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Methodenartikel

Chronische, akute und reaktivierte HIV-Infektion in humanisierten immundefizienten Mausmodellen

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DOI:

10.3791/60315

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3. Dezember 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Human Virology, School of Medicine, University of Maryland, 2Grupo Inmunovirología, Facultad de Medicina, Universidad de Antioquia

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier werden drei experimentelle Ansätze beschrieben, um die Dynamik der HIV-Infektion bei humanisierten Mäusen zu untersuchen. Die erste erlaubt die Untersuchung chronischer Infektionsereignisse, während letztere die Untersuchung akuter Ereignisse nach primärer Infektion oder viraler Reaktivierung ermöglicht.

Zusammenfassung

Humanisierte NOD/SCID/IL-2-Rezeptor-Null-Mäuse rekapitulieren einige Merkmale der menschlichen Immunität, die in der grundlegenden und präklinischen Forschung an Infektionskrankheiten genutzt werden können. Hier sind drei Modelle von humanisierten immundefizienten Mäusen beschrieben, um die Dynamik einer HIV-Infektion zu untersuchen. Die erste basiert auf der intrahepatischen Injektion von CD34+ hämatopoetischen Stammzellen bei neugeborenen Mäusen, die die Rekonstitution mehrerer Blut- und Lymphgewebezellen ermöglicht, gefolgt von einer Infektion mit einem Referenz-HIV-Stamm. Dieses Modell ermöglicht die Überwachung von bis zu 36 Wochen nach der Infektion und wird daher als chronisches Modell bezeichnet. Das zweite und dritte Modell werden als die akuten und Reaktivierungsmodelle bezeichnet, bei denen periphere mononukleäre Blutzellen intraperitoneal in erwachsene Mäuse injiziert werden. Im akuten Modell werden Zellen eines gesunden Spenders über den intraperitonealen Weg transplantiert, gefolgt von einer Infektion mit einem Referenz-HIV-Stamm. Schließlich werden im Reaktivierungsmodell Zellen eines HIV-infizierten Spenders unter antiretroviraler Therapie über den intraperitonealen Weg transplantiert. In diesem Fall ermöglicht eine medikamentenfreie Umgebung in der Maus eine Virusreaktivierung und eine Erhöhung der Viruslast. Die hier bereitgestellten Protokolle beschreiben den konventionellen experimentellen Ansatz für humanisierte, immundefizienten Mausmodelle einer HIV-Infektion.

Einleitung

Das humanisierte Mausmodell NOD/SCID/interleukin (IL)-2-Rezeptor-Chain null (im Folgenden als huNS-Kettenullbezeichnet) wurde häufig zur Untersuchung der Pathogenese von Infektionen, Autoimmunität und Krebs sowie für präklinische Studien von Medikamenten und humanzellbasierten Therapien1,2verwendet. Diese Mäuse basieren auf einem nicht-fettleibigen Diabetiker (NOD) Hintergrund, mit der scid-Mutation und gezielten Mutation am IL-2-Rezeptor-Ketten-Lokus (gemeinsame Kette für IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 und IL-21), die eine schwere Beeinträchtigung in der Entwicklung von Maus-T-, B-, und natürlichen Killerzellen (NK) verursachen, die eine schwere Beeinträchtigung in der Entwicklung von Maus-T-, B- und natürlichen Killerzellen (NK)verursachen. So unterstützen sie die Engraftierung von menschlichem Gewebe, humanen CD34+ hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) und menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs)3,4,5. Darüber hinaus fördert die transgene Expression menschlicher hämatopoetischer Faktoren, wie Stammzellenfaktor (SCF), Granulozyt/Makrophagenkolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF), und IL-3 die Engraftmentierung menschlicher Myeloidpopulationen6,7,8.

Für HIV-Studien wurden mehrere huNS-Kette Null-Maus-Modelle beschrieben, die sich in der Maus Stamm, Art der verwendeten menschlichen Zellen, Art des Gewebes für die Engraftment und Herkunft der Zellen (d.h. gesund vs. HIV-infizierter Spender)9,10. Der ursprüngliche Stamm ist jedoch aufgrund der hohen Konzentration menschlicher Zellen und der Virusreplikation nach einer Infektion mit einem Referenz-HIV-Stamm11,12,13weit verbreitet. Ähnliche immundefiziöse Mausstämme mit transgener Expression menschlicher hämatopoetischer Faktoren (z. B. NOG-EXL oder NSG-SGM3) oder mit Implantaten menschlicher Leber- und Thymusgewebe (Knochenmark-Leber-Thymus [BLT]-Mäuse) sind nützlich für die Bewertung der Rolle von Myeloidpopulationen bei der Anti-HIV-Immunantwort, den Auswirkungen von HIV auf diese Gewebe und deren Beteiligung als Virusreservoir14,15. Darüber hinaus können einige Stämme mit transgener Expression von humanen Leukozyten-Antigen (HLA)-Molekülen sowie BLT-Mäusen zur Untersuchung der T-Zell-Reaktion auf HIV-Infektionen16,17verwendet werden.

Im Allgemeinen hängt die Humanisierung bei diesen Mäusen vom zellulären Ursprung, dem Verabreichungsweg (intraperitoneal, intrahepatisch, intravenös, intrakardial) und dem Mausalter zum Zeitpunkt der Transplantation18,19,20ab. In Bezug auf den Zellursprung können menschliche CD34+ HSC aus Nabelschnurblut, fetaler Leber oder mobilisiertem peripherem Blut bei neugeborenen oder jungen Mäusen injiziert werden3,21. Darüber hinaus können erwachseneNull-Mäuse durch Injektion von PBMC (hier als hu-PBL-NS-Kettenull-Mäuse bezeichnet) humanisiert werden, was die zeitliche Zirkulation dieser Zellen im Blut, sekundären Lymphorganen und entzündeten Geweben22,23,24ermöglicht.

Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Etablierung von huNS-Kette Null-Maus-Modellen für die Untersuchung von HIV-Infektionen beschrieben. Das erste ist das chronische Modell, bei dem menschliche CD34+ HSCs, die aus Nabelschnurblut von einem gesunden Spender stammen, bei neugeborenen Mäusen injiziert werden, gefolgt von einer Infektion mit einem Referenz-HIV-Stamm nach 14 Wochen Rekonstitution des menschlichen Immunsystems. Dieses Modell ermöglicht die Überwachung von Mäusen für bis zu 36 Wochen nach der Infektion. Das zweite Modell ist ein akutes Modell, bei dem PBMCs, die von einem gesunden Spender abgeleitet wurden, in erwachsene NS-Kettenull Mäuse injiziert werden, gefolgt von einer Infektion mit einem Referenz-HIV-Stamm nach 3 Wochen menschlicher T-Zell-Expansion in der Maus. Das dritte Modell schließlich ist das Reaktivierungsmodell, bei dem PBMCs, die von einem HIV-infizierten Spender im Rahmen einer unterdrückenden antiretroviralen Therapie (ART) abgeleitet wurden, in adulte NS-Kettenull Mäuse injiziert werden. In diesem Fall ermöglicht eine medikamentenfreie Umgebung eine virale Reaktivierung und eine Erhöhung der Viruslast. Die beiden letztgenannten Modelle ermöglichen eine Überwachung von bis zu 9 Wochen nach der Transplantation.

Insgesamt sind diese drei Modelle nützlich für virologische Studien, präklinische Studien neuartiger Medikamente und die Bewertung der Auswirkungen von HIV-Infektionen auf die globale Immunantwort. Es ist auch wichtig zu berücksichtigen, dass die Verwendung von HIV-infizierten humanisierten Mäusen vor jedem Experiment eine Überprüfung und Genehmigung durch den Institutional Biosafety Committee (IBC) sowie durch den Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) erfordert. Dadurch wird sichergestellt, dass die Studie alle internen und externen institutionellen Vorschriften für die Verwendung von gefährlichem biologischem Material und den humanen Umgang mit Versuchstieren befolgt.

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Protokoll

Bei dieser Arbeit wurden alle Tierpflege- und -verfahren nach Protokollen durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Maryland School of Medicine überprüft und genehmigt wurden (Protokollnummern 1018017, 1018018 und 0318009).

1. Humane CD34+ HSC-Transplantation von neugeborenen Mäusen

  1. Verwenden Sie immer Einweg-Personenschutzausrüstung (PPE), einschließlich steriler Peelings, Handschuhe, spezielle Schuhe, Schuhbezüge, Maske, Schutzbrille, Haar/Bart-Motorhaube und sterile Labormäntel.
  2. 1 x 106 gefrorener CD34+ HSCs (siehe Materialtabelle) in 10 ml RPMI 1640 Medien 10% FBS unter einem zertifizierten Biosicherheitsschrank wieder aussetzen und sterile Bedingungen aufrechterhalten.
  3. Verwenden Sie 10 l der Suspension zu zählen (um das Vorhandensein der erwarteten Anzahl von Zellen zu gewährleisten) und überprüfen Sie die Zelllebensfähigkeit durch Trypanblau-Ausschlussfärbung in einem Hämozytometer.
  4. Zentrifuge bei 400 x g für 15 min bei Raumtemperatur (RT). Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie ihn in kalten 1x PBS auf die erforderliche Konzentration (1,4 x 105 CD34+ HSCs in 50 l) ab. Halten Sie die Zellen auf Eis bis zur Injektion.
  5. Welpen (NS-Kettenull Welpen beider Geschlechter von 1 bis 4 Tagen) in eine sterile 100 mm2 Petrischale zusammen mit einer kleinen Menge Bettmaterial aus dem Züchterkäfig geben. Zusätzlich reiben Sie saubere Bettwäsche zwischen den Händen, um fremde Gerüche auf den Empfängerwelpen weiter zu maskieren.
    HINWEIS: Dies minimiert die imprägnierten Fremdgerüche auf die Welpen und verbessert so die Chancen von Müttern, ihre Welpen nach dem Eingriff wieder in Käfige aufzunehmen.
  6. Legen Sie die Petrischale in einen sauberen Transportkäfig und legen Sie den Käfig in einen sauberen Mausmikroisolatorkäfig, um Welpen vor der Umwelt zu schützen. Bedecken Sie den Transportkäfig mit einem Abdeck, um die Exposition von Tieren gegenüber externem Licht während des Transports zum Bestrahlungsraum zu vermeiden.
  7. Bestrahlen Welpen mit 100 cGy Ganzkörperbestrahlung (WBI) durch Exposition gegenüber einer 137 Cs Quelle. Reinigen Sie das Innere des Bestrahlungsators mit Desinfektionslösung, legen Sie Mäuse in den Bestrahlungskörper und schalten Sie den Plattenspieler so ein, dass alle Welpen homogen bestrahlt werden. Schließen Sie den Bestrahlungskörper und drücken Sie den Netzschalter, um den Bestrahlungsprozess zu initiieren. Warten Sie, bis die Bestrahlungszeit abgeschlossen ist, und entfernen Sie die Mäuse sofort.
    HINWEIS: Da die Bestrahlung bei den Mäusen keinen Stress erzeugt, ist keine vorherige Anästhesie erforderlich.
  8. 2–4 h nach dem Bestrahlungsverfahren, legen Sie Welpen in einem Biosicherheitsschrank in eine gekühlte sterile Petrischale, die mit steriler Gaze auf Eis bedeckt ist, bis sie anästhesiert werden (ca. 5–10 min). Eine ausreichende Anästhesie wird erreicht, wenn die Grobbewegungen aufhören.
  9. Laden Sie die Spritze mit einer beigefügten Nadel (29 G, 0,5") mit 50 l der Zellsuspension und 1,4 x 105 CD34+ HSCs unter dem zertifizierten Biosicherheitsschrank.
  10. Für die Transplantation durch Leberinjektion, halten Sie Welpen mit dem Daumen und Zeigefinger. Um die Mauszurückhaltung zu minimieren (30–45 s), lassen Sie einen Prüfer den Welpen halten und die Injektion verabreichen, und lassen Sie den zweiten Prüfer die Spritze mit der HSC-Suspension beladen. Reinigen Sie die Injektionsstelle mit 70% Alkohol und liefern Sie 50 l Zellen direkt in die Leber. Verwenden Sie einen flachen Nadelwinkel beim Injizieren, um ein vollständiges Durchstechen der Leber zu vermeiden. Als Kontrolle, injizieren Sie Mäuse mit 50 l von 1x PBS in die Leber.
  11. Legen Sie die Welpen auf eine vorgewärmte sterile Petrischale, die mit steriler Gaze für 1–5 min bedeckt ist, um eine Erholung zu ermöglichen. Die Schale mit einem Infrarot-Wärmepad für Nagetiere bei 20 °C vorwärmen, um sicherzustellen, dass die Welpen nicht übergewärmt werden.
  12. Unmittelbar vor der Rückgabe der Welpen an ihre Eltern, wenden Sie eine kleine Menge Menthol- und Eukalyptus-basierte Salbe, mit dem Daumen und Zeigefinger, auf die Schnis beider Eltern, um Kannibalismus oder Ablehnung der Welpen zu vermeiden.
  13. Überprüfen Sie Käfige jeden Tag, auf der Suche nach Anzeichen von Transplantat-versus-Host-Krankheit (GVHD) in den Welpen wie trockene Haut, keine Fütterung, Hautausschlag, und Alopezie. Euthanisieren Sie die Tiere, wenn eines dieser Anzeichen beobachtet wird.
  14. Entwöhnen Sie Mäuse im Alter von 3 Wochen, sie nach Geschlecht zu gruppieren. Setzen Sie nicht mehr als 5 Tiere pro Käfig. Verifizieren Sie die Engraftmentierung im peripheren Blut durch Durchflusszytometrie im Alter von 14 Wochen.
    HINWEIS: Die Erfolgsrate der Transplantation liegt zwischen 80% und 100%.

2. Menschliche PBMC-Engraftment von Juvenile-Mäusen

  1. Für die akuten und Reaktivierungsmodelle injizieren Sie 6-8 Wochen alte NS-Kettenull Mäuse intraperitoneal mit menschlichen PBMCs, die von einem gesunden Spender oder HIV-infizierten Patienten abgeleitet wurden, der unter ART war. In beiden Modellen, gehören Mäuse mit PBMCs von einem gesunden Spender ohne HIV-Infektion (Schein) als Kontrollen injiziert.
  2. Schicht 15 ml Vollblut in 5 ml sterilen Dichte Gradienten Medium in einem 50 ml konischen Rohr.
  3. Zentrifuge bei 400 x g für 30 min bei RT, ohne Bremsen, um zu vermeiden, dass sich das buffy Fell mit dem Dichtegradientenmedium vermischt.
  4. Sammeln Sie vorsichtig den Anteil der mononukleären Zellen (zwischen dichtegradienten medium und überstand) und übertragen Sie die buffy Schicht auf ein 15 ml Zentrifugenrohr mit 10 ml 1x PBS. Zentrifuge bei 300 x g für 10 min bei RT.
  5. Entsorgen Sie den Überstand und entfernen Sie die verbleibenden roten Blutkörperchen, indem Sie mit 5 ml ACK-Puffer, der den pelletierten Zellen zugesetzt wird, lysieren. 4 min bei RT inkubieren.
  6. Zentrifuge bei 300 x g für 10 min bei RT. Den Überstand entsorgen und in 10 ml 1x PBS oder RPMI 1640 medium wieder aufsetzen.
  7. Verwenden Sie 10 l der Zellsuspension, um die Zellen zu zählen und die Lebensfähigkeit durch Trypanblau-Ausschlussfärbung in einem Hämozytometer zu überprüfen. In der Regel werden 1–2 x 106 Zellen für jede 1 ml Blut erhalten, mit mehr als 95% Lebensfähigkeit.
  8. Zentrifuge bei 300 x g für 10 min bei RT. Entsorgen Sie den Überstand und passen Sie die Zellzahl an die erforderliche Konzentration an (in diesem Fall 3,5 x 106 Zellen in 200 l mit 1x PBS).
  9. Die Spritze mit einer beigefügten Nadel (28 G, 0,5") mit 3,5 x 106 PBMCs in 200 l 1x PBS unter einem zertifizierten Biosicherheitsschrank beladen.
  10. Entfernen Sie die Maus aus dem Käfig und halten Sie sie am Schwanz, so dass sie das Netz greifen kann, indem Sie sanfte Traktion nach hinten. Legen Sie dann den Zeige- und Daumenfinger auf die Schultern des Tieres, greifen Sie die lockere Haut des Halses und verwenden Sie den Mittelfinger, um ihren Rücken zu stabilisieren.
  11. Schieben Sie den Mauskopf zurück, so dass sein Rücken über dem Kopf ist. Dadurch kann die Eingeweide in der Bauchhöhle nach hinten verschoben werden und reduziert das Risiko, die inneren Organe während der Injektion zu durchkreuzen.
  12. Reinigen Sie die Injektionsstelle mit 70% Alkohol.
  13. Durchdringen Sie die in Schritt 2.9 verwendete Spritze durch die Bauchwand und aspirieren Sie vor der Injektion der Zellen, wenn Material angesaugt wird, entfernen Sie die Spritze und entsorgen Sie sie. Andernfalls injizieren Sie die Zellen langsam in die intraperitoneale Höhle, entfernen Sie die Spritze und entsorgen Sie sie. Injizieren Sie 1x PBS, um Mäuse zu kontrollieren.
  14. Bringen Sie das Tier in seinen Käfig zurück.
  15. Verifizieren Sie die Engraftmentierung im peripheren Blut durch Durchflusszytometrie nach 3 Wochen nach der Injektion.

3. Post-Engraftment-Pflege

  1. Identifizieren Sie Mäuse durch Ohrmarkierungen.
  2. Beobachten Sie die Mäuse, die in diesen Experimenten verwendet werden, nach jedem Eingriff bei klinischen Anzeichen von Not genau 2x pro Tag.
  3. Nach der Transplantation menschlicher Zellen, überwachen Sie Mäuse auf GVHD. Zur Überwachung der GVHD-Symptome bei neugeborenen, jugendlichen und erwachsenen Mäusen, bewerten Tiere auf das Auftreten von Hauterkrankungen (d. h. Farbe, Trockenheit, Hautausschlag, Alopezie), zusätzlich zur Körpergewichtsmessung. Bewerten Sie Tiere, die diese Anzeichen durch einen Tierarzt zeigen, um frühe Sterbehilfe in Betracht zu ziehen.

4. HIV-Infektionsverfahren und Scheininfektionsverfahren

HINWEIS: Bei den chronischen und akuten Modellen sind Mäuse in Woche 14 bzw. Woche 3 nach der Transplantation mit dem HIV-BaL-Referenzstamm infiziert. Injektionen mit HIV werden intraperitoneal in die unteren Bauchquadranten verabreicht.

  1. Führen Sie den Ladevorgang des Virus/PBS in Spritzen mit einer 28 G 0,5"-Nadel in BSL2-Schränken nach ABSL2-Verfahren durch. Die Gesamtmenge des injizierten Virus beträgt 15.000 mediane Gewebekultur-Infektiöse Dosis (TCID50) in 200 l sterilem RPMI 1640.
  2. Entfernen Sie die Maus aus dem Käfig und halten Sie sie am Schwanz, so dass sie das Netz greifen kann, indem Sie sanfte Traktion nach hinten. Legen Sie dann den Zeigefinger und den Daumen auf die Schultern des Tieres, greifen Sie die lockere Haut des Halses und verwenden Sie den Mittelfinger, um den Rücken zu stabilisieren.
  3. Schieben Sie den Mauskopf zurück, so dass sein Rücken über seinem Kopf ist. Dadurch kann die Eingeweide in der Bauchhöhle nach hinten verschoben werden und reduziert das Risiko, während der Injektion innere Organe zu durchkreuzen.
  4. Reinigen Sie die Mäuse mit einem vorbenetzten Alkoholpolster im unteren linken/rechten Quadranten des Bauches. Injizieren Sie 15.000 TCID50 des HIV-BaL-Virus, das in 200 l sterilem RPMI 1640 enthalten ist.
  5. Nach der Injektion, kehren Sie die Maus in ihren Hauskäfig zurück.

5. Blutentnahme durch retroorbitale Punktion

HINWEIS: Retroorbitale Blutungen ermöglichen eine schnelle Blutentnahme, wodurch die Gesamtentnahmezeit verkürzt und die Stabilität der menschlichen Lymphozytenmarker erhöht wird. Verwenden Sie EDTA-Röhrchen, um Mäuseblut zu sammeln.

  1. Im chronischen Modell, bei 14 Wochen nach der HSC-Injektion, sammeln Sie das Blut über retroorbitale Vene. Führen Sie dieses Verfahren in den Akut- und Reaktivierungsmodellen nach 3 Wochen nach der PBMC-Injektion durch.
  2. Anästhetisieren Sie die Tiere mit 250 l Isofluran-Inhalation vor der Blutentnahme in einer Biosicherheitshaube der Klasse B2, die extern kanalisiert wird.
  3. Geben Sie das Isoflurane in Wattepads unter einem Drahtgitter in einem klaren 1 L Glas in einem Außerhalb des Gebäudes entlüfteten Biosicherheitsschrank. Die Verwendung des Netzes sorgt dafür, dass die Tiere nicht mit dem isoflurangetränkten Pad in Berührung kommen, was zu Hautreizungen und einer möglichen Überbezäunung führen kann, da Isofluran auch durch die Haut absorbiert wird. Legen Sie auch ein weiches Papiertuch zwischen das Netz und das Tier, um Verletzungen der Gliedmaßen zu vermeiden.
  4. Sobald das Glas mit Isofluran gesättigt ist (ca. 1 min nach Zugabe), führen Sie das Tier ein und beobachten Sie die Atemfrequenz, die dann abnehmen wird. Prüfen Sie die klinische Indikation einer tiefen Anästhesieebene, die das Fehlen eines Rechtenreflexes (bei sanftem Kippen) und fehlende grobe Bewegungen umfasst. Beginnen Sie den Blutungsvorgang, sobald das Tier völlig entspannt ist und der Zehenkniffreflex fehlt.
    HINWEIS: Da Isoflurane verdunstet, mehr Medikament abgeben, wenn keine Anzeichen einer Anästhesie beobachtet werden.
  5. Für die retroorbitale Blutung drücken Sie die Maus externe JugularVene kaudal auf den Unterkiefer mit dem Daumen, und mit der gleichen Hand, sanft heben Sie das obere Augenlid mit dem Zeigefinger.
  6. Setzen Sie ein Hämatokritrohr in den medialen Canthus des Auges ein und lenken Sie es in ventrolaterale Richtung, bis das Blut zu fließen beginnt.
  7. Sammeln Sie mindestens 100 L Blut. Sobald das gewünschte Blutvolumen erreicht ist (ein Volumen von nicht mehr als 1% des Körpergewichts des Tieres), beenden Sie den äußeren Jugulardruck und entfernen Sie das Hämatokritrohr.
  8. Stellen Sie sicher, dass die Hämostase vollständig ist, indem Sie den direkten Druck auf das Auge mit einer sterilen Gaze für mindestens 30 s anwenden.
  9. Tetracaintropfen im Auge auftragen. Überwachen Sie das Tier, bis es sich vollständig von der Anästhesie erholt hat, und legen Sie es wieder in den Käfig.
    ANMERKUNG: Die 100 L des gesammelten Blutes werden zur Bewertung des Entransplantats von Human-CD45+ und anderen Blutkörperchen sowie zur Bewertung der Plasmaviruslast verwendet.

6. Screening der Transplantationspegel- und Durchflusszytometrie-Analyse

  1. Befolgen Sie ein herkömmliches Flusszytometrie-Färbeprotokoll für Vollblut, das die Inkubation von fluorchrom-markierten antihumanen Antikörpern umfasst (für vorgeschlagenes Strömungspanel, siehe Tabelle der Materialien), gefolgt von der Lyse roter Blutkörperchen und den Waschschritten13,15.
    HINWEIS: Für die Abschirmung des Entransplantatsisten ist ein antihumaner CD45-Antikörper enthalten. Zum Vergleich kann auch ein Anti-Maus-CD45-Antikörper verwendet werden. Umfassen Sie Kompensationskontrollen sowie eine menschliche Blutprobe, die mit der gleichen Antikörpermischung, ungefärbten Maus- und menschlichen Blutproben und nicht-humanisierter Kontrolle gefärbt ist, um die Kreuzreaktivität der Reagenzien zu testen. Nach der Färbung gibt es immer ein Hintergrundsignal; alle positiven Signale unterscheiden sich jedoch deutlich von negativen und kreuzreaktiven Steuerungen.
  2. Erfassen Sie in einem geeigneten Durchflusszytometer mindestens 10.000 Ereignisse am Lymphozytentor (FSC-A vs. SSC-A). Für die Analyse der Durchflusszytometrie bestimmen Sie nach doppeltem Ausschluss den Prozentsatz der menschlichen CD45+ Zellen sowie anderer zellgroßer Populationen, die von Interesse sind.

7. Bewertung der Plasma-Viruslast

  1. Bewerten Sie die Viruslast bei HIV-infizierten Tieren 1x pro Woche nach der Infektion.
  2. Nach der retroorbitalen Blutung (ca. 100 l) erhalten Sie Plasma, indem Sie den Überstand nach zentrifugieren des antikoagulierten Blutes bei 3.500 x g für 3 min in einer Mikrozentrifuge sammeln. Das Pellet wird für die Blutzell-Phänotypisierung verwendet.
  3. Verwenden Sie ein kommerzielles virales RNA-Extraktionskit (siehe Tabelle der Materialien), um RNA aus 40 l Plasma zu erhalten.
  4. Konvertieren Sie RNA in cDNA mit dem ersten Dehnungssynthesemix (siehe Tabelle der Materialien) und HIV-Knebelgrundierung SK431.
  5. Führen Sie quantitative Echtzeit-PCR mit HIV-Gag-Primern SK38/SK39 und fluoreszierenden grünen Farbstoffen (z. B. SYBR grün) durch, wie in früheren Studien13,25beschrieben.

8. Verabreichung der antiretroviralen Therapie

  1. Verabreichen Sie orale ART mindestens 3 Wochen nach der Infektion, wenn eine hohe Viruslast beobachtet wird, in den chronischen, akuten und Reaktivierungsmodellen.
  2. Berechnen Sie die Dosen von Tenofovirdisdisoproxilfumarat (TDF), Emtricitabin (FTC) und Raltegravir (RAL), nach Km-Werten von 37 bzw. 3 für Mensch und Maus, bzw.26. In der Regel betragen die humanäquivalenten Dosen von TDF, FTC und RAL 61,7 mg/kg/Tag, 40,7 mg/kg/Tag bzw. 164 mg/kg/Tag.
  3. Für die Verabreichung im Trinkwasser, zerkleinern Sie Drogentabletten und fügen Sie die entsprechende Menge in der Wasserflasche, um sicherzustellen, dass jede Maus im Käfig ihre tägliche Dosis erhält. Da das Wirkstoffpulver Sediment in der Flasche bilden kann, schütteln Sie regelmäßig die Wasserflasche, um eine homogene Suspension zu erreichen.
  4. Wechseln Sie die Wasserflasche jede Woche mit frisch gelösten Medikamenten.
  5. Sammeln Sie das Blut über retroorbitale Vene jede Woche oder alle 2 Wochen nach ART-Initiierung, um die Veränderungen der Viruslast und CD4:CD8-Verhältnis zu bewerten.

9. Maus-Euthanasie, Sammlung von sekundären Lymphorganen und Isolierung mononuklearer Zellen

  1. Euthanasie wird in den drei humanisierten Mausmodellen durchgeführt, periodisch entlang der Infektionszeit oder am Ende des Experiments.
  2. Führen Sie die Euthanasie von erwachsenen Mäusen durch CO2-Erstickung, gefolgt von der zervikalen Dislokation. Verwenden Sie zur Erstickung eine nicht vorgeladene Kammer, geben Sie CO2 aus einem Handelszylinder mit festem Druckregler aus und steuern Sie den Gasstrom innerhalb von 20%-30% des Kammervolumens/der Kammerminute, um den AVMA-Richtlinien von 2013 zu entsprechen.
  3. Halten Sie denCO2-Fluss für >60 s Überwachung Atemstillstand (die bis zu 5 min dauern kann), gefolgt von der Zervixdislokation, um Dieathanasie zu gewährleisten.
  4. Euthanisieren Neonate <7 Tage alt durch eine physikalische Methode (d.h. mit scharfer Schere).
  5. Visualisieren Sie axilläre, mediastinale und mesenterische Lymphknoten (die typischerweise beobachtet werden) und extrahieren Sie sie mit einer Pinzette und einer scharfen Schere. Extrahieren Sie auch die Milz, die sich in der oberen linken Seite der Peritonealhöhle befindet.
  6. Legen Sie das Lymphgewebe in 1,5 ml Zentrifugenröhren ab, die steriles RPMI 1640 Medium enthalten.
  7. Verarbeiten Sie das lymphoide Gewebe sofort in einem 70 mm Poren-großen Nylonzellsieb und sammeln die Zellen in einem 50 ml-Rohr. Das Gewebe nicht ansaugen.
  8. Waschen Sie die Zellen mit 5 ml RPMI 1640 Medium, ergänzt mit 1% FBS, um die Zellenfilterung zu erleichtern.
  9. Zentrifugieren Sie nach der Gewebedisaggregation die Zellsuspension bei 3.500 x g für 10 min in einer Mikrozentrifuge.
  10. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen mit 500 l 1x PBS wieder auf.
  11. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 1,5 ml Zentrifugenrohr, das 500 l steriles Dichtegradientenmedium enthält.
  12. Zentrifuge bei 3.500 x g für 3 min in einer Mikrozentrifuge, ohne Bremse, um zu verhindern, dass sich die buffy Schicht mit dem Dichtegradientenmedium vermischt
  13. Sammeln Sie vorsichtig den Anteil der mononukleären Zellen (zwischen dichtegradientenmedium und überstand) und übertragen Sie die buffy Schicht auf ein 1,5 ml Zentrifugenrohr, das 500 l 1x PBS enthält. Zentrifuge bei 3.000 x g für 3 min.
  14. Entfernen Sie die verbleibenden roten Blutkörperchen, indem Sie mit 500 l ACK-Puffer lysieren und 4 min bei RT inkubieren.
  15. Zentrifuge bei 3.000 x g für 3 min. Den Überstand entsorgen und in 1 ml 1x PBS oder Medium wieder aufsetzen.

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Ergebnisse

Wie oben beschrieben, werden die Mäuse nach 14 Wochen nach der HSC-Injektion (chronisches Modell) oder nach 3 Wochen nach der PBMC-Injektion (akute und Reaktivierungsmodelle) zum Screening des Niveaus der Enpfropz menschlicher Zellen durch Durchflusszytometrie ausgeblutet. Eine repräsentative Gating-Strategie für die Bewertung von 1) menschlichen CD45+ Zellen Rekonstitution und 2) Prozentsatz von CD4+ und CD8+ T-Zellen ist in Abbildung 1Adarg...

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Diskussion

Wichtige Fortschritte wurden bei der Entwicklung von immundefizienten Mausstämmen für die Humanisierung erzielt, mit einer Reihe von verschiedenen Optionen, die je nach Forschungsinteresse verwendet werden können1. Hier ist ein allgemeines Protokoll zur Humanisierung von NS-Kettenull Mäuse n und genetisch ähnliche Stämme in drei verschiedenen Modellen für die Untersuchung von HIV-Infektion verwendet werden. Im ersten experimentellen Ansatz werden bestrahlte neugeborene Mäuse mit menschl...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von den internen Fonds der Klinischen Abteilung IHV an JCZ unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,5 ml MikrozentrifugenröhrchenNeptune3735.S.X
1,5 ml MikrozentrifugenröhrchenNeptune3745.S.X
10 ml Serologische Pipettenstellar sceintificVL-4090-0010
15 ml konische RöhrchenStellar scientificT15-600
25 ml Serogische Pipettenstellar sceintificVL-4090-0025
5 ml Serologische Pipettenstellar sceintificVL-4090-0005
50 ml konische RöhrchenStellar scientificT50-600
ACK LysepufferQualität biologisch118-156-101
AlkoholvorbereitungspadsFisher scientific06-669-62Steriler
Anti-Human-CD3-Klon UCHT1Biolegend300439APC konjugierter
Anti-Human-CD4-Klon OKT4Biolegend317420AF488 konjugierter
Anti-Human-CD45-Klon 2D1Biolegend368522BV421 konjugierter
Anti-Human-CD8-Klon SK1Biolegend344710PerCP-Cy5.5 konjugierter
Biosafaty-Schrank Stufe 2Wenn möglich Verbindung mit einer exauste Chimeny beim Umgang mit Isofluran
BonnetFisher scientific17-100-900Einwegkappe für den Basisschutz
CavicideMetrex13-1000Oberflächendesinfektionsmittel
CD34+ ZellenLonza2C-101So viele Fläschchen von einem einzigen Spender verfügbar
ZentrifugeBeckman65-6KR
Klarer TiegelAmazon77977
WattepadFisher scientific22-415-468Sterile
Einweg-LaborkittelFisher scientific19-472-422
EDTA MikroröhrchenGreiner bio-one450480
GesichtsmaskeFisher scientific17-100-897
FACS LyselösungBD340202
FBS premium HIAtlanta BiologicalsS1115OH
FicollGE health one17-1440-02
DurchflusszytometerWir verwendeten FACS Aria II
DurchflusszytometrieröhrchenFalcon3520545 ml Polystyrol und Rundboden
HIV BaLHergestellt in unserer uQUANT Core Facility
Menschliche PBMCsHIV-positive und -negative
Freiwillige Infrarot WärmekissenVenet scientificDCT-25Temporäres therapeutisches Wärmekissen für Kleintiere
Isentress (Raltegravir)MerckNSC 0006-0227061Antiretrovirales Medikament zur Behandlung des humanen Immundefizienzvirus (HIV)-Integrase-Hemmers
IsofluranHenry ScheinNDC 11695-6776-2
Mark I BestrahlungsgerätAusrüstung der Universität Maryland
Mikropipetten
MikrozentrifugeEppendorf
Maus OhrmarkenNational Band & Tag company1005-1L1
Natelson BlutentnahmeröhrchenFisher scientific02-668-10
NOG-EXLTaconicHSCFTL-13395-F
NSG MäuseJackson5557Zeit schwangere Weibchen für CD34-Transplantation und Jungtiere für PBMCs-Transplantation
NSG-SGM3Jackson13062
Paraformaldehyd 16%Elektronenmikroskopie Wissenschaften15710
PBS 1X pH 7,4Gibco100-10-023
PetrischalenFisher scientific08-757-28
Quantistudio qPCR-GerätThermoQS3
ReagenzreservoireCostar4870
RPMI Medien 1640 1XGibco11875-093
Schuh umfasstFisher scientific17-100-911
Sterile EinmalhandschuheMicroflexSUF-524
SuperScript II Erststrangsynthese SuperMixInvitrogen10080-400cDNA-Synthese
Spritzen 28-G x 1/2BD329-461
Spritzen 29-G x 1/2BD324-702
Truvada (Emtricitabin und TenofovirGileadNDC 61958-0701-1Antiretrovirales Medikament zur Behandlung des humanen Immundefizienzvirus (HIV)-Nicleosid-Analog-Transkriptase-Hemmer
Trypanblau SigmaT8154Zellzahl und Lebensfähigkeit
Vick VaporubGesundheit der Schule43214Salbe auf der Basis von Menthol und Eukalyptus
Wasser molekularbiologischeQualitätbiologisch 351-029-131

Referenzen

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