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Vergleich von metastasierenden klaren Zell Nierenzellkarzinom Modell in Maus Niere und auf Huhn Chorioallantoic Membran etabliert

DOI:

10.3791/60314

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February 8th, 2020

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1Department of Molecular and Medical Pharmacology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 2Department of Molecular, Cell, and Developmental Biology, University of California, Los Angeles, 3Department of Bioengineering, Hanyang University, 4Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of California, Los Angeles, 5Department of Microbiology, Immunology, and Molecular Genetics, University of California, Los Angeles, 6School of Life Sciences, Beijing Normal University, 7Department of Urology, West China Hospital, Sichuan University, 8Department of Urology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

In This Article

Summary

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Metastasierendes blutestes Nierenzellkarzinom ist eine Krankheit ohne umfassendes Tiermodell für eine gründliche präklinische Untersuchung. Dieses Protokoll veranschaulicht zwei neuartige Tiermodelle für die Krankheit: das orthototisch implantierte Mausmodell und das Hähnchen-Chorioallanto-Membranmodell, die beide Lungenmetastasen zeigen, die klinischen Fällen ähneln.

Abstract

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Metastasierendes klarzellrenales Zellkarzinom (ccRCC) ist der häufigste Subtyp von Nierenkrebs. Lokalisiertes ccRCC hat ein günstiges chirurgisches Ergebnis. Ein Drittel der ccRCC-Patienten wird jedoch Metastasen zur Lunge entwickeln, was mit einem sehr schlechten Ergebnis für die Patienten zusammenhängt. Leider gibt es für dieses tödliche Stadium keine Therapie, da der molekulare Mechanismus der Metastasierung unbekannt bleibt. Seit 25 Jahren ist bekannt, dass der Funktionsverlust des von Hippel-Lindau (VHL) Tumorsuppressorgens pathognomisch von ccRCC ist. Es wurde jedoch kein klinisch relevantes transgenes Mausmodell von ccRCC erzeugt. Ziel dieses Protokolls ist es, zwei neu eingerichtete Tiermodelle für metastasierende ccRCC einzuführen und zu vergleichen. Die erste ist die Nierenimplantation im Mausmodell. In unserem Labor wurde das CRISPR-Gen-Editing-System verwendet, um das VHL-Gen in mehreren RCC-Zelllinien auszuschalten. Orthotopische Implantation heterogener ccRCC-Populationen in die Nierenkapsel schuf neuartige ccRCC-Modelle, die robuste Lungenmetastasen bei immunkompetenten Mäusen entwickeln. Das zweite Modell ist das Chicken Chorioallantoic Membrane (CAM) System. Im Vergleich zum Mausmodell ist dieses Modell zeit-, arbeits- und kosteneffizienter. Dieses Modell unterstützte auch eine robuste Tumorbildung und Intravasation. Aufgrund der kurzen 10-tägigen Phase des Tumorwachstums in CAM wurde durch die Immunhistochemie (IHC) in den gesammelten Embryogeweben keine unverhakten Metastasen beobachtet. Als jedoch das Tumorwachstum beim geschlüpften Huhn um zwei Wochen verlängert wurde, wurden mikrometastatische ccRCC-Läsionen von IHC in der Lunge beobachtet. Diese beiden neuartigen präklinischen Modelle werden nützlich sein, um den molekularen Mechanismus hinter Metastasen weiter zu untersuchen und neue, patientenabgeleitete Xenografts (PDXs) zur Entwicklung neuartiger Behandlungen für metastasierendes ccRCC zu etablieren.

Introduction

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Nierenzellkarzinom (RCC) ist die7. häufigste Krebsart in den Vereinigten Staaten. Jährlich werden schätzungsweise 74.000 Amerikaner neu diagnostiziert, was mehr als 14.000 Todesfällen entspricht (der histologische Untertyp clear-cell, kurz ccRCC, ist der häufigste Subtyp, der etwa 80% der RCC-Fälle ausmacht. Patienten mit lokalisierter Malignität werden mit Nephrektomie behandelt und haben eine günstige 5-Jahres-Überlebensrate von 73%1. Jedoch, 25%-30% der Patienten entwickeln entfernte Metastasen zu lebenswichtigen Organen wie der Lunge, was zu einem schlechten mittleren Überleben von 13 Monaten und 5-Jahres-Überlebensrate von nur 1....

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Protocol

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Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt, das als UCLA Chancellor es Animal Research Committee (ARC) (ARC 2002-049-53 und ARC 2017-102-01A) bezeichnet wurde. Das Protokoll 2002-049-53 ist für die Implantation von ccRCC-Tumorzellen in die Nierenkapsel von Nude- oder BALB/c-Mäusen optimiert. Tumorimplantationsexperimente in befruchteten Hühnereiern vor dem Schlüpfen bedürfen keiner IACUC-Zulassung. Um die Zeit für die Etablierung der Lungenmetastasierung zu verlängern, dürfen die Embryonen mit CAM-Tumor schlüpfen und zu Hühnern heranwachsen. Das Protokoll 2017-102-01A deckt diese Tierversuche ab.

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Results

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Jedes Experiment wurde mindestens 3x durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Die Daten werden als Mittelwert dargestellt, Standardabweichung (SD). Die Signifikanz wurde durch einen paired, Student es T-Test bestimmt, wenn es zwei Gruppen gab, oder durch eine einseitige ANOVA, wenn es drei oder mehr Gruppen gab. Zur Ermittlung der Bedeutung wurde ein p-Wert-Cutoff von 0,05 verwendet.

Orthotopisch implantierte RENCA-Zellen wu.......

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Discussion

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Für viele Patienten mit epithelialen Malignitäten ist Metastasierung zu lebenswichtigen Organen die Hauptursache für die Sterblichkeit. Daher ist es wichtig, den zugrunde liegenden Mechanismus und einen neuen Therapieweg für metastasierende Erkrankungen zu finden. Leider fehlt es an relevanten metastasierenden ccRCC-Tiermodellen. Die Herausforderung ist zu einem großen Teil auf die Unfähigkeit zurückzuführen, ccRCC bei Mäusen trotz der Erzeugung zahlreicher transgener Nierenepithel-gezielten VHL-Knockout-Mausmodelle

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgements

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Diese Arbeit wurde durch das UCLA JCCC Seed Grant, UCLA 3R Grant, UCLA CTSI und UC TRDRP (LW) finanziert. Wir danken der Preclinical Imaging Facility des Crump Institute, der TPCL und der UCLA Department of Laboratory Animal Medicine (DLAM) für ihre Hilfe bei experimentellen Methoden. Die Flow-Zytometrie wurde im UCLA Johnson Comprehensive Cancer Center (JCCC) und im Center for AIDS Research Flow Cytometry Core Facility durchgeführt, die von den National Institutes of Health Awards P30 CA016042 und 5P30 AI028697 sowie vom JCCC, dem UCLA AIDS Institute, der David Geffen School of Medicine an der UCLA, dem UCLA Chancellor es Office und dem UCLA Vizekanzler unterstützt w....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,25 % Trypsin, 0,1 % EDTA in HBSS ohne Calcium-, Magnesium- und NatriumbicarbonatCorning25053CI
8050-N/18 Micro 8V Max Tool KitDremel8050-N/18
Anti-VHL-AntikörperAbcamab135576
BD Lo-Dose U-100 InsulinspritzenBD Biosciences14-826-79
BD Pharm LyseBD Biosciences
BDGeneral Use and PrecisionGlide InjektionsnadelnFisher Scientific14-826-5D
DAB Chromogen KitBiocare MedicalDB801R
D-Luciferin Firefly, KaliumsalzGoldbioLUCK-1G
DPBS ohne Calcium und MagnesiumGibcoLS14190250
DYKDDDDK Tag Monoklonaler Antikörper (FG4R)eBioscience14-6681-82
Ethanol 200 ProofZylinder Management43196-11Bereiten Sie 70 % in Wasser
Fötales Rinderserum, qualifiziert, USDA-zugelassen RegionenFisher Scientific10-437-028
Fisherbrand Präparierschere mit scharfer SpitzeFisher Scientific08-940
Fisherbrand Sterile WattebällchenFisher Scientific22-456-885
FisherbrandHochpräzise Pinzette/Pinzette mit gerader, konischer ultrafeiner SpitzeFisher Scientific12-000-122
FisherbrandPremium Mikrozentrifugenröhrchen: 1,5 mLFisher Scientific05-408-129
Formaldehyd Soln., 4%, gepuffert, pH 6,9 (ca. 10% Formalin Soln.), Für HistologieMilliporeSigma1.00496.5000
Hamilton kundenspezifische SpritzeHamilton8040825 µ L, Modell 702 SN, Stärke: 30, Spitzenform: 4, Winkel: 30, Nadellänge: 17 mm
HA-Sonde Antikörper (Y-11)Santa Cruz Biotechnologysc805
HämozytometerHausser Scientific3100
Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo KitInkubator LagerHB1588D
Isothesie (Isofluran) LösungHenry Schein Animal Health1169567762
IVIS Lumina II In Vivo BildgebungssystemPerkin Elmer
Matrigel GFR Membran MatrixCorningC354230
Medline Chirurgisches Instrumententuch, Klarer Klebstoff, 24" x 18"Medex SupplyMED-DYNJSD2158
OmniPur BSA, Fraktion V [Rinderserumalbumin] HitzeschockisolierungMilliporeSigma2910-25GM
Penicillin-Streptomycin Sollution, 100X, 10.000 IE Penicillin, 10.000ug/ml StreptomycinFisher ScientificMT-30-002-CI
Pentobarbital SodiumSigma Aldrich57-33-0Bereiten Sie 1% in Kochsalzlösung
vor Peroxidase AffiniPure Ziege Anti-Maus IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories115-035-062
Peroxidase AffiniReine Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories111-035-045
Povidon-Jod-Lösung USP, 10 % (w/v), 1 % (w/v) Verfügbares Jod, für den LaborgebrauchRicca Chemical395516
pSicoRAddgene11579
Puromycin-Dihydrochlorid-Hydrat, 99 %, ACROSOrganics Fisher ScientificAC227420500
RencaATCCCRL-2947
RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X mit L-GlutaminCorning10040CV
Scientific 96-Well-Platten ohne Rand, flaches ProfilFisher ScientificAB-0700
SHARP Präzisions-Barrierespitzen, für P-200, 200 & Mikro; l, 960 (10 Racks à 96)Thomas Scientific1159M40
Versandband, Mehrzweck, 1,89" x 109,4 Yd., hellbraun, Packung mit 6 RollenOffice Depot220717
NahtEthiconJ385H
Tegaderm Transparenter Verband Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4"Moore Medical1634
Thermo-Chicken HeizkissenK & H Manufacturing1000
Tygon Clear Laboratory Tubing - 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 Fuß)TygonAACUN017
VHL-KOCRISPR/Cas9-vermittelter Knockout von VHL, dann lentiviral markiert mit flaggenmarkiertem EGFP & Glühwürmchen-Luziferase
VHL-WTLentiviral markiert mit HA-markiertem mStrawberry fluoreszierendem Protein & Glühwürmchen-Luziferase
World Precision Instrument Pinzette IRIS 10CM CVD SERRFisher Scientific50-822-331
Wund-Autoclips-KitBraintree Scientific, Inc.ACS KIT
Xylole (histologisch), Fisher ChemicalFisher ScientificX3S-4
555899 vor

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cohen, H. T., McGovern, F. J. Renal-cell carcinoma. The New England Journal of Medicine. 353 (23), 2477-2490 (2005).
  2. Bianchi, M., et al. Distribution of metastatic sites in renal cell carcinoma: a population-based analysis. Annals of Oncology. 23

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