherstellung: Legen Sie die Maus auf das warme Pad, bis es aufwacht. Wenn die Maus durch Einatmen beästhestisiert wurde, ziehen Sie das Isofluran zurück und halten Sie die Maus auf dem warmen Pad, bis sie wach ist.
  3. Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) und Gewebesammlung
    1. Sechs Wochen nach der Tumorimplantation nehmen Sie BLI-Bilder auf Galle-Luziferase-Basis. Dann einschläfern Mäuse mit Isofluran-Inhalation gefolgt von zervikalen Dislokation.
    2. Sammeln Sie Blut für zirkulierende Tumorzelle (CTC) Detektion durch Durchflusszytometrie.
    3. Ernte Tumor und Organe von Interesse (Nieren, Lunge, Leber, Darm, und Milz) mit einem sterilen Gewebe Erntetechnik22. Fixieren Sie sie in 4% Paraformaldehyd über Nacht für Paraffin-Wachs-Einbettung.

2. CAM Tumor Xenograft Modell

HINWEIS: Diese Verfahren wurden an die zuvor veröffentlichten Protokolle23,24angepasst und geändert. Der Zeitplan für dieses Verfahren ist in Abbildung 1Bdargestellt. In diesem Artikel wird nur das optimierte Protokoll dargestellt. Ausführliche Protokolle finden Sie in einem weiteren JoVE-Artikel, der von unserer Gruppe25veröffentlicht wurde.

  1. Vorinkubation: Frisch gelegte, befruchtete Hühnereier in einem rotierenden Eierbrutschrank bei 37 °C und 55-65% Luftfeuchtigkeit 7 Tage lang inkubieren.
  2. Löschen Sie das CAM und öffnen Sie das Fenster (Entwicklungstag 7):
    1. Suchen und markieren Sie den Luftsack und die Venen.
      HINWEIS: Normalerweise werden 10-15% der Eier entfernt, weil sie entweder unbefruchtet sind oder innerhalb von 7 Tagen nach der Befruchtung sterben.
    2. Erstellen Sie einen neuen Luftsack auf einer markierten Vene.
    3. Den neuen Luftsack ableiten, Verpackungsband auftragen und die Eier wieder auf den Inkubator legen.
      HINWEIS: Das Verfahren kann hier angehalten werden. Es wird empfohlen, die Verfahren innerhalb des gleichen Tages wieder aufzunehmen, da sich der Luftsack bewegen kann.
    4. Öffnen Sie ein Fenster: Schneiden Sie mit einer gekrümmten Mikrosemitsezerse und einer Nadelzange ein 1,5 x 1,5 cm großes rundes Fenster in die Schale.
      HINWEIS: Die Störung des CAM wird durch das Blut und ein Stück CAM angezeigt, das auf dem geschnittenen Schalenstück vorhanden ist.
    5. Versiegeln Sie das Loch mit transparentem medizinischen Verband und legen Sie die Eier in einen stationären Inkubator bei 37 °C und 55%-65% Luftfeuchtigkeit.
      HINWEIS: Verwenden Sie denselben Eierinkubator wie in Schritt 2.1. Schalten Sie den Rotator aus, um ihn stehen zu lassen.
  3. Gesundheitscheck (Entwicklungstag 9): Entfernen Sie tote Eier und gruppieren Sie dann nach dem Zufallsprinzip den Rest der Eier für die Tumorzellimplantation.
    HINWEIS: Idealerweise beträgt die Überlebensrate zu diesem Zeitpunkt etwa 80% des Entwicklungstages 0.
  4. Transplantation der Tumorzellen auf das neu exponierte CAM (Entwicklungstag 10)
    1. Verdünnen Sie die extrazelluläre Matrixlösung in doppeltso viel Volumen des vorgekühlten RPMI 1640 (mit L-Glutamin). Lösen Sie die RENCA-Zellen und setzen Sie sich in der obigen Lösung wieder auf, um eine Konzentration von 2 x 104 Zellen/L zu erreichen.
      HINWEIS: Verwenden Sie ein Verhältnis von 1:1 von VHL-WT:VHL-KO-Zellen für heterogene Implantate und VHL-WT allein für homogene Implantation.
    2. Um die Zellsuspension vorzufestigen, füllen Sie 100 l jeder Zellmischung in 200 L Pipettenspitzen und legen Sie sie 15 Min. in einen Zellinkubator.
    3. Implantieren Sie 100 l Zellsuspension für jedes Ei auf der CAM-Oberfläche durch das Fenster.
      HINWEIS: Einige Protokolle erfordern kratzen das CAM vor der Implantation23. Dies ist für RENCA-Zellen nicht notwendig, da sie sehr schnell wachsen.
  5. Wachsen Sie Zellen auf dem CAM für 10 Tage und fotografieren alle 2 Tage.
  6. Euthanisieren und ernten Sie den Tumor, Blut und Organe.
    1. Am Entwicklungstag 20 (Tumortag 10) Blut über die chorioallantoische Vene mit einer heparinisierten 10 ml Spritze sammeln.
    2. Euthanisieren Sie die Embryonen, indem Sie sie 15 min auf Eis legen.
    3. Tumoren ernten und wiegen. Sezieren Sie Lungen und Lebern mit einer sterilen Gewebeerntetechnik ähnlich der für Mäuse22.
      HINWEIS: Hühnerleber haben zwei Lappen, die die ersten Organe in der Bauchhöhle gesehen sind. Verwechseln Sie diese nicht mit der Lunge. Die Hühnerlungen befinden sich unter dem Herzen und Septum26. Die erfolgreiche Erfassung der Lunge kann durch exponierte Rippen bestätigt werden.
    4. Fixieren Sie die Tumore und die sezierten Organe in 4% Paraformaldehyd über Nacht für Paraffin-Wachs-Einbettung.
  7. Schlüpfen Sie die Hühner.
    1. Um eine längere Periode des Tumorwachstums zu ermöglichen, setzen Sie die Inkubation bis zum 21. Tag fort und lassen Sie die Hühner bei 37 °C und mindestens 60% Luftfeuchtigkeit schlüpfen.
      HINWEIS: Hühner schlüpfen natürlich nach Tag 21 über einen Zeitraum von 24 h, haben aber gelegentlich Probleme, selbst zu schlüpfen. In diesem Fall hilft das Knacken der Eierschalen. Es ist wichtig für Hühner, den Schraffurprozess innerhalb von 24 h abzuschließen, da sie danach an Nährstoffmangel sterben.
    2. Wachsen Sie die Hühner in einer Tieranlage (2017-102-01A) für 2 Wochen.
    3. Am Entwicklungstag 34 (Tumortag 24) werden die Küken mit Isofluran-Inhalation, gefolgt von Zervixdislokation, eingeschläfert.
    4. Sezieren Sie die Lunge mit einer sterilen Gewebeerntetechnik ähnlich denen für Mäuse22. Dann fixieren Sie sie in 4% Paraformaldehyd über Nacht für Paraffin-Wachs-Einbettung.

3. Immunhistochemie

HINWEIS: Alle Gewebeschnitte und H&E-Färbungen wurden vom Translational Pathology Core Laboratory (TPCL) an der University of California, Los Angeles durchgeführt.

  1. Dias bei 65 °C 20 min backen und 3x mit Xylol deparaffinisieren und seriell von 100% Ethanol zu Wasser rehydrieren.
  2. Holen Sie die Antigene in einem Citratpuffer, der in einem Gemüsedampfer gekocht wird, für 25 min.
  3. Wenden Sie 1% BSA für die Blockierung an. Wenden Sie dann die primären Antikörper (Anti-VHL, Anti-HA, Anti-Flag) bei einem Verdünnungsverhältnis von 1:200 in PBS an. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
  4. Nach dem Waschen 3x mit TBST (je 7 min), Dias mit dem sekundären Antikörper bei 1:200 Verdünnung inkubieren. 3x mit TBST (je 7 min) waschen und DAB-Reagenzien auftragen, gefolgt von Hämatoxylin-Gegenfärbung.

4. Durchflusszytometrie

  1. Verarbeiten Sie die Maus oder Hühnerblut mit roten Blutkörperchen (RBC) Lysepuffer nach dem Herstellerprotokoll.
    HINWEIS: Eine ausreichende RBC-Lyse ist besonders wichtig bei der Analyse von CAM-Blut, da Hähnchen-RBCs nukleiert sind und in der Durchflusszytometrie mit der Vorwärts- und Seitenstreuung nicht leicht zu unterscheiden sind.
  2. Führen Sie die Durchflusszytometrie auf dem Blutlysat aus und analysieren Sie die Daten für die mStrawberry- und EGFP-Expression.
  3. Legen Sie die primären Tore basierend auf der Vorwärts- und Seitenstreuung ohne Schutt, abgestorbene Zellen und nicht lysierte RBCs fest.
  4. Stellen Sie die Fluoreszenztore auf der Grundlage der ungefärbten Proben und einzelnen gebeizten Kontrollen ein. Verwenden Sie Blutlysat, das mit VHL-WT, VHL-KO oder unbeschrifteten RENCA-Zellen grundiert ist, als einzelne gebeizte Und nicht befleckte Kontrollen.

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Ergebnisse

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Jedes Experiment wurde mindestens 3x durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Die Daten werden als Mittelwert dargestellt, Standardabweichung (SD). Die Signifikanz wurde durch einen paired, Student es T-Test bestimmt, wenn es zwei Gruppen gab, oder durch eine einseitige ANOVA, wenn es drei oder mehr Gruppen gab. Zur Ermittlung der Bedeutung wurde ein p-Wert-Cutoff von 0,05 verwendet.

Orthotopisch implantierte RENCA-Zellen wu...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Für viele Patienten mit epithelialen Malignitäten ist Metastasierung zu lebenswichtigen Organen die Hauptursache für die Sterblichkeit. Daher ist es wichtig, den zugrunde liegenden Mechanismus und einen neuen Therapieweg für metastasierende Erkrankungen zu finden. Leider fehlt es an relevanten metastasierenden ccRCC-Tiermodellen. Die Herausforderung ist zu einem großen Teil auf die Unfähigkeit zurückzuführen, ccRCC bei Mäusen trotz der Erzeugung zahlreicher transgener Nierenepithel-gezielten VHL-Knockout-Mausmodelle

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde durch das UCLA JCCC Seed Grant, UCLA 3R Grant, UCLA CTSI und UC TRDRP (LW) finanziert. Wir danken der Preclinical Imaging Facility des Crump Institute, der TPCL und der UCLA Department of Laboratory Animal Medicine (DLAM) für ihre Hilfe bei experimentellen Methoden. Die Flow-Zytometrie wurde im UCLA Johnson Comprehensive Cancer Center (JCCC) und im Center for AIDS Research Flow Cytometry Core Facility durchgeführt, die von den National Institutes of Health Awards P30 CA016042 und 5P30 AI028697 sowie vom JCCC, dem UCLA AIDS Institute, der David Geffen School of Medicine an der UCLA, dem UCLA Chancellor es Office und dem UCLA Vizekanzler unterstützt wird. Die Statistikberatung und Datenanalyse wurde vom UCLA CTSI Biostatistics, Epidemiology, and Research Design (BERD) Programm bereitgestellt, das vom NIH/National Center for Advancing Translational Science UCLA CTSI Grant Number UL1TR001881 unterstützt wird.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,25 % Trypsin, 0,1 % EDTA in HBSS ohne Calcium-, Magnesium- und NatriumbicarbonatCorning25053CI
8050-N/18 Micro 8V Max Tool KitDremel8050-N/18
Anti-VHL-AntikörperAbcamab135576
BD Lo-Dose U-100 InsulinspritzenBD Biosciences14-826-79
BD Pharm LyseBD Biosciences
BDGeneral Use and PrecisionGlide InjektionsnadelnFisher Scientific14-826-5D
DAB Chromogen KitBiocare MedicalDB801R
D-Luciferin Firefly, KaliumsalzGoldbioLUCK-1G
DPBS ohne Calcium und MagnesiumGibcoLS14190250
DYKDDDDK Tag Monoklonaler Antikörper (FG4R)eBioscience14-6681-82
Ethanol 200 ProofZylinder Management43196-11Bereiten Sie 70 % in Wasser
Fötales Rinderserum, qualifiziert, USDA-zugelassen RegionenFisher Scientific10-437-028
Fisherbrand Präparierschere mit scharfer SpitzeFisher Scientific08-940
Fisherbrand Sterile WattebällchenFisher Scientific22-456-885
FisherbrandHochpräzise Pinzette/Pinzette mit gerader, konischer ultrafeiner SpitzeFisher Scientific12-000-122
FisherbrandPremium Mikrozentrifugenröhrchen: 1,5 mLFisher Scientific05-408-129
Formaldehyd Soln., 4%, gepuffert, pH 6,9 (ca. 10% Formalin Soln.), Für HistologieMilliporeSigma1.00496.5000
Hamilton kundenspezifische SpritzeHamilton8040825 µ L, Modell 702 SN, Stärke: 30, Spitzenform: 4, Winkel: 30, Nadellänge: 17 mm
HA-Sonde Antikörper (Y-11)Santa Cruz Biotechnologysc805
HämozytometerHausser Scientific3100
Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo KitInkubator LagerHB1588D
Isothesie (Isofluran) LösungHenry Schein Animal Health1169567762
IVIS Lumina II In Vivo BildgebungssystemPerkin Elmer
Matrigel GFR Membran MatrixCorningC354230
Medline Chirurgisches Instrumententuch, Klarer Klebstoff, 24" x 18"Medex SupplyMED-DYNJSD2158
OmniPur BSA, Fraktion V [Rinderserumalbumin] HitzeschockisolierungMilliporeSigma2910-25GM
Penicillin-Streptomycin Sollution, 100X, 10.000 IE Penicillin, 10.000ug/ml StreptomycinFisher ScientificMT-30-002-CI
Pentobarbital SodiumSigma Aldrich57-33-0Bereiten Sie 1% in Kochsalzlösung
vor Peroxidase AffiniPure Ziege Anti-Maus IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories115-035-062
Peroxidase AffiniReine Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories111-035-045
Povidon-Jod-Lösung USP, 10 % (w/v), 1 % (w/v) Verfügbares Jod, für den LaborgebrauchRicca Chemical395516
pSicoRAddgene11579
Puromycin-Dihydrochlorid-Hydrat, 99 %, ACROSOrganics Fisher ScientificAC227420500
RencaATCCCRL-2947
RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X mit L-GlutaminCorning10040CV
Scientific 96-Well-Platten ohne Rand, flaches ProfilFisher ScientificAB-0700
SHARP Präzisions-Barrierespitzen, für P-200, 200 & Mikro; l, 960 (10 Racks à 96)Thomas Scientific1159M40
Versandband, Mehrzweck, 1,89" x 109,4 Yd., hellbraun, Packung mit 6 RollenOffice Depot220717
NahtEthiconJ385H
Tegaderm Transparenter Verband Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4"Moore Medical1634
Thermo-Chicken HeizkissenK & H Manufacturing1000
Tygon Clear Laboratory Tubing - 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 Fuß)TygonAACUN017
VHL-KOCRISPR/Cas9-vermittelter Knockout von VHL, dann lentiviral markiert mit flaggenmarkiertem EGFP & Glühwürmchen-Luziferase
VHL-WTLentiviral markiert mit HA-markiertem mStrawberry fluoreszierendem Protein & Glühwürmchen-Luziferase
World Precision Instrument Pinzette IRIS 10CM CVD SERRFisher Scientific50-822-331
Wund-Autoclips-KitBraintree Scientific, Inc.ACS KIT
Xylole (histologisch), Fisher ChemicalFisher ScientificX3S-4
555899 vor

Referenzen

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